Summary
Bu makale, yani terroir kavramının, içgörü kazanmak için üzüm berry transkript ve metabolitleri hedefsiz metabolomik, transkriptomik ve çok değişkenli istatistiksel analiz uygulamasını açıklar, dut kalite özellikleri çevrenin etkisi.
Abstract
Terroir özellikle habitatlar ve yönetim uygulamalarına göre bu tür asma (Vitis vinifera) gibi ürünlerin özelliklerini etkileyen çevresel faktörlerin kombinasyonu ifade eder. Bu makale belli terroir imzalar çok değişkenli istatistiksel analiz kullanılarak asma çeşidi corvina'nın berry metabolome ve transcriptome tespit edilebilir gösterir. yöntemi ilk uygun bir örnekleme planı gerektirir. Bu olgu sunumunda, Corvina çeşidinde belirli bir klon genetik farklılıkları en aza indirmek için seçildi ve numuneler üç farklı yetiştirme mevsimi boyunca üç farklı makro bölgeleri temsil eden yedi üzüm bağları toplanmıştır. Bir hedefsiz LC-MS metabolomik yaklaşımı MZmine yazılım ve parçalanma ağaç analizine dayalı bir metaboliti kimlik strateji kullanarak verimli veri işleme eşliğinde yüksek duyarlılığı nedeniyle tavsiye edilmektedir. Kapsamlı transcriptome analizi mikrodizileri kullanılarak elde edilebiliriçeren probları farklı terroirs bağlamında tüm farklı ifade genlerin aynı anda analizini sağlayan, ~ tüm tahmin asma genlerinin% 99 kapsayan. Son olarak, projeksiyon yöntemlerine dayalı çok değişkenli veri analizi metabolomik ve transkriptomiks verileri entegre ve bilgilendirici korelasyon tespit ayrıntılı olarak analiz edilecek izin, güçlü bağ bozumu-spesifik etkisini aşmak için kullanılabilir.
Introduction
Bitkilerin genomları, transcriptomes, proteomlarda ve metabolomes dayalı büyük ölçekli veri analizi gibi asma bitkileri ve çevreleri arasındaki etkileşimleri yansıtan şarap terroir özellikleri gibi karmaşık sistemlerin, davranış içine görülmemiş fikir verir. aynı asma klonlar farklı bağlarında yetiştirilen bile bir şarap terroir farklı olabilir çünkü klonal genomları aynıdır, çünkü genomik analiz edilmesi bir fayda sağlamaz. Bunun yerine gen ifadesinin ve şarap kalitesi özelliklerini belirlemek çilek, metabolik özellikler arasındaki ilişkilere bakmak gerekir. mikrodiziler üzerinde immobilize problara hibridizasyon gibi olduğu genel özelliklerini kullanmak kantitatif analiz kolaylaştıran her transkript, benzer kimyasal özelliklere gelen transcriptome yararları seviyesinde gen ekspresyonunun analizi. proteomik A aksine, genel analitik yöntemlernd metabolomik nedeniyle bireysel protein ve metabolitleri büyük fiziksel ve kimyasal çeşitliliğin daha zordur. metabolomik durumunda bireysel metabolitleri boyutu, polarite, bolluk ve volatilitenin çok farklı olduğundan bu çeşitlilik daha aşırı, bu yüzden tek bir ekstraksiyon işlemi ya da analitik yöntem bütünsel bir yaklaşım sunuyor.
uçucu olmayan metabolitler için uygun bir analitik platformlar arasında, yüksek performanslı sıvı kromatografisi dayananlar kütle spektrometrisi bağlanmış (HPLC-MS) çok daha hassas ultraviyole veya diyot dizi dedektörü ile HPLC (HPLC-UV, HPLC-DAD olarak alternatiflere göre ) ya da HPLC-MS ile nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopi ancak kantitatif analiz, matris etki ve iyon bastırma / iyileştirme 1-3 fenomenler etkilenebilir. (HPLC-E elektrosprey iyonizasyon kaynağı kullanılarak HPLC-MS ile Corvina üzüm meyveleri analiz sırasında bu tür etkilerin incelenmesiSI-MS), düşük tutma süreleri ile şekerler ve diğer moleküller güçlü bir şekilde belki de bu bölgede molekül çok sayıda yansıtan yetersiz olarak gösterdi, ve diğer moleküllerin bolluğu matrisi etkisiyle fazla veya etkilenmez, küçümsenmeyecek ki ancak matris etkisi için veri normalleşme genel sonuçları 4,5'ten üzerinde sınırlı bir etkisi var gibiydi. Burada tarif edilen yöntem, olgunlaşma sırasında üzüm meyveleri içinde yüksek seviyelerde birikmesine orta kutup Metabolitlerin analiz edilmesi için optimize edilir ve bu önemli ölçüde terroir etkilenmektedir. Birlikte renk, tat ve şarap sağlıkla ilgili özelliklerinin belirlenmesi antosiyaninler, flavoneller, Flavan-3-ol, prosiyanidinlerin, diğer flavonoidler, resveratrol, stilbenler, hidroksisinamik asitler ve hidroksibenzoik asitler içerir. HPLC-MS ile niceleme güvenilir olduğu gibi şeker ve alifatik organik asitler gibi diğer metabolitleri nedeniyle effec matrise göz ardı edilirT ve iyon-bastırma fenomeni 5. Bu yöntemle seçilen polarite aralığında, yaklaşım mümkün 6 gibi birçok farklı metabolitleri tespit amaçlamaktadır ki hedefsiz olduğunu.
Asma transkript binlerce eşzamanlı izlenmesine olanak tanır transkriptomik yöntemleri tam asma genom dizisinin 7,8 kullanılabilirliği ile kolaylaştırılır. yüksek verimli cDNA dizileme dayalı erken transkriptomik yöntemler kolektif RNA-Seq teknoloji olarak tanımlanan prosedürlerin bir koleksiyon haline gelecek nesil dizileme gelişiyle gelişmiştir. Bu yaklaşım hızla transkriptomik çalışmalar için tercih edilen bir yöntem haline gelmektedir. Ancak, transkript binlerce melezleme ile paralel olarak sayısal izin mikrodizide dayalı literatürün büyük bir gövde, dedikodu için birikmiş. RNA Seq bir ana teknoloji olmadan önce Nitekim, birçok özel ticari mikroarray platformları olmuştugeliştirilen izin asma transcriptome ayrıntılı olarak incelenecek olan. Platformların çok çeşitli arasında, sadece iki genom transcriptome analizi 9 izin verdi. En gelişmiş dizi böylece her bir deney maliyetlerini azaltarak, tek bir cihazda 12 adede kadar bağımsız örneklerin hibridizasyon izin verdi. 12 alt diziler her 29.549 asma transkript temsil eden 135,000 60-mer probları oluşmaktadır. Bu cihaz, çalışmaları 10-24 çok sayıda kullanılmaktadır. Bu iki platform şimdi kalkıyor ama yeni bir özel mikroarray son zamanlarda dizayn edilmiştir ve ek yeni keşfedilen asma genleri 25 temsil prob daha büyük bir sayı içeren gibi daha yeni bir gelişmeyi temsil etmektedir.
transkriptomiks ve metabolomikler analizi ile üretilen büyük satış veri setleri farklı bir formda arasındaki ilişkiyi belirlemek için çok değişkenli teknikler de dahil olmak üzere veri analizi için uygun istatistiksel yöntemleri gerektirirVerilerin s. En yaygın olarak kullanılan çok değişkenli teknikler projeksiyona dayalı olanlardır ve bunlar gibi temel bileşenler analizi (PCA), ya da, denetimsiz olabilir gibi gizli yapıların diskriminant analizi (O2PLS-DA) 26 çift yönlü dik izdüşümü olarak, denetimli. Bu makalede sunulan protokol örneklerinin gruplar arasındaki farklılıkları belirlemek için keşif veri analizi ve O2PLS-DA için PCA kullanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Uygun Malzemeler seçip bir Örnekleme Planı Construct
- uygun örnekleme planı geliştirerek deney başlayın. yani bir vaka ile ayrı ayrı her bir plan değerlendirmek hiçbir genel ve evrensel bir yaklaşım vardır. örnekleme planı örnekleme yerleri, zamanları ve hassas örnekleme prosedürü devletler emin olun. Bu vaka çalışmasında kullanılan örnekleme planı için Bkz: Şekil 1.
