We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.
Yarrowia lipolytica är en icke-patogen, dimorfa och strikt aeroba jästarter. På grund av dess utmärkande fysiologiska funktioner och metaboliska egenskaper, är denna okonventionella jäst inte bara en bra modell för att studera den grundläggande karaktären av svamp differentiering men är också en lovande mikrobiell plattform för biokemisk produktion och olika biotekniska tillämpningar, som kräver omfattande genetiska manipulationer. Dock genetiska manipulationer av Y. lipolytica har varit begränsad på grund av avsaknaden av en effektiv och stabil genetisk transformation system samt mycket höga hastigheter av icke-homolog rekombination som kan huvudsakligen hänföras till Ku70 genen. Här rapporterar vi en enkel och snabb protokoll för effektiv genetisk transformation och gendeletion i Y. lipolytica Po1g. Först, ett protokoll för effektiv omvandling av exogent DNA i Y. lipolytica Po1g bildades. Second, för att uppnå den förbättrade dubbel crossover homolog rekombination hastighet för ytterligare deletion av målgener ades Ku70 genen raderas genom transformering av en avbrottskassett som bär 1 kb homologiarmar. För det tredje, för att visa den förbättrade gendeletion effektivitet efter strykningen av Ku70 genen, raderade vi individuellt 11 mål gener som kodar alkoholdehydrogenas och alkoholoxidas med användning av samma förfaranden på Ku70 knockout plattform stam. Det observerades att hastigheten för exakt homolog rekombination ökade avsevärt från mindre än 0,5% för radering av Ku70-genen i Po1g till 33% -71% för den enda gendeletion av de 11 mål gener i Po1g Ku70 Δ. En replikativ plasmid som bär den hygromycin B-resistensmarkören och Cre / LoxP-systemet konstruerades, och selektionsmarkörgen i jästen knockout stammar var så småningom avlägsnas genom uttryck av Cre-rekombinas för att underlätta flera omgångar av targeted genetiska manipulationer. De resulterande enda gen deletionsmutanter har potentiella tillämpningar inom biobränsle och biokemisk produktion.
Till skillnad från Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, en okonventionell jäst kan växa i form av jäst eller mycel som svar på förändringar i miljöförhållanden 1,2. Således kan detta dimorphic jäst användas som en bra modell för att studera svamp differentiering, morfogenes och taxonomi 3,4,5. Det är allmänt betraktas som en säker (GRAS) jästarter, som ofta används för att tillverka en mängd olika livsmedelstillsatser som organiska syror, polyalkoholer, aromföreningar, emulgeringsmedel och ytaktiva 6,7,8,9. Det är en obligat aerob och en välkänd olje jäst kan naturligtvis ackumulera lipider vid höga halter, det vill säga upp till 70% av celltorrvikt 10. Det kan också utnyttja ett brett spektrum av kolkällor för tillväxt, inklusive olika typer av rester i avfallsresurser som näringsämnen 11,12,13. Alla dessa unika funktioner gör Y. lipolytica mycket attraktivt förolika biotekniska tillämpningar.
Även om hela genomsekvens av Y. lipolytica har publicerats 14,15, är genetisk manipulation av denna okonventionella jäst mer komplex än andra jästarter. För det första är transformation av denna jästarter mycket mindre effektiv på grund av frånvaron av en stabil och effektiv genetisk transformation systemet 16,17. För det andra är arbetskrävande genomisk integrering av linjära expressionskassetter som vanligen används för uttryck av gener av intresse som ingen naturlig episomala plasmid systemet har hittats i denna jäst 18. Tredje generation av genetiska knock-outs och knock-ins är begränsade eftersom genmålsökning effektivitet via exakt homolog rekombination i denna jäst är låg och de flesta integrationshändelser sker genom icke-homolog sammanfogning (NHEJ) 19.
I denna studie rapporterar vi ett optimerat transformationsprotokoll för Y. lipolytica </em> Po1g-stam, som är lätt, snabb, effektiv och reproducerbar. För att öka frekvensen av exakt homolog rekombination, raderade vi Ku70-genen, som kodar för ett nyckelenzym i den NHEJ-vägen. Genom att använda den optimerade transformationsprotokoll och omvandla en linjär knockout kassett som innehåller flankerande homologiregioner av 1 kb, den Ku70 genen hos Y. lipolytica Po1g har tagits bort. Robust av denna gen radering metodik sedan visat genom att rikta alkoholdehydrogenas och alkoholoxidas gener i Po1g Ku70 Δ stam. Det observerades att den Ku70 deletionsstam uppvisade en betydligt högre verkningsgrad av homolog rekombination förmedlad genmålsökning än den för vildtyp Po1g stam. Dessutom genomfördes ett replika Cre expression plasmid som bär den hygromycin B-resistensmarkören tillverkat för att utföra markör räddning. Markören rädda underlättar flera omgångar av riktad genmodifiering i the erhållna genen deletionsmutanter. Förutom gendeletion, kan våra protokoll för genetisk transformation och gendeletion beskrivs här tillämpas för att infoga gener till specifika loci, och att införa platsspecifika mutationer i Y. lipolytica genomet.
Vårt mål för denna studie är att möjliggöra snabb och effektiv generering av riktade gen knockouts i Y. lipolytica Po1g stam. Flera faktorer måste åtgärdas för att uppnå detta. För det första är en hög transformationseffektivitet krävs. Således, en effektiv och bekväm kemisk omvandling protokoll för Y. lipolytica Po1g stam beskrivs i denna studie. Användningen av PEG-4000 är en avgörande faktor för den lyckade omvandlingen av denna stam. Inga transformanter erhölls för…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar finansieringen stöd från National Environment Agency of Singapore (ETRP 1.201.102), konkurrens Research Program av National Research Foundation i Singapore (NRF-CRP5-2009-03), byrån för vetenskap, teknologi och forskning i Singapore ( 1324004108), Global R & D Project Program, ministeriet för kunskapsekonomin, Republiken Korea (N0000677), Reduction Agency Defense Threat (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) och Syntetisk biologi initiativ National University of Singapore ( DPRT / 943/09/14).
Reagent/Material | |||
Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
Tris | Promega | H5135 | |
EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
Lithium Acetate | Sigma | ||
Acetic acid | Sigma | ||
Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
Bacto Peptone | BD | 211677 | |
D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
Difco LB Broth | BD | 244620 | |
Difco LB Agar | BD | 244520 | |
Bacto Agar | BD | 214010 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
Water bath | Memmert | WNB 14 | |
Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
Gel imager | GE | Amersham Imager 600 |