Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Den Terroir Concept Tolket gjennom Grape Berry Metabolomics og transcriptomics

Published: October 5, 2016 doi: 10.3791/54410
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 3, 1, 1, 1, 1, 1
1Biotechnology Department, University of Verona, 2Lab. of Bioorganic Chemistry, Physics Department, University of Trento, 3S-IN Soluzioni Informatiche
* These authors contributed equally

Summary

Denne artikkelen beskriver anvendelsen av uønskede metabolomics, transcriptomics og multivariat statistisk analyse til drue bær utskrifter og metabolitter for å få innsikt i terroir-konseptet, dvs. virkningen av miljøet på bær kvalitetsegenskaper.

Abstract

Terroir refererer til kombinasjonen av miljøfaktorer som påvirker egenskapene til avlinger som grapevine (Vitis vinifera) i henhold til bestemte naturtyper og forvaltningspraksis. Denne artikkelen viser hvordan enkelte terroir signaturer kan påvises i bær metabolomet og transkriptom av grapevine sorten Corvina hjelp multivariat statistisk analyse. Metoden krever først en hensiktsmessig prøvetakingsplan. I dette tilfellet studien ble en spesiell klone av Corvina sorten valgt å minimalisere genetiske forskjeller, og prøvene ble samlet inn fra sju vinmarker som representerer tre ulike makrosonene ved tre ulike vekstsesonger. En vilkårlige LC-MS metabolomics tilnærming anbefales på grunn av sin høye følsomhet, ledsaget av effektiv databehandling ved hjelp MZmine programvare og en metabolitt identifikasjon strategi basert på fragmentering treet analyse. Omfattende transkriptomet analyse kan oppnås ved hjelp av mikromatriserinneholdende prober som dekker ~ 99% av alle forutsagte Grapevine gener, slik at den samtidige analyse av alle differensielt uttrykte gener i sammenheng med forskjellige terroirs. Endelig kan multivariat dataanalyse basert på projeksjonsmetoder benyttes for å overvinne den sterke årgang-spesifikk effekt, slik at metabolomikk og transcriptomics data som skal integreres, og analysert i detalj for å identifisere informative korrelasjoner.

Introduction

Storskala dataanalyse basert på genomene, transcriptomes, proteom og metabolomes av planter gir enestående innsikt i virkemåten av komplekse systemer, for eksempel terroir egenskapene av vin som reflekterer interaksjoner mellom Grapevine planter og deres omgivelser. Fordi terroir av en vin kan være tydelig selv når identiske grapevine kloner er dyrket i forskjellige vingårder, er genomikk analyse av liten nytte fordi klonale genomer er identiske. I stedet er det nødvendig å se på sammenhengen mellom genekspresjon og de metabolske egenskaper til de bær, som bestemmer kvalitetsegenskaper vin. Analyse av genekspresjon ved nivået for de transkriptom utbytte av de tilsvarende kjemiske egenskaper av alle transkripter, noe som letter kvantitativ analyse ved å utnytte universelle egenskaper som for eksempel hybridisering til immobiliserte prober på mikromatriser. I motsetning, universelle analytiske metoder i proteomikk ennd metabolomics er mer utfordrende på grunn av den enorme fysiske og kjemiske mangfold av individuelle proteiner og metabolitter. I tilfelle av metabolomics dette mangfoldet er enda mer ekstrem fordi enkelte metabolitter varierer enormt i størrelse, polaritet, overflod og volatilitet, slik at ingen enkelt utpakkingen eller analysemetoden tilbyr en helhetlig tilnærming.

Blant de analytiske plattformer som egner seg for ikke-flyktige metabolitter, de som er basert på høy ytelse væskekromatografi koblet til massespektrometri (HPLC-MS) er mye mer sensitiv enn alternativer som for eksempel HPLC med ultrafiolett eller diodegruppedetektorene (HPLC-UV, HPLC-DAD ) eller kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, men kvantitativ analyse ved hjelp av HPLC-MS kan påvirkes av fenomener som matrise effekt og ion undertrykkelse / forbedring 1-3. Etterforskningen av slike effekter under analysen av Corvina drue bær ved HPLC-MS ved hjelp av en elektro ionisering kilde (HPLC-ESI-MS) viste at sukkerarter og andre molekyler som har lavest retensjonstider var sterkt underreported, sannsynligvis også gjenspeiler det store antall molekyler i denne sonen, og at overflod av andre molekyler kan være underestimert, overvurdert eller upåvirket av matrisen virkning , men dataene normalisering for matrisen effekten syntes å ha begrenset effekt på den samlede resultatene 4,5. Fremgangsmåten beskrevet her er optimalisert for analyse av middels polaritet metabolitter som samler seg ved høye nivåer i drue bær under modning, og som er betydelig påvirket av terroir. De omfatter anthocyaniner, flavonols, flavan-3-OLS, procyanidins, andre flavonoider, resveratrol, stilbenes, hydroxycinnamic syrer og hydroksybenzosyre syrer, som til sammen bestemmer farge, smak og helsemessige egenskaper av viner. Andre metabolitter, slik som sukker og alifatiske organiske syrer, blir ignorert fordi kvantifisering ved HPLC-MS er upålitelig på grunn av matrisen effekt og ion undertrykkelse fenomener fem. Innenfor polaritet utvalg valgt av denne metoden, er den tilnærmingen vilkårlige i at det tar sikte på å oppdage så mange forskjellige metabolitter som mulig 6.

Transcriptomics metoder som tillater tusenvis av grapevine utskrifter som skal overvåkes samtidig er tilrettelagt av tilgjengeligheten av hele grapevine genomsekvens 7,8. Tidlig transcriptomics metoder basert på high-throughput cDNA sekvense har utviklet seg med bruk av neste generasjons sekvensering til en samling av prosedyrer kollektivt beskrevet som RNA-Seq teknologi. Denne tilnærmingen er raskt blitt den foretrukne metode for å transcriptomics studier. Men en stor mengde litteratur basert på microarray, som tillater tusenvis av vitnemål som skal kvantifiseres i parallell ved hybridisering, har samlet for grapevine. Faktisk, før RNA-Seq ble en mainstream teknologi, hadde mange dedikerte kommersielle microarray plattformer værtutviklet slik at grapevine transkriptomet å bli inspisert i stor detalj. Blant de aller rekke plattformer, bare to lov genome-wide transkriptomet analyse ni. Den mest utviklet matrisen tillot hybridisering av opp til 12 uavhengige utvalg på en enkelt enhet, og dermed redusere kostnadene ved hvert forsøk. De 12 subgrupper hver omfattet 135.000 60-mer sonder som representerer 29,549 grapevine transkripsjoner. Denne enheten har blitt brukt i et stort antall studier 10-24. Disse to plattformene er nå avviklet, men en ny tilpasset microarray har nylig blitt utviklet og representerer en nyere utvikling som den inneholder et enda større antall sonder som representerer flere nylig oppdagede grapevine gener 25.