NOT: Bu vaka çalışmasında, tek bir klon (. Vitis vinifera cv Corvina, klon 48) üzüm meyveleri Verona ilinde üç farklı makro bölgeleri (Garda Gölü, Valpolicella ve Soave) yedi ticari bağlarından toplanmıştır. Her bağ temel özellikleri Tablo 1'de özetlenmiştir. Karpuzu Veraison (olgunlaşma başlangıcı), orta olgunlaşma ve olgun çilek karşılık gelen üç zaman noktalarında üç yetiştirme mevsimi (2006, 2007, ve 2008) sırasında toplanmıştır.- katılımların her (vin İçineyard / yıl / olgunlaşma aşaması), randomize yükseklikleri ve bitki üzerinde yerleri ile iki asma satırlar boyunca farklı pozisyonlarda, hasat 30 kümeleri.
- görünür hasar ve / veya enfeksiyon belirtileri olanlar kaçınarak, her kümeden rastgele üç meyveleri seçin.
- Tekrarlayın üç bağımsız havuzlar elde etmek için 1.1.1 ve 1.1.2 adımları.
- meyveleri Deseed ve sıvı azot içinde hemen perikarp dondurma.
- Otomatik değirmen değirmeni ile her havuzdan 10 dondurulmuş meyveleri ezmek ve iki eşit parçaya, transkriptomik analiz için tek ve metabolomik analiz için birine her toz örnek bölün.
- -80 ° C'de tozlar saklayın.
| AM | BA | BM | CS | FA | MN | PM | |
| Makro-zone | Soave | Garda Gölü | Valpolicella | Garda Gölü | Valpolicella | Valpolicella | Soave |
| Yüksekliği (m) | 250 | 120 | 450 | 100 | 130 | 250 | 130 |
| anaç | 41B | S04 | K5BB | 420A | 420A | K5BB | 41B |
| satır yönü | EW | NS | EW | EW | EW | NS | NS |
| Eğitim sistemi | Tepegöz Sistemi (Pergola) | Tepegöz Sistemi (Pergola) | Dikey Çekim Konumlandırma (Guyot) | Tepegöz Sistemi (Pergola) | ısıtılmasındanreklam Sistemi (Pergola) | Dikey Çekim Konumlandırma (Guyot) | Dikey Çekim Konumlandırma (Guyot) |
| toprak tipi | siltli kil | verimli toprak | kil | verimli toprak | Killi toprak | silt tın | Killi toprak |
| Dikim düzeni (m) | 3.20 x 1.00 | 4.50 x 0.80 | 4.00 x 1.25 | 3.50 x 1.20 | 3.50 x 0.75 | 2.80 x 1.00 | 1.80 x 0.80 |
| Toplam kireç% | 3.9 | 19.3 | 18.3 | 14.4 | 31 | 5.9 | 27.9 |
| Aktif kireç% | 0.5 | 2.6 | 9.4 | 6.3 | 11.3 | 3.1 | 8.3 |
| kum% | 15 | 47 | 66 | 42 | 29 | 13 | 36 |
| loam% | 43 | 36 | 21 | 37 | 39 | 67 | 36 |
| kil% | 42 | 17 | 13 | 21 | 32 | 20 | 28 |
| toprak pH | 8.3 | 7.9 | 7.8 | 8.2 | 8.2 | 7.8 | 7.9 |
| Organik madde (%) | 2.9 | 2.5 | 2.2 | 1.2 | 2.9 | 1.6 | 2.5 |
| Değiştirilebilir fosfor (mg / kg) | 26 | 73 | 73 | 68 | 48 | 47 | 64 |
| Değiştirilebilir Potasyum (mg / kg) | 190 | 376 | 620 230 | 168 | 154 | 126 | |
| Değiştirilebilir Magnezyum (mg / kg) | 272 | 468 | 848 | 623 | 294 | 293 | 183 |
| Değiştirilebilir Kalsiyum (mg / kg) | 6500 | 5380 | 7358 | 6346 | 4652 | 10055 | 2878 |
| Berry indirgeyici şekerler arasında 2006 | 211,25 ± 1.20 | 176,20 ± 0.42 | 187,40 ± 0,00 | 203,70 ± 1.13 | 212,55 ± 0,64 | 195,20 ± 0,00 | 211,65 ± 0,64 |
| Berry indirgeyici şekerler arasında 2007 | 190.00 ± 1.27 | 165,25 ± 0.49 | 153.00 ± 0.42 | 203,60 ± 0.71 | 210,90 ± 0.71 | 192,25 ± 0,64 | 188.70 ± 1.84 |
| Berry indirgeyici şekerler arasında 2008 | 191,35 ± 0,64 | 178,90 ± 0,57 | 170,05 ± 0.49 | 205,15 ± 1.48 | 188,70 ± 0,57 | 169,35 ± 0.49 | 108,05 ± 1.06 |
| Berry pH 2006 | 3.01 ± 0.01 | 2.96 ± 0.01 | 2.84 ± 0.00 | 2.9 ± 0.00 | 2.98 ± 0.00 | 3.02 ± 0.00 | 3.06 ± 0.01 |
| Berry pH 2007 | 2.97 ± 0.00 | 3.00 ± 0.00 | 2.74 ± 0.00 | 3.07 ± 0.01 | 2.98 ± 0.00 | 2.87 ± 0.01 | 3.09 ± 0.00 |
| Berry pH 2008 | 2.83 ± 0.00 | 3.04 ± 0.01 | 2.71 ± 0.00 | 2.98 ± 0.01 2.98 ± 0.00 | 2.82 ± 0.00 | 3.11 ± 0.00 | |
| Hasat tarihi | 2006 | 2007 | 2008 | ||||
| Veraison | 8-Ağustos | 18-Temmuz | 12-Ağustos | ||||
| Orta Olgunlaşma | 4-Sep | 8-Ağustos | 2-Sep | ||||
| Olgun | 18-Eylül | 29-Ağustos | 23-Eylül |
Tablo 1: Her bağ başlıca özellikleri venumune toplama tarihleri. m = metre, EW =, NS = Kuzey-Güney-Batı yiyin. 
Şekil 1:. Örnekleme prosedürü şematik üç şarap üretimi makro bölgeler Verona, Veneto bölgesi, İtalya'nın şehrin çevresinde yer almaktadır. Üç kez noktaları Bağcılıkta olgunlaşma başlangıcını temsil eden tanecik oluşumundan (V), orta olgunlaşma (MR) ve olgun meyveleri (R). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
2. Berry Powder özleri hazırlayın, Metabolitler Analiz ve Süreci Veri
- Analiz için Berry Toz Örnekleri hazırlayın.
- Üç hacim içinde oda sıcaklığında meyve örnekleri metabolik özleri hazırlama (ağırlık / hacim)% 0.1 ile asidifiye metanol (h / h) için15 dakika boyunca 40 kHz'de ultrasonik banyoda mikrofon asittir. LC-MS-sınıf su ve formik asit ve HPLC-grade metanol kullanın.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüjleyin özler.
- iyonu giderilmiş su, iki hacim (hac / hac) içinde Aşama 2.1.2 süpernatant seyreltilir ve 0.2 um'lik bir filtreden geçer.
- HPLC-ESI-MS ile Berry ayıklar analiz edin.
- tedarikçinin tavsiyelerine göre HPLC-ESI-MS sistemi kurmak.
NOT: Bu durumda çalışmada, kurulum bir iyon tuzağı kütle spektrometresi ve elektrosprey iyonizasyon kaynağı ile in-line bağlı bir otomatik numune alıcı ile donatılmış bir HPLC sistemi, oluşuyordu. - Bir C18 koruma kolonu (7.5 x 2.1 mm 2) ve ters faz C18 kolon (150 x 2.1 mm 2, partikül büyüklüğü 3 um) olan HPLC sistemi bağlayın.
- mobil faz olarak kullanılan çözücüleri hazırlayın. S gibi Çözücü A olarak su ve% 100 asetonitril içinde% 5 (v / v) asetonitril,% 0.5 (v / v) formik asit kullanılırvası B. Kullanım LC-MS dereceli asetonitril, su ve formik asit.
- 0.2 mi dak-1 30 ul örnek bir enjeksiyon hacmi kullanılarak sabit bir akış hızında çözücü maddeler A ve B doğrusal gradyanı ile HPLC ayırma çalıştırın.
- İlk numune enjeksiyonu,% 25 solvent B'ye% 20, 20 dakika içinde% 20 solvent B'ye% 10 ila 5 dakika içinde% 10 solvent B'ye% 0 ila gradyanı tesis eden% 100 çözücü A ile bir sütun denge 15 dakika içinde 5 dakika ve% 25 ila% 70 solvent B.
- nüsha halinde, her örnek analiz edin. Alet odaklı etkileri önlemek için numune analizi Rastgele. Her bir analiz arasında% 100 çözücü ile yeniden dengeleme için 20 dakika bekleyin.
- Alternatif negatif ve pozitif iyonizasyon modlarında kütle spektrumları kazanır. Bu vaka çalışmasında açıklanan sonuçlar için, Tablo 2'de olduğu gibi parametrelerini ayarlamak. Hassas makine ayarı belirli platforma bağlıdır.
NOT: Alternatif olarak, diğer takım kullanınBelirli platforma göre mümkün yöntemler.- Tüm durumlarda, herhangi bir ayırma platformu gibi, tutma süresi tekrarlanabilirliği elde etmek için, uygun bir yeniden dengeleme zaman kullanmak için emin olun. numune sayısı (on numunelerin üzerinde) yüksek olduğunda, her parti arasındaki kromatografik kolon temizleme programlarının (iki yıkama solventler arasında yavaş degradeler) ile, 9-10 örneklerin gruplar halinde onları analiz eder. Yeterli alıkoyma süresi tekrarlanabilirlik sahip her bir serinin ilk kromatografik analizi boş analiz olduğundan emin olmak için (yani, çözücünün analizi).
- Ayrıca parçalanma seçenekleri (iki iyon öncüleri, MS 3) ayarı parçalanmış negatif ve pozitif iyon modlarında kütle spektrumları kazanır. Üreticinin talimatlarına uygun olarak parçalanma ağacı analizi (MS / MS ve MS 3) ile metabolitleri açıklama.
Not: genellikle glikosile olduğundan, bu Ther bitki metabolitlerinin için uygundurefore ilk parçalanma (MS / MS) ücretsiz aglikon iyonu ve sonraki parçalanma (MS 3) ayrılan şeker yarımları kaldırmak eğilimindedir otantik standartlar kütüphaneye karşı aglikonu belirlemeye yardımcı olur. - Alternatif olarak 1 V'luk bir parçalanma genlikli m / z aralığı 50-1,500 MS / MS ve MS 3 spektrumları elde edilmesi, belirli bir platforma uygun olarak başka müsait yöntemleri kullanılır.
- Her m / z sinyali için, üreticinin talimatlarına göre özgün standartlar kütüphanesine MS / MS ve MS 3 parçalanma desen ve tutma süreleri karşılaştırmak.
NOT: platformların çoğu tip otantik standartların analizi yoluyla kütüphanenin bu tür oluşturmak için yazılım imkanları bulunmaktadır. Bu sinyallerin çok tanımlamalıdır ancak tüm sinyaller açıklamalı olacaktır. - Kalan anonim sinyaller için, edebiyat, Searc yayınlanan olanlarla MS / MS ve MS 3 parçalanma desen karşılaştırmakm / z değerleri (yani haneli "m / z 353" Böyle m / z açıklanan sahip moleküller olduğu yayınlar bakmak için) serbestçe kullanılabilir ortak bir arama motoru herhangi biri ile, ya da MassBank gibi çevrimiçi veritabanları (www hing .massbank.jp / tr / database.html) ve İnsan Metabolome Veritabanı (www.hmdb.ca/search/spectra?type=ms_search).
- tedarikçinin tavsiyelerine göre HPLC-ESI-MS sistemi kurmak.
| Kütle spektrometresi bileşenleri | işlev | parametreler |
| Elektrosprey İyonizasyon Kaynağı | nebulize edici Gaz | 50 psi, 350 ° C |
| Kurutma gazı | 10 L dk -1 | |
| Iyon tuzağı ve dedektör | taramak | Saniyede tam tarama modlu, 13.000 m / z aralığı 50-1,500 m / z |
| 400 m / z | ||
| Çarpışma gaz | Helyum | |
| Vakum basıncı | 1.4 x 10 -5 mbar | |
| kılcal kaynağı | 4000 V | |
| Uç plakası ofset | -500 V | |
| kevgir | -40 V | |
| Cap çıkış | -121 V | |
| 1 Ekim DC | -12 V | |
| 2 Ekim DC | -1.7 V | |
| mercek 1 | 5 V | |
| objektif 2 | 60 V | |
| Pozitif iyonizasyon modu için ICC | 20.000 | |
| negatif iyonlaşma modu için ICC | 7.000 |
Tablo 2: kütle spektrumları elde etmek için asıl parametre seti.
| operasyon | seçim | işlev | parametreler | değerler |
| pik deteksiyon | kütle tespiti | ağırlık merkezi | Gürültü seviyesi | 3.500 |
| kromatogram oluşturucu | En yüksek veri noktası | dk zaman aralığı | 0.15 | |
| dk yüksekliği | 4.000 | |||
| m / z toleransı | 0.3 | |||
| pik deteksiyon | tepe Dekonvolüsyonun | Yerel asgari arama | kromatografik eşiği | 70 |
| RT aralığında arama asgari (en az) | 00:50 | |||
| En az nispi yükseklik | % 15 | |||
| Asgari mutlak yükseklik | 4.000 | |||
| tepe tepe / kenar Min oranı | 2 | |||
| Süre aralığı (dk) | 0-10 | |||
| izotoplar | İzotopik zirveleri orfoz | - | m / z toleransı | 1.2 |
| RT tolerans | 00:50 | |||
| monoton şekil | Yok hayır | |||
| maksimum yük | 3 | |||
| Temsilci izotop | Yok hayır | |||
| hiza | hizalama katıl | - | m / z toleransı | 1.2 |
| m / z Ağırlık | 10 | |||
| Tutma süresi tolerans | 00:50 | |||
| RT Ağırlık | 5 | |||
| Aynı şarj durumunu gerektir Yok hayır | ||||
| aynı kimliği gerektir | Yok hayır | |||
| izotop desen karşılaştır | Yok hayır | |||
| Boşluk doldurma | tepe bulucu | - | yoğunluk toleransı | % 20 |
| m / z toleransı | 0.9 | |||
| Tutma süresi tolerans | 00:40 | |||
| RT düzeltme | Yok hayır | |||
| süzme | Tepe filtre çoğaltın | - | m / z toleransı | 1.2 |
| RT tolerans | 00:30 | |||
| Aynı kimlik gerektir | Yok hayır |
Tablo 3: Belirli değerleri Mzmine iş akışı olumsuz LC-MS üzüm dut veri dosyalarını işlemek için.
- LC-MS Veri işleyin.
- erişim veyaBirçok çiğ Kromatogramlarda ilgili bilgileri ayıklamak ve her algılanan metaboliti her numunede miktarı olduğu bir veri matrisi inşa edebilirsiniz veri işleme yazılım paketini indirin.
NOT: protokol aşağıdaki adımlar açık kaynak yazılım MZmine v2.14 (http://mzmine.sourceforge.net) için tasarlandı. Bu LC-MS verilerine ana odak ile, kütle spektrometresi veri işleme için bir açık kaynak kodlu bir yazılım. 27 - ekipman üreticisi tarafından sağlanan yazılımı kullanarak netCDF biçime LC-MS kromatogram verileri dönüştürmek. Burada açıklanan sonuçlar için, Bruker Daltonics Esquire v5.2 ve Veri Analizi v3.2 yazılımları kullanmak ve üreticinin talimatlarına göre adımları uygulayın.
NOT: Diğer dönüştürücüler kullanılabilir (çeşitli serbest ware dönüştürücüler mevcuttur). - Yazılımın içine .cdf dosyalarını içe aktarın.
- parametrik ile tepe noktası belirleme, hizalama, boşluk doldurma ve zirve filtreleme prosedürleri uygulamakers Tablo 3'te rapor etmiştir.