De store-salg datasett produsert av transcriptomics og metabolomics analyser krever egnede statistiske metoder for dataanalyse, inkludert multivariate teknikker for å analysere sammenhenger mellom ulike skjemas av data. De mest brukte multivariate teknikker er de basert på projeksjon, og disse kan være uten tilsyn, for eksempel prinsipal komponent analyse (PCA), eller overvåket, for eksempel toveis ortogonal projeksjon til latente strukturer diskriminant analyse (O2PLS-DA) 26. Protokollen som presenteres i denne artikkelen benytter PCA for utforskende dataanalyse og O2PLS-DA til å identifisere forskjeller mellom grupper av prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Velg riktige materialer og Konstruer en prøvetakingsplan

  1. Begynn eksperimentet ved å utvikle en hensiktsmessig prøvetakingsplan. Det er ingen generell og universell tilnærming så evaluere hver ordning fra sak til sak. Sørg for at prøvetakingsplanen fastslår prøvetakingssteder, tider og nøyaktig prøvetaking. Se figur 1 for en prøvetakingsplan som brukes i denne undersøkelsen.
    MERK: I dette tilfellet studien ble drue bær fra en enkelt klon (. Vitis vinifera cv Corvina, klone 48) samlet inn fra sju kommersielle vingårder i tre forskjellige makro soner i provinsen Verona (Gardasjøen, Valpolicella og Soave). De viktigste funksjonene i hver vingård er oppsummert i tabell 1. Bær ble samlet inn under tre vekstsesonger (2006, 2007 og 2008) på tre tidspunkter, tilsvarende Veraison (utbruddet av modning), mid-modning og modne bær.
    1. For hver av de tiltredelser (vineyard / år / modning scenen), slakte 30 klynger fra ulike posisjoner langs to vintreet rader, med randomiserte høyder og steder på anlegget.
    2. Velg tre bær tilfeldig fra hver klynge, unngå de med synlige skader og / eller tegn på infeksjon.
    3. Gjenta trinn 1.1.1 og 1.1.2 for å få tre uavhengige bassenger.
    4. Deseed bærene og fryse skall umiddelbart i flytende nitrogen.
    5. Crush 10 frosne bær fra hver basseng med en automatisk mill jeksel, og dele hver pulverisert prøve i to like deler, en for transcriptomics analyse og en for metabolomics analyse.
    6. Oppbevar pulver ved -80 ° C.
ER BA BM CS FA MN PM
Makro-sone Soave Gardasjøen Valpolicella Gardasjøen Valpolicella Valpolicella Soave
Høyde (m) 250 120 450 100 130 250 130
rotstokk 41B S04 K5BB 420A 420A K5BB 41B
Row retning EW NS EW EW EW NS NS
trening system Overhead System (Pergola) Overhead System (Pergola) Vertikal Shoot Positioning (Guyot) Overhead System (Pergola) OverheAnnonsen System (Pergola) Vertikal Shoot Positioning (Guyot) Vertikal Shoot Positioning (Guyot)
jordtype siltig leire leir~~POS=TRUNC Leire leir~~POS=TRUNC Clay leirjord silt leirjord Clay leirjord
Planting layout (m) 3,20 x 1,00 4,50 x 0,80 4,00 x 1,25 3,50 x 1,20 3,50 x 0,75 2,80 x 1,00 1,80 x 0,80
Totalt lime% 3.9 19.3 18.3 14.4 31 5.9 27.9
Aktiv kalk% 0.5 2.6 9.4 6.3 11.3 3.1 8.3
sand% 15 47 66 42 29 1. 3 36
leirjord% 43 36 21 37 39 67 36
Clay% 42 17 1. 3 21 32 20 28
jord pH 8.3 7.9 7.8 8.2 8.2 7.8 7.9
Organiske stoff (%) 2.9 2,5 2.2 1.2 2.9 1.6 2,5
Utskiftbar fosfor (mg / kg) 26 73 73 68 48 47 64
Utskiftbar kalium (mg / kg) 190 376 620 230 168 154 126
Utskiftbar magnesium (mg / kg) 272 468 848 623 294 293 183
Utskiftbar kalsium (mg / kg) 6500 5380 7358 6346 4652 10055 2878
Berry reduserende sukker 2006 211,25 ± 1,20 176,20 ± 0,42 187,40 ± 0.00 203,70 ± 1.13 212,55 ± 0,64 195,20 ± 0.00 211,65 ± 0,64
Berry reduserende sukker 2007 190,00 ± 1.27 165,25 ± 0,49 153,00 ± 0,42 203,60 ± 0,71 210,90 ± 0,71 192,25 ± 0,64 188,70 ± 1,84
Berry reduserende sukker 2008 191,35 ± 0,64 178,90 ± 0,57 170,05 ± 0,49 205,15 ± 1,48 188,70 ± 0,57 169,35 ± 0,49 108,05 ± 1.06
Berry pH 2006 3,01 ± 0,01 2,96 ± 0,01 2,84 ± 0,00 2.9 ± 0.00 2,98 ± 0,00 3,02 ± 0,00 3,06 ± 0,01
Berry pH 2007 2,97 ± 0,00 3,00 ± 0,00 2,74 ± 0,00 3,07 ± 0,01 2,98 ± 0,00 2,87 ± 0,01 3,09 ± 0,00
Berry pH 2008 2,83 ± 0,00 3,04 ± 0,01 2,71 ± 0,00 2,98 ± 0,01 2,98 ± 0,00 2,82 ± 0,00 3,11 ± 0,00
høsting Dato 2006 2007 2008
Veraison 8-Aug 18-Jul 12-Aug
Mid Modning 4-Sep 8-Aug 2-Sep
Moden 18-Sep 29-Aug 23-Sep

Tabell 1: Hoved funksjonene til hver vingård ogprøvetaking datoer. m = meter, EW = Spis-West, NS = Nord-Sør.
Figur 1
Figur 1:. Skjematisk fremstilling av prøvetakingen De tre vinproduksjon makro-soner er lokalisert i nærheten av byen Verona, Veneto, Italia. De tre tidspunkter er Veraison (V) som representerer utbruddet av modning i vindyrking, mid-modning (MR) og modne bær (H). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. Forbered Berry Powder Ekstrakter, analysere metabolittene og behandle data