- İlk adım olarak, daha sonra Görselleştirme → TIC / XIC görüntüleyici gidin bir ithal .cdf dosyasını seçin. kromatogram en küçük tepe tabanı üzerine imleci koyun ve baz iyon minimum yoğunluk sinyali hakkında not alın. Sonra Tepe Algılama → Ham Veri Yöntemleri gidin.
- Kitle Algılama seçin ve her tarama için ayrı iyonları algılamak ve bir iyon listesi oluşturmak için sinyal seviyesini doldurun.
NOT: Önceki kitle tespiti yapmadan algoritması kontrol edin - kütle spektrometresi bağlıdır. Bizim durumumuzda, biz AğırlıkMerkezi seçin. - Kromatogram Builder seçin ve iyon listeden veri noktalarını bağlamak ve her kitle değeri için kromatogram oluşturmak için sinyal seviyesine sahip doldurun. Min zaman dilimi ve m / z toleransı ayarlamak için kütle spektrometresi kılavuzunda belirtilen parametreleri bakın.
- Sonraki Peak algılama → kromatogramı Deconvo → Tepe Listesi Yöntemleri gitmekdökülmesinden. Bireysel zirveleri her bir kromatogram ayrılmasına izin vermek için (bu durumda Yerel Minimum arayın) uygun bir algoritma seçin.
- El ile aşağıdaki parametreler için uygun değerleri bulmak için kromatogramlar kontrol edin. gürültü çıkarmak ve iki tepe ayırt asgari halk varlığını belirlemek için 2 (dk) RT Range Minimum Arama% 30 Kromatografik Eşik ayarlayın.
- 2.0 Asgari Bağıl Boy ayarlayın. El ile arka zirveye ve karşılık gelen sinyalin minimum mutlak yüksekliği belirlemek için kromatogram kontrol edin; (Örneğin, sunulan deneyde 10.000) Mutlak Yükseklik olarak bu değeri ayarlayın.
- üst ve bir tepe düşük veri noktası yoğunlukları arasındaki asgari oran devlet 1.1 Tepe Üstü / Edge Min Oranını ayarlamak gerçek bir zirve olarak kabul edilecek.
- El ile çeşitli zirveleri minimum süresi kullanılan Kromat olduğunu görmek için kromatogramlar incelemekographic koşullar (örneğin, 0.2 ve 2 dakika, bileşiğe, gösterilen deneylerde arasında), ve bunun sonucu olarak bir süre kabul edilebilir en yüksek uzunluğunun aralığını ayarlamak için tepe süre aralığını (min) bu değerleri kullanır.
- Sonra genellikle en yoğun olarak, bir zirve gruba Tepe Listesi Yöntemleri → izotoplar → İzotop Peaks Grouper izotopları gidin. Not: parametreler kütle spektrometresi çözünürlük ve saklama kez tekrarlanabilirlik bağlıdır.
- Son olarak, bir maç skoru kullanarak kendi m / z ve tutma süresine bağlı olarak doruklarına hizalamak için Tepe Listesi Yöntemleri → Uyum → Üyelik Aligner gidin.
- zirveleri hizalama sonra → Tepe Finder Dolum Tepe Listesi Yöntemleri → Gap tıklayarak herhangi bir veri boşlukları doldurmak. Son olarak, filtre Tepe Listesi Yöntemleri → Filtreleme → Tepe Filtre Duplicate tıklayarak veri noktalarını çoğaltmak.
- Bir .cs olarak ortaya çıkan veri kümesini dışav dosyası.
- El ile değiştirin. A. Txt uzantısı csv uzantılı. Hiçbir dosya uzantıları görünür durumdaysa, dosya uzantılarını ortaya çıkarmak için bilgisayar ayarlarını değiştirin. Explorer Seçenek → → Gelişmiş Ayarlar Dosya ve kutu 'Bilinen dosya türleri için uzantıları gizle' işaretini gidin.
- Bir elektronik tabloya .txt dosyalarını içe aktarın. Bu, bir kimlik numarası, m / z değeri ve tutma süresi tarafından tanınan tüm tespit metabolitler, pik alanı değerleri olarak tüm örneklerde miktarı olan bir veri matrisi üretir.
- erişim veyaBirçok çiğ Kromatogramlarda ilgili bilgileri ayıklamak ve her algılanan metaboliti her numunede miktarı olduğu bir veri matrisi inşa edebilirsiniz veri işleme yazılım paketini indirin.
3. Transkriptom Analizi Berry Toz ayıklar hazırlayın ve Süreci Veri
- Berry Örneklerden Toplam RNA Özü ve RNA Kalite belirleyin.
- dut örneklerinden total RNA ayıklayın.
NOT: Bu vaka çalışmasında, özel bir kit ve diğerlerinin moleküllerinin tamamen kaldırılması sağlayan bir değiştirilmiş prosedürdePolisakkaritler ve polifenoller gibi RNA analizi ile fere kullanıldı. Aşağıdaki talimatlar bu kit 18 özgüdür.- Her numune için dolgu tozu, 400 mg ağırlığında iki kısma bölün ve iki mikrofüj tüplerinde 200 mg, her yerleştirin.
- en az 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde, hemen ve toz ve vorteks her 200 mg (kitte sağlanan), β-merkaptoetanol ihtiva eden liziz çözeltisi 900 ul ekle. 5 dakika 800 rpm'de çalkalanarak 56 ° C'de örnek ısıtın.
- hücre yıkıntıları pelet haline 10 dakika boyunca bir tezgah üstü mikrofüjde yüksek hızla örnekleri santrifüj.
- Pipetleyin 2 ml toplama tüpüne oturmuş kiti (mavi tutma halkası) sağlanan filtrasyon sütuna süpernatant 700 ul. Kalan artığın ayrılması için 1 dakika için bir tezgah üstü mikrofüjde yüksek hızda kap ve santrifüj kapatın. iki üç t sonuçlanan aynı filtrasyon sütun ama taze toplama tüpü kullanarak bu adımı yineleyinUBE açıklık lizat içeren her ~ 700 ul.
- Pipet 750 açıklık lizat Her tüpe (kitinde) bağlayıcı çözeltisi ul aşağı en az beş kere yukarı pipetleme ve hemen karıştırın. 2 ml'lik bir toplama tüpü içinde oturan kiti (kırmızı tutma halkası) sağlanan bağlama kolonuna Bu karışıma 700 ul aktarın. RNA bağlanma, 1 dakika boyunca bir tezgah üstü mikrofüjde yüksek hızda kap ve santrifüj kapatın.
- , Akış kısmını Durusu toplama tüp ters ve kalan sıvıyı boşaltmak için emici kağıt temiz bir pad üzerinde kısaca dokunun.
- toplama tüpüne sütun dönün ve aynı sütuna kalan karışımı pipetlemeyin ve santrifüj ve şişeden adımları tekrarlayın. Bütün karışım aynı kırmızı bağlayıcı sütuna süzülmüş kadar tekrarlayın.
- Şimdi kitinde kalan yönergeleri izleyin ve (kitinde) 50 ul elüsyon tamponu içinde RNA ve mağaza i Zehirkalite kontrol aşamaları için hazır -80 ° C t.
- Bir spektrofotometre kullanılarak, RNA miktarı ve saflık belirler. Proteinler (A 260/280) ve polifenoller / polisakaritler (A 260/230) ile kontaminasyon derecesini ortaya emme oranları kaydedin.
NOT: mikroarray hibridizasyon için uygun RNA her iki oran için en az 1.8 puan gerekir. - RNA bütünlüğünü belirlemek.
NOT: Çeşitli sistemler kullanılabilir. Bir floresan boya ile kombinasyon halinde bir kılcal elektroforez çalıştırmak yerine dijital edinen Bu durumda çalışmada kullanılmıştır. mikrodizi hibridizasyon için uygun bir RNA en az 8'lik bir RNA Bütünlük Numarası (RIN) olması gerekir.
- dut örneklerinden total RNA ayıklayın.
- Örnekler hazırlayın ve bir özel Mikrodizi için RNA melezleşme.
- iyonu giderilmiş RNaz içermeyen su ile adım 3.1.1.8 'de elde edilen bir RNA çözeltisi seyreltilerek 200 ng mikro-dizi analizi için toplam RNA'nın başlangıç miktarı ayarlayın. Ekle1.5 ul nihai hacimde 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne RNA, uygun miktarı.
- Her RNA örnek seyreltilmiş başak karışımı 2 ul ekleyin ve ilk iplik cDNA sentez cRNA içine bu yazıya ve siyanin 3CTP ile cRNA etiket üreticinin talimatlarını izleyin.
- üreticinin talimatlarına uygun olarak işaretlenmiş cRNA arındırmak ve 30 mL RNaz içermeyen su içinde elüt.
- Bir spektrofotometre ile üç değeri kaydederek her cRNA verimi ve spesifik aktivitesini belirlemek: cyanine 3 boya konsantrasyonu (ul -1 pmol), RNA saflık (A 260/280) ve cRNA konsantrasyonu (ng ul -1). cRNA verimi (mikrogram) ve spesifik aktivite (ug cRNA başına pmol Cy3) hesaplamak için üreticinin kullanım kılavuzunda bulunabilir formülleri kullanın.
NOT: Önerilen verimleri ve spesifik faaliyetler belirli mikroarray biçimi bazında farklılıklar göstermektedir. Bu vaka çalışmasında, 4 paket 44K biçimi olduseçilmiş, tavsiye edilen verim 1.65 ve spesifik aktivite 9 oldu. - prob tasarımı için uygun bir yazılım kullanarak özel mikroarray tasarlayın.
- Bu vaka çalışmasında açıklanan sonuçlar için, özel mikroarray tasarımlar ve oligonükleotid kütüphaneleri için web tabanlı bir uygulama kullanarak 4-pack 44K formatında tasarlanmış yeni bir özel mikrodizisi hazırlamak. Tasarım probları 29971 Pinot noir V1 diziden transkript tahmin de dahil olmak üzere, 34.651 hedef transkript maç, Corvina transcriptome yeniden yapılanma ve 180 özel Corvina genlerinin 25 Pinot çeşidinde tespit 4.500 yeni odaklar.
NOT: Bu 29.798 Pinot noir transkript, 4392 yeni Pinot lokusu ve 179 Corvina özel genleri tahmin oluşan 34.651 spesifik 60-mer prob üretimi çıkıyor.
- Bu vaka çalışmasında açıklanan sonuçlar için, özel mikroarray tasarımlar ve oligonükleotid kütüphaneleri için web tabanlı bir uygulama kullanarak 4-pack 44K formatında tasarlanmış yeni bir özel mikrodizisi hazırlamak. Tasarım probları 29971 Pinot noir V1 diziden transkript tahmin de dahil olmak üzere, 34.651 hedef transkript maç, Corvina transcriptome yeniden yapılanma ve 180 özel Corvina genlerinin 25 Pinot çeşidinde tespit 4.500 yeni odaklar.
- aşağıdaki gibi 4-pack biçimi özelliklerine dayalı melezleme hazırlayınız.
- 41,8 nihai hacim içinde Cy3 etiketli cRNA 1.65 ug yerleştiriniyonu giderilmiş RNaz içermeyen su ul. 11 10x Engelleme Ajan ul 2.2 ul 25x parçalanma Buffer ekleyin. RNA fragmanı termostatik banyoda 30 dakika boyunca 60 ° C'de inkübe edin. 1dk boyunca buz üzerinde hemen serin.
- Son olarak, 2 x hibridizasyon tampon maddesi 55 ul oda sıcaklığında 15.500 xg'de 1 dakika için pipetleme ve spin ile iyice karıştırın. Zamanında buz üzerinde ependorf tüp yerleştirin. saklamak değil, hemen kullanın.
- aşağıdaki gibi özel mikroarray yükleyin.
- bir melezleşme odasının tabanına etiketi yukarı gelecek şekilde bir conta slayt yükleyin. Yavaş yavaş hava kabarcığı oluşumunu önleyen pipet ucu ile sıvı dağıtıcı, her bir contanın üzerine adım 3.2.6.2 'de elde edilen hibridizasyon numunesi 100 ul yükleyin.
- Yavaşça özel mikroarray sayısal barkod yukarı bakacak şekilde, aşağı bakacak yerleştirin. Sandviç çifti düzgün takıldığından emin olun. Sonunda sandviç üzerine melezleme odasının kapağını yerleştirinslaytlar ve odasının üzerine kelepçe elle sıkın. baloncuklar hareketliliğini değerlendirmek için monte edilmiş bölme döndürün.
- Fırın 65 ° C'ye ayarlanmış bir hibridizasyon bir dairesel asamblajı kayıcı odasına koyun. 10 rpm'de döndürmek için rotator ayarlayın. Hibridizasyon 17 saat devam etmesine izin verir.
- aşağıdaki gibi mikroarray slayt yıkama ile devam edin.
- İlk olarak, üç slayt boyama yemekleri hazırlamak ve uygun yıkama tamponlar ile doldurun: oda sıcaklığında Yıkama Tamponu 1 ile 2 yemekleri ve önceden ısıtılmış (37 ° C) Yıkama Tamponu 2 1 tabak.
- melezleme odasına sökün ve sandviç çıkarın. yukarı bakacak şekilde mikroarray slayt sayısal barkodlu, oda sıcaklığında Yıkama Tamponu 1 ile dolu ilk slayt boyama çanak içine sandviç batığın ve temiz forseps yardımıyla, mikroarray slayt contayı ayırın. Hızlı bir slayt rafa mikroarray slayt aktarmak ve Yıkama Tamponu 1 ile doldurulmuş ikinci slayt boyama çanak yerleştirinOda sıcaklığında karıştırıldı.
- Bir manyetik karıştırıcı üzerine slayt boyama çanak koymak ve ılımlı karıştırma ile 1 dakika yıkayın. Hızlı bir şekilde önceden ısıtılmış (37 ° C) Yıkama Tamponu 2 ile dolu bir üçüncü slayt boyama kabına sürgülü raf transferi ve ılımlı karıştırma ile 1 dakika yıkayın.
- Yavaşça slayt boyama çanak raf kaldırmak ve dikkatle damlacıklar kaçınarak, raftan slayt kaldırmak.
NOT: yıkama tamponlar Triton X-102 eklemek ve asetonitril yıkama adımı ihmal etmeyin.
- Oda sıcaklığında karanlıkta yıkandı çip saklayın.
- Mikroarray Tarama ve belirgin özelliklerinden ayıklayın.
- Uygun bir tarayıcı içine mikroarray slayt yerleştirin ve mikroarray üreticisinin kılavuzunda önerilen parametre ayarlarını kullanarak her dizi tarayın. Burada açıklanan sonuçlar için, tarama işlemini kolaylaştırmak için bir slayt sahibi her bir mikroarray slayt yerleştirin.
- Çıktı almak .shpSayısal floresan değerleri bir dijital sinyal dönüştürme yapabiliyor uygun bir yazılımı dosya. melezleme işlemi başarılı olduğundan emin olmak için kalite kontrol raporunu kontrol edin.
- Burada açıklanan sonuçlar için, özellik çıkarma yazılımı kullanma kılavuzunda önerilen parametre ayarlarını kullanmak ve Tablo 4'te listelenen parametreler imalatçı tarafından verilen normal aralık içinde olduğundan emin olmak için kalite kontrol raporunu inceleyin.
| metrik Ad | Üst sınır | alt Sınırı | Açıklama |
| AnyColorPrcntFeatNonUnif | 1.00 | NA | özellikleri yüzdesi ya kanalda özelliği olmayan tekdüzelik aykırı olduğunu |
| DetectionLimit | 2.00 | 0.10 | Ortalama artı 1 lineer konsantrasyon aralığının altında başak ins standart sapması |
| absGE1E1aSlope | 1.20 | 0.90 | E1 prob Konsantrasyon vs Signal uyum eğimin mutlak |
| MedCVProcSignal | 8.00 | NA | İşlenmiş Signal Medyan% CV |
| gNegCtrlAveBGSubSig | 5.00 | -10,00 | arka plan Ortalama (BGSubSignal sinyali ortalama özelliğinden BGUsed denilen bir değer çıkarılması ile hesaplanır) tüm İç mostra negatif kontrollerin sinyali çıkarılır |
| gNegCtrlAveNetSig | 40.00 | NA | Tüm İç mostra negatif kontroller net sinyali ortalaması |
| gNegCtrlSDevBGSubSig | 10.00 | NA | standart sapmasıBilinen Hususlar mostra negatif kontrol sinyallerini çıkarılır |
| gNonCntrlMedCVProcSignal | 8.00 | NA | olmayan kontrol probları İşlenmiş Signal medyan% CV |
| gSpatialDetrendRMSFilter | 15.00 | NA | Arka plan detrending uyum rezidüel |
Tablo 4: Temel parametreler mikrodizin melezleşme kalitesini doğrulamak için kontrol edilmelidir.