  1. Forbered Berry pulver prøver for analyse.
    1. Fremstille de metabolske ekstrakter av bær prøvene ved romtemperatur i tre volumer (w / v) metanol, surgjort med 0,1% (v / v) formic syre i et ultralydbad ved 40 kHz i 15 min. Bruk LC-MS-grad vann og maursyre, og HPLC-grad metanol.
    2. Sentrifuger ekstraktene ved 16 000 xg i 10 min ved 4 ° C.
    3. Fortynn supernatanten fra trinn 2.1.2 i to volumer (v / v) deionisert vann og passere gjennom et 0,2 mikrometer filter.
  2. Analyser Berry ekstrakter av HPLC-ESI-MS.
    1. Sett opp HPLC-ESI-MS system i henhold til leverandørens anbefalinger.
      MERK: I dette tilfellet studien oppsettet består av en HPLC-system utstyrt med en automatisk prøvetaker, koblet på linje med en ionefelle massespektrometer og electrospray ionisering kilde.
    2. Koble HPLC-systemet med en C18 guard-kolonne (7,5 x 2,1 mm 2) og en omvendt fase C18-kolonne (150 x 2,1 mm 2, partikkelstørrelse 3 um).
    3. Fremstille løsningsmidler anvendt som den mobile fase. Bruke 5% (v / v) acetonitril, 0,5% (v / v) maursyre i vann som oppløsningsmiddel A og 100% acetonitril som solvent B. Bruk LC-MS grad av acetonitril, vann og maursyre.
    4. Kjør HPLC-separasjon med en lineær gradient av oppløsningsmidler A og B ved en konstant strømningshastighet på 0,2 ml min-1 ved hjelp av en prøveinjeksjonsvolum på 30 pl.
      1. Til å begynne med ekvilibrere kolonnen med 100% oppløsningsmiddel A. Etter prøveinjeksjon, for å etablere en gradient fra 0% til 10% løsningsmiddel B i 5 min, fra 10% til 20% løsningsmiddel B i 20 min, fra 20% til 25% løsningsmiddel B i 5 min, og fra 25% til 70% løsningsmiddel B i 15 min.
      2. Analyser hver prøve i duplikat. Tilfeldig prøveanalyse å unngå instrument-drevet effekter. Tillat 20 min for re-ekvilibrering med 100% oppløsningsmiddel A mellom hver analyse.
    5. Acquire massespektra i alternative negative og positive ionisering moduser. For resultatene som er beskrevet i denne case study, definerer parametrene som i tabell 2. Den nøyaktige maskin innstillingen er avhengig av den spesifikke plattformen.
      MERK: Du kan også bruke andre draktstand metoder i henhold til bestemt plattform.
      1. I alle tilfeller, som med alle separasjon plattform, sørg for å bruke en passende ny likevekt tid, for å få oppholdstiden reproduserbarhet. Når antallet av samples er høy (over ti prøver), analysere dem i grupper på 9-10 prøver, med kromatografisk kolonne rengjøringsprogram (langsomme gradienter mellom de to elueringstrinnene oppløsningsmidlene) mellom hver sats. For å få nok oppholdstid reproduserbarhet, sørge for at den første kromatografisk analyse av hvert parti er en blank analyse (dvs. analyse av oppløsningsmidlet).
    6. Også erverve massespektra i fragmenterte negative og positive ion modus innstillings fragmentering alternativer (to ion forløpere, MS 3). Kommentere metabolittene ved fragmentering treet analyse (MS / MS og MS 3) i henhold til produsentens instruksjoner.
      MERK: Dette er spesielt egnet for plante metabolitter fordi de ofte er glykosylert, therefore den første fragmentering (MS / MS) har en tendens til å fjerne sukkerdelene som forlater den frie aglykon ion, og påfølgende fragmentering (MS 3) bidrar til å identifisere aglykon mot en autentisk standard-bibliotek.
    7. Acquire MS / MS og MS 3 spektra i m / z utvalg 50-1,500 med en fragmentering amplitude av en V. Alternativt kan du bruke andre egnede metoder i henhold til den spesifikke plattformen.
    8. For hver m / z signal, sammenligne MS / MS og MS 3 fragmentering mønstre og oppholdstider i den autentiske standard bibliotek i henhold til produsentens instruksjoner.
      MERK: Mange typer plattformer inkluderer programvare anlegg for å bygge denne type bibliotek gjennom analyse av autentiske standarder. Dette bør identifisere mange av signaler, men ikke alle signaler vil bli kommentert.
    9. For de resterende anonyme signaler, sammenligne MS / MS og MS 3 fragmentering mønstre med det som er publisert i litteraturen, searchengsle for m / z-verdier (dvs. sifret "m / z 353" for å se etter publikasjoner der molekyler med en slik m / z er nevnt) med noen av de vanligste søkemotor fritt tilgjengelige, eller bruke elektroniske databaser som MassBank (www .massbank.jp / no / database.html) og human metabolomet Database (www.hmdb.ca/search/spectra?type=ms_search).
Massespektrometer komponenter Funksjon parametere
Elektro ionisering Source forstøvningsanordningen Gas 50 psi, 350 ° C
tørking gass 10 L min -1
Ionefelle og detektor Scan Full scan modus, 13 000 m / z per sekund, rekkevidde 50-1,500 m / z
400 m / z
kollisjon Gas helium
vakuum press 1.4 x 10 -5 mbar
capillary kilde 4000 V
Endeplate offset -500 V
skimmer -40 V
Cap exit -121 V
1 oktober DC -12 V
2 oktober DC -1,7 V
Lens 1 5 V
Lens 2 60 V
ICC for positiv ionisering modus 20,000
ICC for negativ ionisering modus 7000

Tabell 2: Principal parametersettet for å skaffe massespektra.

Operasjon utvalg Funksjon parametere verdier
Peak Detection deteksjons~~POS=TRUNC Tyngdepunktet Støynivå 3500
kromatogram byggmester Høyeste datapunkt min tidsrom 0,15
min høyde 4000
m / z toleranse 0.3
Peak Detection Peak deconvolution Lokal minimum søk kromatografisk terskel 70
Søk minimum i RT range (min) 00:50
Minimum relative høyden 15%
Minimum absolutte høyde 4000
Min forholdet mellom peak topp / kant 2
Varighet range (min) 0-10
isotoper Isotoper topper grouper - m / z toleranse 1.2
RT toleranse 00:50
monoton form Nei
maksimal kostnad 3
representant isotop Nei
Alignment Bli aligner - m / z toleranse 1.2
Vekt for m / z 10
Oppholdstid toleranse 00:50
Vekt for RT 5
Krev samme ladetilstand Nei
Krever samme ID Nei
Sammenligne isotopen mønster Nei
Gap fylling Peak finder - intensitet toleranse 20%
m / z toleranse 0.9
Oppholdstid toleranse 00:40
RT korreksjon Nei
filtrering Duplicate Peak filter - m / z toleranse 1.2
RT toleranse 00:30
Krev samme identifikasjon Nei

Tabell 3: Mzmine arbeidsflyt med bestemte verdier til å behandle negative LC-MS drue bær datafiler.