- Mikroarray Veri işleyin.
- Tüm mikroarray slaytlar tarandıktan ve kalite kontrolü olumlu değerlendirilmiştir edildikten sonra, her sonda ham floresan yoğunluklarına temsil her tek alt dizilim sonuç dosyasından gProcessedSignal değerleri seçerek bir sekme ayrılmış veri matrisi hazırlamak.
- Elektronik tabloda, her dizinin (P değerleri) ve Enerji kaynakları içinde 75 persentil verileri normalizeR oranını hesaplamak için tüm farklı alt diziler arasındaki tüm P değerlerinin ortalamasını yedik.
- Ardından, aynı tablo üzerinde, kendi alt dizinin R oranı her gProcessedSignal değerini normalleştirmek.
Metabolomik ve Transcriptomics Verilerinin Detaylı İstatistiksel Analiz Yürüten 4.
- İstatistiksel Analiz Yazılımı hazırlayın.
NOT: Bu vaka çalışmasında, PCA gerçekleştirmek mümkün bir yazılımda, PLS-DA ve O2PLS-DA kullanıldı.- metabolomik ve transkriptomik veri almak. MZmine yazılımı ile elde edilen veri matrisi almak için yeni Düzenli Projesi → → Yeni Düzenli Project File gidin. Düzen → bütün matris → Ev Sırasını ve uygun Birincil ve İkincil kimlik → Son'u atamak üzerine tıklatın.
- Demek verileri ortalamak ve Pareto ölçeği kullanarak ölçek. Ev penceresinde, Düzenle → M1 gidin ve uygun parametrede değişiklikVerileri bağlı ters. Burada açıklanan sonuçlar için, Par Birim Varyans gelen Ölçeği değiştirin.
- Birim Varyans ayarını kullanarak transkriptomik verilerini Ölçeğe.
- Çok Değişkenli İstatistiksel Analiz Carry Out.
- F ŞEKIL 2'de gösterildiği gibi PCA uygulamak. Bu durumda çalışmada, PCA numuneler arasındaki temel farklar, farklı olgunlaşma aşamalarını yansıtan ve mevsim büyüyen ortaya koymaktadır.
- Workset penceresinde, model türü olarak PCA-X seçin. Basın Otomatik Sığdır. onlar modelin kalitesi hakkında bir fikir vermek gibi R2X (cum) ve S2 (cum) dikkat edin değerleri.
NOT: Genel olarak, çok yüksek R2X (cum) ile daha iyi değerler daha yüksek bir model, ancak modeller verileri aşırı uygun olabilir. S2 (cum) değeri azaltmak için başladığında ampirik bir kural olarak, Temel Bileşenler ekleyerek durdurmak. - Ardından, örneklerin mümkün gruplama gösteren arsa görmek için Skorlar → Scatter seçin.
- PCA inceleyinPlot puan. iyi bir model elde edilirse (Q2cum> 0.5), bir O2PLS-DA modeli (adım 4.2.2) oluşturmak için numunelerin aynı sınıflarını kullanın.
- Workset penceresinde, model türü olarak PCA-X seçin. Basın Otomatik Sığdır. onlar modelin kalitesi hakkında bir fikir vermek gibi R2X (cum) ve S2 (cum) dikkat edin değerleri.
- Makro-zone göre sınıflandırılmış örnekler kullanılarak iki O2PLS-DA modelleri oluşturmak ve 200 permütasyon ile bir permütasyon testi kullanılarak modelleri doğrulamak.
- Yeni As → M1 → Gözlemler → Ev penceresine giderek sınıfları atayın. İstenilen sınıfları ayarlayın. Ardından, O2PLS-DA için PCA-X model türünü değiştirmek. Basın Otomatik Sığdır. PLS-DA modelinin bileşenlerin sayısı O2PLS-DA ile aynı olduğundan emin olun.
- O2PLS-DA modeli doğrulamak için, CV-ANOVA Analiz gidin ve sağ p-değeri görmek. Ayrıca, M2 → Ev penceresinde olduğu gibi Yeni üzerine tıklayın ve PLS-DA için O2PLS-DA model türünü değiştirmek. Basın Otomatik Sığdır.
- Permütasyon → Analiz ve 200 permütasyon (de-select yeniden hesapla Permütasyonlar opsiyon) gerçekleştirmek için gidin.
Not: nihai çıkış bir pencere gösteren R2 değeri shou içindeQ2 Y ekseni negatif kısmını isabet gerekirken ld genellikle 0,4 altında değerlerde Y ekseni çarptı. R2 ve / veya Q2 değerleri yanlışsa, bileşenlerin her ikisi de PLS-DA ve O2PLS-DA modellerinde sayısını azaltmak. - Proje penceresinde M2 seçin ve arsa ve örnek sınıfların konumunu görmek için Scatter → Puanlarına tıklayın geçin. Bir veya daha fazla özel sınıflar karakterize metabolitleri bittiğini gözlemlemek için, / Liste → Scatter Plot gidin.
- Gözlemler Seç Veri türünü değiştirmek ve mevcut olduğunda yüklemeler → sırasıyla 1 ve 2 ya da daha fazla, ya bileşenlerine pq (corr) ve Pred Zorunlu içine X-Ekseni ve Series Öğe Serisi ekleyin ve değiştirin.
- arsa üzerinde basılı farenin sağ tuşu ile, moleküllerin ve sınıflar arasındaki arsa sembolleri ayırt etmek Şartlar By Mülkiyet → Renk gidip seçin. İstenilen özelliklere sahip arsa değiştirmek için Eksen ve / veya Styles → Düzen → Format Plot gidin.
<metabolitler O2PLS-DA analizi, histogramlar gibi metabolitlerin spesifik metabolitlerinin veya sınıflar göreli seviyelerde mevcuttur farklılıklar sonuçlarına dayanarak li>.
- F ŞEKIL 2'de gösterildiği gibi PCA uygulamak. Bu durumda çalışmada, PCA numuneler arasındaki temel farklar, farklı olgunlaşma aşamalarını yansıtan ve mevsim büyüyen ortaya koymaktadır.
- Transkriptomik O2PLS-DA analizi sonuçlarına dayanarak, almak ve Gen Ontoloji (GO) 28 sınıflandırmalar için farklı şekilde modüle genleri atayın.
- elle metabolit düzeyleri ve gen ifadesi arasındaki ilişkileri belirlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makalede açıklanan vaka çalışması nispeten 189 örnekleri arasında sayısal moleküler iyonlar artı kendi izotopları, adüktleri ve bazı parçaları da dahil olmak üzere 552 sinyalleri (m / z özellikleri), (7 bağları x 3 olgunlaşma aşamaları x 3 büyüyen mevsim x içeren bir son veri matrisi vermiştir 3 biyolojik çoğaltır). veri noktaları için toplam sayısı, bu nedenle 104,328 idi. Parçalanma ağacı analizi metabolitleri ayrıca adüktleri, izotoplar ve fragmanlarına karşılık gelen, 282, m / z özelliklerinin açıklama ile sonuçlanmıştır. PCA tarafından tüm karekod Exploratory analiz olgunlaşma aşamasına göre numuneler kümelenmiş gösterdi (tanecik oluşumundan, orta olgunlaşma ve olgun) birinci ve ikinci temel bileşenlerinin (t1-t2, Şekil 2A) boyunca ve birlikte büyüyen mevsime göre üçüncü ana bileşen (T1-T3, Şekil 2B).