  1. Behandle LC-MS data.
    1. tilgang ellerlaste ned en databehandlingsprogramvarepakke som kan trekke ut relevant informasjon fra mange rå kromatogrammene og bygge en data matrise der hvert oppdaget metabolitt er kvantifisert i hver prøve.
      MERK: protokoll trinnene nedenfor er skreddersydd for den åpne-kildekode MZmine v2.14 (http://mzmine.sourceforge.net). Det er en åpen kildekode-programvare for massespektrometri databehandling, med hovedfokus på LC-MS-data. 27
    2. Forvandle LC-MS kromatogram data i NetCDF format ved hjelp av programvare som leveres av utstyrsprodusenten. For de resultatene som er beskrevet her, kan du bruke Bruker Daltonics Esquire v5.2 og dataanalyse v3.2 programvare og utføre tiltak i henhold til produsentens instruksjoner.
      MERK: Andre omformere kan brukes (ulike gratis-ware omformere er tilgjengelig).
    3. Importer .CDF filene inn i programvaren.
    4. Implementere spissregistrering, justering, gap fylling og topp filtreringsprosedyrer med parameters rapportert i tabell 3.
      1. Som første skritt, velg en importert .CDF fil, og deretter gå til Visualisering → TIC / XIC Visualizer. Sette markøren ved bunnen av den minste toppen i kromatogrammet og notere om den minimale intensitetssignalet for basis ion. Så gå til rådata Metoder → Peak Detection.
      2. Velg Mass Detection og fyll signalnivå for å oppdage individuelle ioner for hver skanning og lage en ion-listen.
        MERK: Kontroller algoritme før du utfører massevarslere - det avhenger av massespektrometer. I vårt tilfelle, velger vi Tyngdepunktet.
      3. Velg kromatogram Builder og fyll med signalnivå for å koble datapunkter fra ion listen og bygge et kromatogram for hver masse verdi. Se parametrene angitt i massespektrometer håndboken for å justere Min tid Span og m / z toleranse.
      4. Deretter går du til Peak Listen Metoder → Peak Detection → kromatogram Deconvooppløsning. Velge den riktige algoritme (i dette tilfellet lokalt minimum Search) for å tillate separasjon av hvert kromatogram til individuelle topper.
      5. inspisere manuelt kromatogrammene for å finne ut de riktige verdiene for følgende parametre. Sett Kromatografiske Threshold til 30% for å fjerne støy og Søk Minimum i RT Range til 2 (min) for å identifisere tilstedeværelsen av minst lokalbefolkningen til å diskriminere to topper.
      6. Sett Minimum Relativ høyde på 2,0. inspisere manuelt kromatogrammet for å identifisere den minimale absolutte høyden av signalet som svarer til en topp, og ikke til bakgrunns; satt denne verdien som Absolute Høyde (for eksempel 10000 i fremlagt eksperiment).
      7. Sett Min Forhold av Peak Top / Edge 1,1 til staten minimumsforholdet mellom topp og de laveste datapunkt intensiteter av en topp for å bli anerkjent som en ekte topp.
      8. inspisere kromatogrammene manuelt for å se hvilke som er minimum varighet av de ulike toppene i brukt chromatfisk metode værforhold (for eksempel mellom 0,2 og 2 min, avhengig av forbindelsen, i de presenterte eksperimenter), og følgelig bruke disse verdiene som Peak Lengde Område (minutter) for å angi at området akseptabelt peak lengde som varighet.
      9. Så gå til Peak Listen Metoder → Isotoper → Isotop Peaks Grouper å gruppere isotoper i en topp, vanligvis i den mest intense. Merk: parametrene avhenger av oppløsningen av massespektrometer og reproduserbarheten av oppholdstidene.
      10. Til slutt, gå til Peak Liste Metoder → Alignment → Bli Aligner å justere topper avhengig av deres m / z og oppholdstid ved hjelp av en kamp poengsum.
    5. Etter samkjøre toppene, fylle eventuelle datahull ved å klikke på Peak Listen Metoder → Gap Fylling → Peak Finder. Endelig filter duplisere datapunkter ved å klikke på Peak Listen Metoder → Filtrering → Duplicate Peak Filter.
    6. Eksportere den resulterende datasettet som en .CSv fil.
    7. Endre manuelt. Csv utvidelse til en. Txt utvidelse. Hvis ingen filtyper er synlige, endre innstillingene på datamaskinen for å avsløre filtyper. Gå til File Explorer Valg → Vis → Avanserte innstillinger og fjern merket i boksen 'Skjul filetternavn for kjente filtyper ".
    8. Importer TXT-filer i et regneark. Dette frembringer en datamatrise i hvilken alle de detekterte metabolitter, som gjenkjennes av et identifikasjonsnummer, m / z-verdien og retensjonstid, kvantifiseres i alle prøvene i forhold til deres topparealverdier.

3. Forbered Berry Powder Ekstrakter til transkriptom analyse og behandle data

  1. Utdrag Total RNA fra Berry Samples og Bestem RNA kvalitet.
    1. Utdrag total RNA fra berry prøvene.
      MERK: I dette tilfellet studien, en proprietær kit og en modifisert prosedyre som sikrer fullstendig fjerning av molekyler som interfere med RNA-analyse, slik som polysakkarider og polyfenoler, ble anvendt. Instruksjonene nedenfor er spesifikk for dette settet 18.
      1. Vei 400 mg berry pulver for hver prøve, dele den i to deler og legg 200 mg hver i to mikrofugerør.
      2. Legg 900 mL av lysis løsning som inneholder β-mercaptoethanol (følger med i pakken) til hver 200 mg pulver og vortex umiddelbart og kraftig i minst 30 sek. Varm prøven ved 56 ° C i 5 minutter rysting ved 800 rpm.
      3. Sentrifuger prøvene ved maksimal hastighet i en bord- mikrosentrifuge i 10 minutter for å pelletisere cellerester.
      4. Pipetter 700 ul av supernatanten inn i filtreringskolonne i settet (blå holderring) sitter i en 2 ml oppsamlingsrør. Lukk lokket og sentrifuger ved maksimal hastighet i en bord- mikrofuge i 1 min for å fjerne gjenværende rester. Gjenta denne fremgangsmåten to ganger ved anvendelse av samme filtreringskolonne, men en ny samling rør, noe som resulterer i tre tUBE'er hver inneholdende ~ 700 ul av den klarede lysat.
      5. Pipet 750 ul bindingsløsning (følger med i settet) i hvert rør avklart lysat og bland umiddelbart ved å pipettere opp og ned minst fem ganger. Overfør 700 ul av denne blandingen til bindingen kolonnen i settet (rød holderring) sitter i en 2 ml oppsamlingsrør. Lukk lokket og sentrifuger ved maksimal hastighet i en bord- mikrofuge i 1 min for å binde RNA.
      6. Dekanter gjennomstrømning fraksjon, snu samling rør og tapp det kort på en ren pute av absorberende papir for å drenere den gjenværende væske.
      7. Returnere kolonnen til oppsamlingsrøret og pipettér den gjenværende blandingen i den samme kolonne og gjenta sentrifugering og dekantering trinn. Gjenta inntil hele blandingen er blitt filtrert i det samme røde binding kolonne.
      8. Nå følger resten av instruksjonene i kit og eluere RNA i 50 ul elueringsbuffer (følger med i settet) og butikken jegt ved -80 ° C klar for kvalitetskontroll trinn.
    2. Bestemme mengden og renheten av RNA ved hjelp av et spektrofotometer. Spill absorbansen forholdstall som avslører graden av kontaminering med proteiner (A 260/280) og polyfenoler / polysakkarider (A 260/230).
      MERK: RNA egnet for microarray hybridisering bør score minst 1,8 for begge forhold.
    3. Bestemme integriteten av RNA.
      MERK: Forskjellige systemer kan benyttes. En digital overtak som utfører en kapillær elektro løpe i kombinasjon med et fluorescerende fargestoff ble brukt i denne undersøkelsen. RNA egnet for microarray hybridisering bør ha en RNA Integritet nummer (RIN) på minst 8.
  2. Forbered Prøver og hybridisere RNA til en egendefinert Microarray.
    1. Angi start mengden av total RNA for microarray analyse til 200 ng ved fortynning av RNA-oppløsningen oppnådd i trinn 3.1.1.8 med deionisert RNase-fritt vann. Tilsettpassende mengde av RNA til et 1,5 ml mikrosentrifugerør i et sluttvolum på 1,5 pl.
    2. Tilsett 2 mL fortynnet pigg mix til hver RNA prøve og følge produsentens instruksjoner for å syntetisere første cDNA, transkribere dette i cRNA og merke cRNA med cyanine 3CTP.
    3. Rense merket cRNA i henhold til produsentens instruksjoner og elueres i 30 mL RNase-fritt vann.
    4. Bestem utbytte og spesifikk aktivitet av hver cRNA ved å registrere tre verdier på et spektrofotometer: cyanine 3 fargestoff konsentrasjon (pmol ul -1), RNA renhet (A 260/280) og cRNA konsentrasjon (ng mL -1). Bruk formler som finnes i produsentens instruksjoner for å beregne cRNA yield (mikrogram) og den spesifikke aktivitet (pmol Cy3 per mikrogram cRNA).
      MERK: Anbefalt avkastning og spesifikke aktiviteter variere på grunnlag av den spesifikke microarray format. I dette tilfellet studien var en 4-pack 44K formatvalgt, den anbefalte utbyttet var 1,65 og den spesifikke aktivitet var 9.
    5. Design tilpasset microarray med egnet programvare for probe design.
      1. For resultatene som er beskrevet i denne case study, utarbeide en ny tilpasset microarray, designet på 4-pack 44K-format ved hjelp av en web-basert applikasjon for tilpassede microarray design og oligonukleotid biblioteker. Design sonder for å matche 34,651 målet transkripsjoner, inkludert 29 971 spådd transkripsjoner fra Pinot noir V1 array, 4500 nye loci identifisert i Pinot sorten av Corvina transkriptom gjenoppbygging og 180 private Corvina gener 25.
        MERK: Dette er involvert i produksjon av 34,651 bestemte 60-mer sonder, som består av 29 798 Pinot noir spådd transkripsjoner, 4392 nye Pinot loci og 179 Corvina private gener.
    6. Klargjør hybridisering forsamlingen basert på 4-pack format spesifikasjoner som følger.
      1. Plasser 1,65 ug Cy3-merket cRNA i et sluttvolum på 41,8ul avionisert RNase-fritt vann. Legg 11 mL av 10x Blocking Agent og 2,2 mL 25x Fragmentering Buffer. Inkuber ved 60 ° C i 30 minutter i et termostatisk bad for å fragmentere RNA. Umiddelbart kul på is i 1min.
      2. Til slutt legger 55 mL av 2x hybridisering buffer, bland godt ved pipettering og sentrifugering i 1 min ved 15 500 xg ved RT. Raskt plassere mikrosentrifugerør på is. Brukes umiddelbart, ikke lagre det.
    7. Legg i den tilpassede microarray som følger.
      1. Legg i en pakning lysbilde med etiketten opp inn i bunnen av en hybridisering kammer. Sakte last 100 ul hybridisering prøve oppnådd i trinn 3.2.6.2 på hver pakning brønn, dispensering av væsken med spissen av pipetten, unngå bobler.
      2. Sakte plassere den tilpassede microarray vendt ned, slik at den numeriske strekkoden vender opp. Sørg for at sandwich paret er riktig justert. Endelig plassere dekselet på hybridisering kammeret på klemtlysbilder og hånd stram klemmen på kammeret. Rotere den sammensatte kammeret for å vurdere bevegeligheten av bobler.
    8. Plasser montert sleidekammeret i en DRIKKE i en hybridiserings-ovn innstilt på 65 ° C. Still rotatoren å rotere med 10 omdreininger pr. Tillate hybridisering for å forløpe i 17 timer.
    9. Fortsett med microarray lysbilde vask som følger.
      1. Først forberede tre lysbilde-flekker retter og fylle dem med de riktige vaske buffere: 2 retter med vaskebuffer 1 på RT og en tallerken med forvarmet (37 ° C) Wash Buffer 2.
      2. Demonter hybridisering kammeret og fjern sandwich. Med microarray lysbilde numerisk strekkode vendt opp, senk sandwich inn i den første lysbilde-farging tallerken fylt med vaskebuffer 1 ved RT, og med hjelp av rene tang, skille pakningen fra microarray lysbildet. Raskt overføre microarray lysbilde i en lysbilde rack og plasser den i andre slide-farging tallerken fylt med vaskebuffer 1ved RT.
      3. Sett slide-farging tallerken på en magnetrører og vask 1 min med moderat omrøring. Raskt overføre sleiden kurven i tredje slide-farging tallerken fylt med forvarmet (37 ° C) Vaskebuffer 2 og vask 1 min med moderat omrøring.
      4. Sakte fjern stativet fra slide-flekker tallerken og forsiktig fjerne lysbildet fra stativet, unngå dråper.
        MERK: Ikke legg Triton X-102 til vaske buffere og utelate acetonitril vasketrinn.
    10. Oppbevar vasket brikken i mørke ved romtemperatur.
  3. Skann microarray og Pakk de viktigste funksjonene.
    1. Plasser microarray lysbildet i en egnet skanner og skanne hver array ved hjelp av parameterinnstillingene anbefalt i microarray produsentens instruksjoner manuell. For de resultatene som er beskrevet her, plassere hver microarray lysbilde i en lysbildeholderen å lette skanning prosedyren.
    2. Importer utgang .shpfil i en passende programvare som er i stand til å konvertere et digitalt signal inn numeriske fluorescerende verdier. Kontroller kvalitetskontroll rapport for å sikre at hybridiseringen var vellykket prosedyre.
      1. For de resultatene som er beskrevet her, bruke parameterinnstillingene som er anbefalt i bruksanvisningen for funksjonen utvinning programvare og inspisere kvalitetskontroll rapporten for å sikre at parametrene oppført i tabell 4 er innenfor normalområdet gitt av produsenten.
Metric Name Øvre grense Nedre grense Beskrivelse
AnyColorPrcntFeatNonUnif 1.00 NA Prosent av funksjoner som er funksjons ujevnhet uteliggere i enten kanal
DetectionLimit 2,00 0,10 Gjennomsnitt pluss standardavvik en av pigg moduler under den lineære konsentrasjonsområde
absGE1E1aSlope 1,20 0,90 Absolute av skråningen av plass for Signal vs. Konsentrasjon av E1A sonder
MedCVProcSignal 8,00 NA Median% CV for Bearbeidet Signal
gNegCtrlAveBGSubSig 5,00 -10,00 Gjennomsnitt av bakgrunnen trekkes signal fra alle inlier negative kontroller (BGSubSignal beregnes ved å trekke en verdi som kalles BGUsed fra funksjonen bety signal)
gNegCtrlAveNetSig 40.00 NA Gjennomsnitt av netto signal til alle inlier negative kontroller
gNegCtrlSDevBGSubSig 10.00 NA Standardavvik påbakgrunn trekkes signaler om alle inlier negative kontroller
gNonCntrlMedCVProcSignal 8,00 NA Median% CV for det behandlede signal av de ikke-kontroll prober
gSpatialDetrendRMSFilter 15.00 NA Residual bakgrunn detrending fit

Tabell 4: Hoved parametere som skal kontrolleres for å kontrollere kvaliteten på microarray hybridisering.

  1. Behandle mikroarray data.
    1. Når alle microarray lysbildene er skannet og kvalitetskontroll har blitt vurdert positivt, utarbeide en tabulatordelt data-matrise ved å velge gProcessedSignal verdiene fra hver enkelt undergruppe utfallet fil, som representerer den rå fluorescensstyrkene hver sonde.
    2. I et regneark, normalisere dataene på de 75 persentilen i hvert array (P-verdier) og calculspiste gjennomsnittet av alle P-verdier mellom alle de forskjellige deloppstillingene å beregne R-forhold.
    3. Deretter, på samme regneark, normalisere hver gProcessedSignal verdi til R-forholdet av sin egen deloppstillingen.