src = "/ files / ftp_upload / 54410 / 54410fig2.jpg" />
Şekil 2:. Bütün metabolomik karekod PCA Eğiticisiz PCA-X aşamaları üç farklı yetiştirme mevsimi (2006, 2007, ve 2008) sırasında toplanan asma örneklerinin kümelenme gösteren ve olgunlaşma puanı dağılım araziler (tanecik oluşumundan, orta olgunlaşma ve olgun meyveler ). İlk arsa (A) ikinci (B) ise, olgunlaşma aşamalarına göre kümelenmiş örnekleri onlar büyüme mevsimi göre kümelenmiş. Renkler Yeşil (Veraison) olarak olgunlaşma aşamalarını, pembe (orta olgunlaşması) ve mor (olgun meyveleri) vurgulayın. Halkaları (2006), kareler (2007) ve üçgenler (2008) .Component t1: S2: semboller büyüyen mevsim temsil 0.34; R2X: 0.331; Q2cum: 0,304; Bileşen t2: S2: 0.185; R2X: 0.155; Q2cum: 0.433; Bileşen t3: S2: 0.145; R2X: 0,0924; Q2cum: 0.515.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Denetimsiz PCA yaygın bağbozumu etkisi altında gizlidir belirli terroir özelliklerini ortaya çıkarmak mümkün olduğunu, bu yüzden bir denetimli O2PLS-DA yaklaşımı iki ayrı veri kümelerinin, yani çilek Veraison de tam olgunlaşmış meyveleri uygulandı. Bu durum, bu olgunlaşma aşamalarında bu bölgeleri temsil eden özel terroir imzaları belirlemek için, olgunlaşma iki önemli aşamalarında üç makro bölgeleri (Garda Gölü, Valpolicella ve Soave) temsil eden metabolik farklılıkların incelenmesini sağlar.
Şekil 3: Veraison ve olgun üzüm çilek O2PLS-DA. Garda Gölü toplanan asma örneklerinin kümeleme gösteren O2PLS-DA skoru saçılım grafikleri ( mavi), Soave (yeşil) ve Valpolicella (pembe) Veraison (A) ve meyveleri olgunlaşmış (B makro bölgeler). (A) 'da gözlemlenen kümelenme ve (B) sorumlu metabolitler, sırasıyla korelasyon yükleme araziler (C) ve (D)' de görebilir. üçgenler olarak temsil metabolitler, gruplari, flavan-3-ol / procyanidins ve sarı diğer flavonoidler için için, resveratrol ve stilbenlerden, antosiyaninler için pembe mavi hidroksisinamik ve hidroksibenzoik asitler için yeşil, mor. A: bileşen P1: S2: 0.278; R2X: 0,0529; Q2cum: 0.278; bileşeni P2: S2: 0.33; R2X: 0,0394; Q2cum: 0,608. B: bileşenli P1: S2: 0.353; R2X: 0,0639; Q2cum: 0.353; bileşeni P2: S2: 0.188; R2X: 0,0374; Q2cum. 0.541 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: üç makro bölgeleri arasında metabolik belirteçlerin Dağılımı:. Garda Gölü, Soave ve Valpolicella metabolit düzeyleri standart hata ortalama ± yansıtan (n = Garda ve Soave, Valpolicella makro bölgesi için 27 için 18), farklı glikozile ve üç farklı yetiştirme mevsimi (2006, 2007, ve 2008) olgunlaşmış Corvina meyveleri asile antosiyaninler, resveratrol / stilbenler ve flavonoidler. Farklı harfler bir t-testi (p <0.05) tarafından belirlenen anlamlı farklılık grupları temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Yedi ayrı bağlarının belirli imzalar özel kullanılarak tespit edildiİstatistiksel yaklaşım 10 ized. İki O2PLS-DA modelleri bir olgun meyveleri arasında üç makro bölgelerinde farklılıklar keşfetmek diğer Veraison üç makro bölgelerde yetiştirilen çilek arasındaki farklılıkları keşfetmek ve inşa edildi. modelleri çapraz valide sadece Garda Gölü örnekleri Veraison diğer örneklerden farklı oysa, üç makro dilimleri arasında olgun meyveleri açıklayan modelin geçerli olduğunu gösteren bir permütasyon testi (200 permütasyon) kullanılarak edildi (gösterilmemiştir).
Veraison ve vade sonunda üç makro bölgelerden örnekler metabolitlerin dağılımına göre nasıl ayrılacağını gösteren iki model, puan araziler, Şekil 3A ve 3B gösterilmiştir. Yani pq (Düzeltici), p (örneklerin sınıf) ve q (metabolitler) arasındaki korelasyon olarak ifade bu modelin yükleme araziler, Şekil gösterilmiştirs 3C ve 3D. Yükleme parsellerde, kırmızı kareler numunelerin sınıf (makro-bölgeler) temsil ve renkli üçgenler bireysel metabolitleri temsil etmektedir. metabolitler ve örnekler arasındaki mesafe ilişkilerini yansıtır. metabolitler renk kodlu kimyasal sınıfına göre vardır.
permütasyon testi ile gösterildiği gibi tanecik oluşumundan modelinin düşük istatistiksel geçerliliğini göz önüne alındığında, overfitting muzdarip muhtemeldir. Bu nedenle, aşağıdaki gözlemler olan modelin istatistiksel olarak geçerli olan olgun meyve örneklerinde, münhasıran bakın. Flavonoidler Soave ve Valpolicella makro bölgeleri doğru kaydırılır, oysa Şekil 3D'de gösterilen yükleme arsa içinde, stilbenler, Garda Gölü makro bölgesine doğru kaydırılır. Bireysel metabolitleri daha yakından bir bakış Gölü Gar daha yaygın peonidin ve türevleri ile, antosiyaninlerin asimetrik dağılımını ortaya koymaktadırda makro-bölge ve Valpolicella makro bölgede daha yaygın diğer antosiyaninler (Şekil 4). Basit antosiyanin-3-O-glikozitler asile ve coumarated türevleri Soave makro bölgede daha yaygın iken Valpolicella makro bölgede daha yaygındır.
Bu durumda çalışmanın transkriptomik bileşeni artık desteklenmeyen bir transkriptomik platformu kullanarak başlangıçta oldu. Sonuç olarak, biz hala kullanılabilir platform, alternatif bir prosedür kurmak; Yeni platform transkript, 4392 yeni tanımlanmış Pinot lokusu ve 179 Corvina özel genleri 25 tahmin 249 daha Pinot noir dahil olmak üzere eski bir daha probları içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, üzüm dut terroir kavramını yorumlamak için kullanılan metabolomik, transkriptomik ve istatistiksel analiz protokollerini açıklar. HPLC-ESI-MS ile metabolomik analiz aynı anda metabolitleri çok sayıda algılamak için yeterince duyarlı olmakla birlikte, göreceli kantitatif matris etkisi ve iyon bastırma / geliştirme etkilenir. Ancak, benzer bir yaklaşım zaten Corvina çilek olgunlaşmasını ve hasat sonrası soldurma tanımlamak için kullanılır olmuştur, ve matriks etkileri düzeltme sonuçları 5 üzerinde sınırlı bir etkisi vardı. Ayrıca, aynı örnekleri kullanarak hedefsiz metabolomik için NMR ve LC-MS karşılaştırmalı sağlamlığını belirlemek için son büyük ölçekli çok enstrüman arası laboratuar çalışması, farklı enstrümanlar ve teknolojileri tutarlı sonuçlar 6 vermiştir ortaya koymuştur. Burada tarif edilen vaka çalışması üç makro z yedi bağlarından üç olgunlaşma aşamalarında örneklerin toplanması ve analizi dahilÜç büyüyen mevsim boyunca olanları. Burada terroir imza PCA ve O2PLS-DA değişkenli istatistikleri kullanılarak makro-bölge düzeyinde incelenmiştir (Garda Gölü ve Soave, iki üzüm bağları ile temsil her ve Valpolicella, üç üzüm bağları ile temsil edilir) oldu. Bireysel üzüm bağları arasında farklılıklar daha ince ve daha sofistike ve hassas istatistiksel yaklaşımlar 10 gerektirir. Önerilen protokollerin çeşitli adımlar kritik ve başarılı üzüm kalitesi terroir etkileri hakkında biyolojik sorulara cevap vermek amacıyla dikkate alınması gerekmektedir.
Her şeyden önce, uygun örnekleme planı önemlidir: Belirli bir klon seçimi genetik farklılıkları ve örnekleme birden yıl süre çeşitli terroirs arasında gerçek ses farklılıkları vurgulamak için izin verir aza indirmek için. Diğer taraftan, önerilen araştırma bağcılık için özellikle uygun olan bir terroir içinde yapıldı, ve bu küçük olabilirÜzüm kalitesine teruar-farklılıklar rımızı azamiye. Böylece, belli ki, bir daha optimal bir bölgede yetişen aynı çeşidinde karşılaştırmak ama çok ilginç olurdu, bu üzüm bağları sadece mevcut değildir olabilir.