4. utføre detaljert statistisk analyse av de Metabolomics og transcriptomics data

  1. Klargjør Statistisk analyse Software.
    MERK: I dette tilfellet studien, en programvare i stand til å utføre PCA ble PLS-DA og O2PLS-DA brukt.
    1. Importer metabolomics og transcriptomics data. Gå til Fil → Ny Regular Prosjekt → Ny Regular Project for å importere data matrise oppnådd med MZmine programvare. Klikk deretter på Rediger → Transponere hele matrisen → Hjem og tildele den aktuelle grunnskolen og den vidaregåande ID → Fullfør.
    2. Gjennomsnittlig sentrere data og skalere dem ved hjelp av Pareto skalaen. I Hjem-vinduet, gå til Rediger → M1 og endre den aktuelle Paramemeterne avhengig av data. For de resultatene som er beskrevet her, endre Skala fra Unit variansen til Par.
    3. Skalere transcriptomics data ved hjelp av Unit variansen innstillingen.
  2. Gjennomføre multivariate statistiske analyse.
    1. Implementere PCA som vist på F igur 2. I dette tilfellet studien avdekker PCA de viktigste forskjellene mellom prøvene, noe som reflekterer de ulike modningsstadier og vekstsesonger.
      1. I Workset vinduet velger PCA-X som modelltype. Trykk på Automatisk tilpasning. Vær oppmerksom på R2X (cum) og Q2 (cum) verdier som de gir en idé om kvaliteten på modellen.
        MERK: Generelt, jo høyere verdier jo bedre modell, men modeller med svært høy R2X (cum) kan over passe dataene. Som empirisk regel slutter vi å legge hovedkomponentene når Q2 (cum) verdien begynner å avta.
      2. Deretter velger Poeng → Scatter å se handlingen som viser mulig gruppering av prøvene.
      3. Inspiser PCAResultat Plot. Hvis en god modell oppnås (Q2cum> 0,5), bruker de samme klassene prøver å bygge en O2PLS-DA-modellen (trinn 4.2.2).
    2. Bygge to O2PLS-DA modeller med prøvene klassifisert av makro-sone og validere modellene bruker en permutasjon test med 200 permutasjoner.
      1. Gi klassene ved å gå til Hjem-vinduet → New Som → M1 → Observasjoner. Still inn ønskede klasser. Deretter endrer Modell Type fra PCA-X til O2PLS-DA. Trykk på Automatisk tilpasning. Sørge for at antallet komponenter i PLS-DA-modellen er den samme som for den O2PLS-DA.
      2. For å validere O2PLS-DA-modellen, gå til Analyser CV-ANOVA og se rett p-verdi. Videre, klikk på New Som i Hjem-vinduet → M2 og endre Modell Type fra O2PLS-DA til PLS-DA. Trykk på Automatisk tilpasning.
      3. Gå til Analyser → permutasjoner og utføre 200 permutasjoner (de-velg Beregn Permutasjoner alternativ).
        Merk: Det endelige resultatet viser et vindu hvor R2 verdi should vanligvis treffer Y-aksen i verdier i henhold til 0,4, mens Q2 skal treffe den negative delen av Y-aksen. Hvis R2 og / eller Q2 verdiene er feil, redusere antall komponenter både i PLS-DA og O2PLS-DA-modeller.
      4. Fortsett å velge M2 i prosjektvinduet og klikk på Scores → Scatter å se tomten og plasseringen av prøveklassene. Å observere hva metabolitter karakterisere en eller flere bestemte klasser, gå til Plot / List → Scatter.
      5. Endre Velg datatypen til Observasjoner og belastninger → Legg Series og endre element i X-Axis og Series inn pq (korr) og Pred Comp i 1 og 2 eller flere komponenter når den er tilstede, henholdsvis.
      6. Med høyre museknappen inne på tomten, gå til Eiendoms → Farge og merker av vilkårene for å skille plottet symboler blant molekyler og klasser. Gå til Layout → Format Plot → Axis og / eller stiler å endre tomten med de ønskede egenskaper.
      3. <li> Basert på resultatene av metabolomics O2PLS-DA analyse, presentere forskjeller i de relative nivåer av spesifikke metabolitter eller klasser av metabolitter som histogrammer.
    3. Basert på resultatene fra transcriptomics O2PLS-DA analyse, hente og tilordne forskjellig modulert gener til Gene ontologi (GO) grupperinger 28.
    4. Identifisere relasjoner mellom metabolitter og genekspresjon manuelt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Saken studie beskrevet i denne artikkelen gitt en endelig datamatrise bestående av 552-signaler (m / z funksjoner) inkludert molekylære ioner pluss deres isotoper, addukter og noen fragmenter, relativt kvantifiseres på 189 prøver (7 vingårder x 3 modne stadier x 3 vekstsesonger x 3 biologiske replikat). Det totale antallet for datapunkter var derfor 104328. Fragmentering treet analyse resulterte i annotering av 282 m / z funksjoner, tilsvarende metabolitter pluss addukter, isotoper og fragmenter. Undersøkende analyse av hele datamatrise ved PCA viste at prøvene gruppert i henhold til modningstrinnet (Veraison, mid-modning og moden) langs den første og andre hovedkomponenter (T1-T2, figur 2A), og i henhold til vekstsesongen langs den tredje hovedkomponent (t1-t3, figur 2B).

Figur 2 src = "/ files / ftp_upload / 54410 / 54410fig2.jpg" />
Figur 2:. PCA av hele metabolomics data matrise Unsupervised PCA-X rillespredningsplott som viser gruppering av grapevine prøver tatt i tre ulike vekstsesonger (2006, 2007 og 2008) og modning stadier (Veraison, mid-modning og modne bær ). I det første plot (A) prøvene gruppert i henhold til de modner trinn, mens i det andre (B) gruppert i henhold til de vekstsesongen. Fargene fremheve de modne stadier som grønn (Veraison), rosa (mid-modning) og lilla (modne bær). Symbolene representerer vekstsesonger: sirkler (2006), torg (2007) og trekanter (2008) .Component t1: Q2: 0,34; R2X: 0,331; Q2cum: 0,304; Component t2: Q2: 0,185; R2X: 0,155; Q2cum: 0,433; Component t3: Q2: 0,145; R2X: 0,0924; Q2cum: 0,515.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Den unsupervised PCA var ikke i stand til å avdekke konkrete terroir funksjoner, som er skjult under rådende vintage effekter, så en veiledet O2PLS-DA tilnærming ble brukt på to separate datasett, altså, bær på Veraison og fullt modne bær. Dette gjør at utforskningen av metabolske forskjeller som representerer de tre makro soner (Gardasjøen, Valpolicella og Soave) i to viktige stadier av modning, for å identifisere spesifikke terroir signaturer som representerer disse sonene på disse modne stadier.

Figur 3
Figur 3: O2PLS-DA av Veraison og moden drue bær. O2PLS-DA poengsum spredningsplott som viser gruppering av grapevine prøver samlet i Garda-sjøen ( blå), Soave (grønn) og Valpolicella (rosa) makro-soner på Veraison (A), og når bærene var modne (B). Metabolittene som er ansvarlige for den observerte clustering i (A) og (B) er synlige i sammenheng lasting plott (C) og (D) hhv. Grupper av metabolitter, representert som trekanter, er blå for resveratrol og stilbenes, rosa for anthocyaniner, grønn for hydroxycinnamic og hydroksybenzosyre syrer, lilla for flavan-3-oler / procyanidins, og gult for andre flavonoider. A: komponent P1: Q2: 0,278; R2X: 0,0529; Q2cum: 0,278; komponent P2: Q2: 0,33; R2X: 0,0394; Q2cum: 0,608. B: komponent P1: Q2: 0,353; R2X: 0,0639; Q2cum: 0,353; komponent P2: Q2: 0,188; R2X: 0,0374; Q2cum. 0,541 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 4
Figur 4: Fordeling av metabolske markører blant de tre makro soner:. Gardasjøen, Soave og Valpolicella metabolitter reflektere gjennomsnitt ± standard feil (n = 18 for Garda og Soave, 27 for Valpolicella makro-sone) av forskjellig glykosylert og acylerte anthocyaniner, resveratrol / stilbenes og flavonoider i modne Corvina bær i de tre ulike vekstsesonger (2006, 2007 og 2008). Ulike bokstaver representerer grupper som var signifikant forskjellig som bestemmes av en t-test (p <0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

De spesifikke signaturer av de syv individuelle vingårder ble identifisert ved hjelp av en spesielltegnes statistisk tilnærming 10. To O2PLS-DA modeller ble bygget, en utforsker forskjellene mellom de bær dyrket i de tre makro soner på Veraison, og den andre utforsker forskjellene i de tre makro soner blant modne bær. Modellene ble kryss validert ved anvendelse av en permutasjon test (200 permutasjoner) som viser at den modell som beskriver den modne bær på tvers av de tre makro-sonene var gyldig, mens bare de Lake Sjøen prøvene var forskjellig fra de andre prøvene ved Veraison (ikke vist).

Rille plott av de to modellene, som viser hvordan prøvene fra de tre makro soner ved Veraison og forfall separeres i henhold til fordelingen av metabolitter, er vist i figurene 3A og 3B. Laste plott av disse modell uttrykt som pq (korr), dvs. korrelasjonen mellom p (klassen av prøver) og q (metabolittene), er vist i figurs 3C og 3D. I laste tomter, de røde firkantene representerer klassen av prøvene (makro-soner) og de fargede trekanter representerer de enkelte metabolitter. Avstanden mellom metabolitter og prøvene reflekterer deres relasjoner. Metabolittene er fargekodet i henhold til deres kjemiske klassen.

Gitt den lave statistiske gyldigheten av Veraison modellen som vist ved permutasjon test, er det sannsynlig at lider av overtilpassing. Derfor følgende observasjoner refererer utelukkende til de modne bær prøver, hvis modellen var statistisk gyldig. I laste plottet vist i figur 3D, er stilbenes forskjøvet mot Gardasjøen makro-sonen, mens flavonoider er forskjøvet mot Soave og Valpolicella makro soner. En nærmere titt på individuelle metabolitter avslører den asymmetriske fordelingen av antocyaniner, med peonidin og dets derivater mer utbredt i Lake Garda makro-sonen og andre anthocyaniner mer utbredt i Valpolicella makro-sonen (figur 4). Enkelt anthocyanin-3-O-glucosides er mer utbredt i Valpolicella makro-sonen, mens acylerte og coumarated derivater er mer utbredt i Soave makro-sonen.

Den transcriptomics komponent av denne undersøkelsen var opprinnelig ut ved hjelp av en transcriptomics plattform som ikke lenger støttes. Som en konsekvens, har vi satt opp en alternativ prosedyre, med det fremdeles finnes plattform; den nye plattformen inneholder flere sonder enn den gamle, inkludert 249 mer Pinot noir spådd transkripsjoner, 4392 nylig identifiserte Pinot loci og 179 Corvina private gener 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikkelen beskriver metabolomics, transcriptomics og statistiske analyseprotokoller som brukes til å tolke drue bær terroir-konseptet. Metabolomics analyse ved hjelp av HPLC-ESI-MS er følsom nok til å påvise et stort antall metabolitter samtidig, men relativ kvantitering påvirkes av matrisen effekt og ion undertrykkelse / ekstrautstyr. Imidlertid har en lignende tilnærming allerede blitt brukt for å beskrive modning og post-harvest visne av Corvina bær, og korrigering av matrix effekter hatt en begrenset effekt på resultatene 5. Videre, en siste stor-skala multi-instrument inter-laboratorium studie for å fastslå den komparative robusthet av NMR og LC-MS for vilkårlige metabolomics bruker de samme prøvene viste at de ulike instrumentene og teknologier ga konsistente resultater 6. Saken studien beskrevet her involvert innsamling og analyse av prøver på tre modne stadier fra sju vinmarker i tre makro-zde mer enn tre vekstsesonger. Heri ble terroir signatur undersøkt på makro-sonen nivå (Gardasjøen og Soave, hver representert med to vingårder, og Valpolicella, representert ved tre vingårder) ved hjelp av PCA og O2PLS-DA multivariat statistikk. Forskjellene mellom enkelte vingårder er mer subtil og krever mer sofistikerte og følsomme statistiske tilnærminger 10. Forskjellige trinn i den foreslåtte protokollene er kritisk og må vurderes for å kunne svare på de biologiske spørsmål om terroir påvirkninger på druen kvalitet.

Først av alt, er det passende prøvetakingsplan kritisk: valg av en bestemt klone for å minimere de genetiske forskjeller og flere års varighet av prøvetakingen gjør det mulig å markere den virkelige, lyd forskjeller mellom de ulike Terroirs. På den andre siden ble det foreslått forskning utføres innenfor et terroir som er spesielt egnet for vindyrking, og dette kan minimere terroir-forskjeller på druen kvalitet. Det ville således være meget interessant å sammenligne den samme sorten dyrket i en mindre optimal sone, men selvsagt kan disse vingårder ganske enkelt være ikke tilgjengelig.

Fra et teknisk synspunkt, er en meget reproduserbar metabolitt separasjon ved HPLC kritisk for å oppnå god datamatrise, siden høyere forskjellene i oppholdstiden i ulike analyser, jo høyere antallet av feil i topp innretting i den endelige datasett. Det er derfor av avgjørende betydning for å angi et passende re-ekvilibrering tid, for å dele prøvene inn i grupper på 9-10 prøver med sykluser av kromatografisk kolonne rengjøring mellom dem og til å bruke tomme prøver som den første prøve av hver porsjon. LC-MS påvirkes av en viss grad av ustabilitet, noe som kan resultere i forskjeller mellom prøver som er instrument-drevet. Dette problem kan delvis løses ved randomisering av prøveanalyse, slik det er vist i dette papiret. en imForbedringen av fremgangsmåten er bruk av hensiktsmessige kvalitet kontrollprøver i hver gruppe, som kan informere på plattformen tilstand. En passende standard forbindelse blanding (dvs. standard forbindelser med m / z-verdier og retensjonstider som strekker seg over hele m / z og retensjonstid område) og en ny kontrollprøve fremstilt ved å blande like deler av pulveret fra alle prøvene kan informere om plattformen virkninger og også til slutt benyttes for en-posteriori data normalisering.