Teknik açıdan bakıldığında, HPLC ile bir yüksek tekrarlanabilir metaboliti ayırma, iyi bir veri matrisi elde etmek için kritik öneme sahiptir son veri kümesi tepe uyum içinde hataların sayısı ne kadar yüksekse, çeşitli analizlerde tutma süresi farklılıklar daha beri. Böylece, uygun bir yeniden dengeleme zamanı ayarlamak için aralarında kromatografik kolon temizliği döngüleri ile 9-10 örneklerin toplu içine örnekleri bölmek ve her bir serinin ilk örneği olarak boş örnekleri kullanmak için kritik öneme sahiptir. LC-MS cihazı odaklı olan numuneler arasındaki farklılıklar neden olabilir istikrarsızlık belirli bir dereceye, etkilenir. Bu yazıda gösterildiği gibi bu sorun kısmen, numune analizi randomizasyon ile çözülebilir. bir imYöntemin provement platformu durumuna bilgilendirebilir her parti uygun kalite kontrol örneklerinin kullanılmasıdır. Uygun bir standart bileşiğin karışımı (yani, m / z değerleri ve tutma süreleri bütün m / z ve tutunma süresi aralığı yayılan standart bileşikler) ve platform ile ilgili bilgi tüm numune tozun eşit miktarlarda karıştırılarak elde edilen yeni bir kontrol numunesi etkileri ve aynı zamanda sonunda-posteriori veri normalleşmesi için kullanılacak.
Metabolomik ve transkriptomik sonuçları karşılaştırmak için bir diğer önemli nokta, her iki analiz için tam olarak aynı malzeme (yani, aynı ezilmiş numune) kullanımı idi. Veri analizi, örneğin PCA yöntemlere göre, gen ekspresyonu ve metabolit birikimi açısından farklılıklar kolayca yorumlanabilecek OPLs-DA gibi uygun bir istatistikler yöntemi kullanmak için çok önemlidir. bu yaklaşımın önemli sınırlamalar biritranskriptomiks ve metabolomikler veri entegrasyonu için güçlü yöntemler yokluğu. Veri korelasyon, farklı tip yöntemlerin geliştirilmesi transkriptomik ve metabolomikler verileri arasında güçlü ve güvenilir bir korelasyon kurmak için gereklidir.
Bu makalede açıklanan teknikler açıkça dut metabolome üzerinde olgunlaşmasını ve vintage etkilerini ortaya, ama üç makro bölgeleri temsil eden özel kimyasal imzalar da yaygın bağbozumu etkisi altında olgun meyveleri tespit edilmiştir. İlginç bir şekilde, tanecik oluşumundan çilek analizi terroir kavramı ağırlıklı olarak olgunlaşmamış meyveleri zaten mevcut daha (örneğin, antosiyaninler ve stilbenler) olgunlaşma süresince biriken metabolitleri ile kendini gösteren, istatistiksel olarak geçerli bir model vermemiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mill Grinder | IKA | IKA A11 basic | |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 127 Solvent Module HPLC |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap. |
| Extraction solvents and HPLC buffers | Sigma | 34966 | Methanol LC-MS grade |
| Sigma | 94318 | Formic acid LC-MS grade | |
| Sigma | 34967 | Acetonitrile LC-MS grade | |
| Sigma | 39253 | Water LC-MS grade | |
| Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 μm) | Sartorius | 17764 | |
| Softwares for data collection (a) and processing (b) | Bruker Daltonics | - | Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b) |
| Spectrum Plant Total RNA kit | Sigma-Aldrich | STRN250-1KT | For total RNA extractino from grape pericarps |
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | 1000 | |
| BioAnalyzer 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| RNA 6000 Nano Reagents | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| RNA Chips | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 1 | Agilent Technologies | 5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 2 | Agilent Technologies | 5188-5326 | |
| LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color | Agilent Technologies | 5190-2305 | |
| Kit RNA Spike In - One-Color | Agilent Technologies | 5188-5282 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | For cRNA Purification |
| Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray | Agilent Technologies | G2514F-048771 | |
| eArray | Agilent Technologies | - | https://earray.chem.agilent.com/earray/ |
| Gasket slides | Agilent Technologies | G2534-60012 | Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization |
| Thermostatic bath | Julabo | - | |
| Hybridization Chamber | Agilent Technologies | G2534-60001 | |
| Microarray Hybridization Oven | Agilent Technologies | G2545A | |
| Hybridization Oven Rotator Rack | Agilent Technologies | G2530-60029 | |
| Rotator Rack Conversion Rod | Agilent Technologies | G2530-60030 | |
| Staining kit | Bio-Optica | 10-2000 | Slide-staining dish and Slide rack |
| Magnetic stirrer device | AREX Heating Magnetic Stirrer | F20540163 | |
| Thermostatic Oven | Thermo Scientific | Heraeus - 6030 | |
| Agilent Microarray Scanner | Agilent Technologies | G2565CA | |
| Scanner Carousel, 48-position | Agilent Technologies | G2505-60502 | |
| Slide Holders | Agilent Technologies | G2505-60525 | |
| Feature extraction software v11.5 | Agilent Technologies | - | inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA |
| SIMCA + V13 Software | Umetrics |
References
- Jessome, L. L., Volmer, D. A. Ion suppression: A major concern in mass spectrometry. Lc Gc N Am. 24 (5), 498-510 (2006).
- Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go? Trends Biotech. 29 (6), 267-275 (2011).
- Sumner, L. W., Mendes, P., Dixon, R. A. Plant metabolomics: large-scale phytochemistry in the functional genomics era. Phytochem. 62 (6), 817-836 (2003).
- Bottcher, C., von Roepenack-Lahaye, E., Willscher, E., Scheel, D., Clemens, S. Evaluation of matrix effects in metabolite profiling based on capillary liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Anal Chem. 79 (4), 1507-1513 (2007).
- Toffali, K., et al. Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis. Metabolomics. 7 (3), 424-436 (2011).
- Martin, J. C., et al. Can we trust untargeted metabolomics? Results of the metabo-ring initiative, a large-scale, multi-instrument inter-laboratory study. Metabolomics. 11 (4), 807-821 (2015).
- Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).
- Velasco, R., et al. A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety. Plos One. 2 (12), (2007).
- Tornielli, G. B., Zamboni, A., Zenoni, S., Delledonne, M., Pezzotti, M. Ch. 11. The Biochemestry of the Grape Berry. Gerós, H., Chaves, M., Delrot, S. 11, Bentham Science Publishers. (2012).
- Anesi, A., et al. Towards a scientific interpretation of the terroir concept: plasticity of the grape berry metabolome. BMC Plant Biol. 15, 1-17 (2015).
- Berdeja, M., et al. Water limitation and rootstock genotype interact to alter grape berry metabolism through transcriptome reprogramming. Hort Res. 2, 1-13 (2015).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses. BMC Plant Biol. 14, 1-16 (2014).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Reducing sampling bias in molecular studies of grapevine fruit ripening: transcriptomic assessment of the density sorting method. Theor Exp Plant Phys. 28 (1), 109-129 (2016).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Circadian oscillatory transcriptional programs in grapevine ripening fruits. BMC Plant Biol. 14, 1-15 (2014).
- Cavallini, E., et al. Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant. Plant & Cell Physiol. 55 (3), 517-534 (2014).
- Cramer, G. R., et al. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).
- Dal Santo, S., et al. The plasticity of the grapevine berry transcriptome. Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).
- Fasoli, M., et al. The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program. Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).
- Gambino, G., et al. Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis. J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).
- Ghan, R., et al. Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars. BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).
- Pastore, C., et al. Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine. BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).
- Pastore, C., et al. Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening. BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).
- Rinaldo, A. R., et al. A Grapevine Anthocyanin Acyltransferase, Transcriptionally Regulated by VvMYBA, Can Produce Most Acylated Anthocyanins Present in Grape Skins. Plant Physiol. 169 (3), 1897-1916 (2015).
- Royo, C., et al. Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco. J Exp Bot. , 259-273 (2015).
- Venturini, L., et al. De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity. BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).
- Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products. Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).