Et annet viktig poeng for å sammenligne metabolomics og transcriptomics resultater var å bruke nøyaktig samme materiale (dvs. de samme knuste prøver) for begge analysene. I dataanalysen, er det viktig å bruke en passende statistikk metode, for eksempel OPLS-DA, noe som tillater enkel tolkning av forskjellene i form av genekspresjon og metabolitt akkumulering med hensyn til metoder som PCA. En av de store begrensningene ved denne type fremgangsmåte erfravær av sterke metoder for transcriptomics og metabolomics dataintegrasjon. Utviklingen av egnede metoder for ulike typer data korrelasjon er nødvendig for å bygge en sterk og pålitelig korrelasjon mellom transcriptomics og metabolomics data.

Teknikkene som er beskrevet i denne artikkelen tydelig avdekket modning og vintage effekter på bær metabolomet, men bestemte kjemiske signaturer som representerer de tre makro sonene ble også identifisert i modne bær under den rådende vintage effekt. Interessant nok ble analysen av Veraison bær ikke føre til en statistisk gyldig modell, noe som indikerer at terroir konseptet er hovedsakelig manifestert av metabolitter som akkumuleres i løpet av modning (f.eks antocyaniner og stilbener) enn de som allerede er til stede i umodne bær.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mill Grinder IKA IKA A11 basic
HPLC Autosampler Beckman Coulter  - System Gold 508 Autosampler
HPLC System Beckman Coulter  - System Gold 127 Solvent Module HPLC
C18 Guard Column Grace  - Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column
C18 Column Grace  - Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
Mass Spectometer Bruker Daltonics  - Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap.
Extraction solvents and HPLC buffers Sigma 34966 Methanol LC-MS grade
Sigma 94318 Formic acid LC-MS grade
Sigma 34967 Acetonitrile LC-MS grade
Sigma 39253 Water  LC-MS grade
Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 μm) Sartorius 17764
Softwares for data collection (a) and processing (b) Bruker Daltonics - Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b)
Spectrum Plant Total RNA kit Sigma-Aldrich STRN250-1KT For total RNA extractino from grape pericarps
Nanodrop 1000 Thermo Scientific 1000
BioAnalyzer 2100 Agilent Technologies G2939A
RNA 6000 Nano Reagents Agilent Technologies 5067-1511
RNA Chips Agilent Technologies 5067-1511
Agilent Gene Expression Wash Buffer 1 Agilent Technologies 5188-5325
Agilent Gene Expression Wash Buffer 2 Agilent Technologies 5188-5326
LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color Agilent Technologies 5190-2305
Kit RNA Spike In - One-Color Agilent Technologies 5188-5282
Gene Expression Hybridization Kit Agilent Technologies 5188-5242
RNeasy Mini Kit (50) Qiagen 74104 For cRNA Purification
Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray Agilent Technologies G2514F-048771 
eArray Agilent Technologies - https://earray.chem.agilent.com/earray/
Gasket slides Agilent Technologies G2534-60012 Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization
Thermostatic bath Julabo -
Hybridization Chamber Agilent Technologies G2534-60001
Microarray Hybridization Oven Agilent Technologies G2545A
Hybridization Oven Rotator Rack Agilent Technologies G2530-60029
Rotator Rack Conversion Rod Agilent Technologies G2530-60030
Staining kit Bio-Optica 10-2000 Slide-staining dish and Slide rack
Magnetic stirrer device AREX Heating Magnetic Stirrer F20540163 
Thermostatic Oven Thermo Scientific Heraeus - 6030
Agilent Microarray Scanner Agilent Technologies G2565CA
Scanner Carousel, 48-position Agilent Technologies G2505-60502
Slide Holders Agilent Technologies G2505-60525
Feature extraction software v11.5 Agilent Technologies - inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA
SIMCA + V13 Software Umetrics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jessome, L. L., Volmer, D. A. Ion suppression: A major concern in mass spectrometry. Lc Gc N Am. 24 (5), 498-510 (2006).
  2. Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go? Trends Biotech. 29 (6), 267-275 (2011).
  3. Sumner, L. W., Mendes, P., Dixon, R. A. Plant metabolomics: large-scale phytochemistry in the functional genomics era. Phytochem. 62 (6), 817-836 (2003).
  4. Bottcher, C., von Roepenack-Lahaye, E., Willscher, E., Scheel, D., Clemens, S. Evaluation of matrix effects in metabolite profiling based on capillary liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Anal Chem. 79 (4), 1507-1513 (2007).
  5. Toffali, K., et al. Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis. Metabolomics. 7 (3), 424-436 (2011).
  6. Martin, J. C., et al. Can we trust untargeted metabolomics? Results of the metabo-ring initiative, a large-scale, multi-instrument inter-laboratory study. Metabolomics. 11 (4), 807-821 (2015).
  7. Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).
  8. Velasco, R., et al. A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety. Plos One. 2 (12), (2007).
  9. Tornielli, G. B., Zamboni, A., Zenoni, S., Delledonne, M., Pezzotti, M. Ch. 11. The Biochemestry of the Grape Berry. Gerós, H., Chaves, M., Delrot, S. 11, Bentham Science Publishers. (2012).
  10. Anesi, A., et al. Towards a scientific interpretation of the terroir concept: plasticity of the grape berry metabolome. BMC Plant Biol. 15, 1-17 (2015).
  11. Berdeja, M., et al. Water limitation and rootstock genotype interact to alter grape berry metabolism through transcriptome reprogramming. Hort Res. 2, 1-13 (2015).
  12. Carbonell-Bejerano, P., et al. Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses. BMC Plant Biol. 14, 1-16 (2014).
  13. Carbonell-Bejerano, P., et al. Reducing sampling bias in molecular studies of grapevine fruit ripening: transcriptomic assessment of the density sorting method. Theor Exp Plant Phys. 28 (1), 109-129 (2016).
  14. Carbonell-Bejerano, P., et al. Circadian oscillatory transcriptional programs in grapevine ripening fruits. BMC Plant Biol. 14, 1-15 (2014).
  15. Cavallini, E., et al. Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant. Plant & Cell Physiol. 55 (3), 517-534 (2014).
  16. Cramer, G. R., et al. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).
  17. Dal Santo, S., et al. The plasticity of the grapevine berry transcriptome. Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).
  18. Fasoli, M., et al. The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program. Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).
  19. Gambino, G., et al. Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis. J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).
  20. Ghan, R., et al. Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars. BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).
  21. Pastore, C., et al. Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine. BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).
  22. Pastore, C., et al. Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening. BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).
  23. Rinaldo, A. R., et al. A Grapevine Anthocyanin Acyltransferase, Transcriptionally Regulated by VvMYBA, Can Produce Most Acylated Anthocyanins Present in Grape Skins. Plant Physiol. 169 (3), 1897-1916 (2015).
  24. Royo, C., et al. Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco. J Exp Bot. , 259-273 (2015).
  25. Venturini, L., et al. De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity. BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).
  26. Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products. Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).
  27. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).
  28. Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).

Tags

Genetikk metabolomics transcriptomics terroir grapevine multivariat statistisk analyse prinsipal komponent analyse (PCA) toveis ortogonal projeksjon til latente strukturer diskriminant analyse (O2PLS-DA) biokjemi
Den Terroir Concept Tolket gjennom Grape Berry Metabolomics og transcriptomics
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dal Santo, S., Commisso, M.,… More

Dal Santo, S., Commisso, M., D'Incà, E., Anesi, A., Stocchero, M., Zenoni, S., Ceoldo, S., Tornielli, G. B., Pezzotti, M., Guzzo, F. The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics. J. Vis. Exp. (116), e54410, doi:10.3791/54410 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter