We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.
Hindringer stede på DNA, inkludert tett bundet proteiner og ulike lesjoner, kan alvorlig hemme utviklingen av cellens replikering maskiner. Den steiling av en replisome kan føre til dets dissosiasjon fra kromosomet, enten delvis eller fullstendig, som fører til kollaps av replikasjonsgaffelen. Gjenvinningen fra dette sammenbruddet er en nødvendighet for cellen å nøyaktig komp kromosomal duplisering og deretter dele. Derfor, når kollaps inntreffer, har cellen utviklet forskjellige mekanismer som finner sted for å gjenopprette den DNA-gaffel og tillate replikasjon for å være ferdig med høy nøyaktighet. Tidligere har disse replikasjon reparasjonsbaner i bakterier blitt undersøkt ved hjelp av UV-skader, noe som har ulempen av ikke å være lokalisert til et visst område. Dette manuskriptet beskriver et system som benytter en fluorescens Repressor Operator System (Frøs) for å skape et stedsspesifikt protein blokk som kan indusere steiling og kollaps av replikering foRKS i Escherichia coli. Protokoller detalj hvordan status for replikasjon kan visualiseres i enkle levende celler ved hjelp av fluorescens mikroskopi og DNA-replikasjonsmellomprodukter kan bli analysert ved to-dimensjonal agarosegelelektroforese. Temperatursensitive mutanter av replisome komponenter (f.eks DnaBts) kan være inkorporert i systemet for å indusere en synkron sammenbrudd av de replikasjonsgafler. Videre kan rollene til de rekombinasjon proteiner og heli som er involvert i disse prosessene studeres ved hjelp av genetiske knockouts i dette systemet.
Under DNA replikasjon, den replisome møter hindringer på DNA som svekke dens progresjon. DNA-skader inkludert lesjoner og hull samt avvikende strukturer kan hindre replisome fra fortsetter en. Nylig har det blitt funnet at proteiner bundet til DNA er den vanligste kilde til hinder for replikering gaffel progresjon 2. Kunnskapen om hendelsene etter møtet av replisome med en nukleoprotein blokk har tidligere vært begrenset av den manglende evne til å indusere en slik blokk i kromosomet til en levende celle på et kjent sted. In vitro-analyse har forbedret vår forståelse av den kinetiske oppførsel av en aktiv replisome når den møter en nukleoprotein blokkering 3, så vel som de mekanistiske detaljer av replisome seg 4,5. Nåværende forståelse for reparasjon av replikering er vanligvis gjennomført med UV som skadelig agent og studert ved hjelp av plasmid DNA in vivo 6-8 </sopp>. Mens de proteinene som kan være involvert i reparasjon av DNA etter den støter på en in vivo-nukleoprotein blokken er generelt forstått fra disse studiene, uansett om det er variasjoner i de molekylære hendelser innen reparasjons trasé på grunn av den distinkte årsak i replikasjonen blokken er likevel ennå å være bestemt.
Her beskriver vi et system som gjør at en nucleoprotein blokk som skal etableres på et bestemt sted i kromosomet ved hjelp av en fluoriserende Repressor Operator System (Frøs). Vi bruker en stamme av E. coli som har hatt en rekke 240 Teto områder innlemmet i kromosom 9. Hver Teto område i matrisen har en 10 bp tilfeldig sekvens som flankerer den til å øke stabiliteten av matrisen ved å hindre RecA-mediert rekombinasjon i matrisen. Denne rekken, og varianter av den, ble opprinnelig brukt til å forstå E. coli-kromosomet dynamikk 10,11, men ble deretter tilpasset prevent in vivo replikering 12. Matrisen har blitt funnet å være stabilt opprettholdt, og for å blokkere nær 100% av replikasjonsgafler når bundet av Tetr 10,12. Bruken av lignende Laco matrisen in vitro har funnet så få som 22 områdene var tilstrekkelig til å blokkere 90% av replikasjon, selv om dette kortere matrisen var mindre effektiv in vivo 13. For å tilpasse matrisen for å skape en nukleoprotein blokkering, må repressor-proteinet være sterkt overprodusert i henhold optimaliserte betingelser hvor det deretter binder seg til matrisen for å skape en hindring. Dannelsen av blokkeringen, og dens etterfølgende frigjøring, kan overvåkes ved bruk av fluorescens mikroskopi hvis en fluorescerende merket variant av Tet repressor blir brukt. Statusen til replikasjon i hver celle er indikert med antall foci sett, hvor et enkelt fokuspunkt betyr at bare ett eksemplar av matrisen er til stede i cellen og multiple brennpunkter er tegn på aktiv replikasjon. Denne aktive regrammet blir aktivert når nucleoproteins blokkeringen blir reversert ved tilsetning av umotivert inducer som reduserer bindingsaffiniteten tetra for operatøren området i tilstrekkelig grad for den replisome å fortsette gjennom matrisen. Den repressor-proteinet er fortsatt i stand til å binde til DNA med høy nok affinitet for at nå flere kopier av matrisen kan visualiseres.
Mer intrikate detaljer om hendelsene på nucleoprotein blokkering kan oppdages ved hjelp av nøytral-nøytral todimensjonal agarosegelelektroforese og Southern hybridisering 14-16. Disse teknikker tillater analyse av DNA-strukturer i befolkningen. Replikering mellomprodukter som dannes under arrangementet, og potensielt forbli ureparert, kan visualiseres. Ved å variere restriksjonsenzym og probe anvendes, kan mellomproduktene bli visualisert ikke bare i matrisen regionen, men også på oppstrømsiden av matrisen når replikasjonsgaffelen regresses 17,18. Deregresjon finner sted i etterkant av replisome dissosiasjon; de ledende og lagging begynnende tråder atskilt fra malen tråder og gløding til hverandre som malen tråder samtidig re-anneal resulterer i en fireveis DNA struktur (en Holliday krysset).
Ved hjelp av dette system har det vist seg at replikasjonsgaffelen er ikke stabil når den støter på denne blokken 18. I tillegg kan temperaturfølsomme derivater av replisome komponenter benyttes for å forhindre omlasting av replikasjonsgaffelen når den har kollapset. Når en blokk blir etablert, kan belastningen flyttes til en ikke-permissive temperatur for å sikre en synkron deaktivering av replisome og en kontrollert forebygging av omlasting. Denne temperaturinduserte deaktivering sikrer at alle av gaflene i befolkningen har kollapset på et gitt tidspunkt, og tillater evaluering av hva som skjer når den replisome kollapser, hvor DNA blir behandlet, og det som er nødvendig for å gjenstarte prosessen med DNA-replikasjon.
En fordel med systemet beskrevet her er at nucleoproteins blokken er fullstendig reversibel; Derfor, evne til cellene for å komme seg fra nucleoproteins blokken er i stand til å bli fulgt. Tilsetningen av anhydrotetracycline til cellene vil avlaste den tette binding av repressor, slik at en replikasjons gaffel for å gå gjennom, og cellen for å gjenvinne levedyktighet. Lindring av blokkeringen kan visualiseres ved nøytral-nøytral todimensjonal agarosegel-elektroforese etter 5 min, og ved mikroskopi innen 10 min. Videre kan levedyktighet analyse åpenbare evne av stammen for å gjenopprette fra replikasjon blokkert og fortsette å spre seg.
Ved å endre den genetiske bakgrunn av stammene som anvendes i den eksperimentelle fremgangsmåte som er beskrevet her, kan reparasjonsbaner for denne type blokkering bli belyst.
During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Australian Research Council [DP11010246].
Tryptone | Sigma-Aldrich | 16922 | Growth media component |
Sodium Chloride | VWR | 27810.364 | Growth media component |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | 92144 | Growth media component |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth media component; Potassium buffer component |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth media component; Potassium buffer component |
L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | For induction of TetR-YFP production |
Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | Release of replication bloackage |
Axioskop 2 Fluorescence microscope | Zeiss | 452310 | Visualization of cells |
eYFP filter set | Chroma Technology | 41028 | Visualization of YFP |
CCD camera | Hamamatsu | Orca-AG | Visualization of cells |
MetaMorph Software (Molecular Devices) | SDR Scientific | 31282 | Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript |
Agarose | Bioline | BIO-41025 | For agarose plugs and gel electrophoresis |
Original Glass Water Repellent (Rain-X) | Autobarn | DIO1470 | For agarose plug manufacture |
TRIS | VWR | VWRC103157P | TE, TBE buffer component |
Ethylene diaminetetraacetic acid | Ajax Finechem | AJA180 | 0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH. |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Bacteriostatic agent |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | TE buffer component |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Cell lysis buffer component |
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L5125 | Cell lysis and ESP buffer component |
Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | Cell lysis buffer component |
Lysozyme | Amresco | 6300 | Cell lysis buffer component |
Proteinase K | Amresco | AM0706 | ESP buffer component |
Sub-Cell Model 192 Cell | BioRad | 1704507 | Electrophoresis system |
UV transilluminator 2000 | BioRad | 1708110 | Visualization of DNA |
Ethidium Bromide | BioRad | 1610433 | Visualization of DNA |
Boric acid | VWR | PROL20185.360 | TBE component |
Hybond-XL nylon memrbane | Amersham | RPN203S | Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used |
3MM Whatman chromatography paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030690 | Southern blotting |
HL-2000 Hybrilinker | UVP | 95-0031-01/02 | Crosslinking of DNA and hybridization |
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm | Sigma-Aldrich | 31149 | Hybridization buffer component |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Denaturation buffer component |
Trisodium citrate dihydrate | VWR | PROL27833.363 | Transfer buffer |
Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Amresco | 227 | Wash buffer component |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Hybridization buffer component |
Random Hexamer Primers | Bioline | BIO-38028 | |
Klenow fragment | New England BioLabs | M0212L | |
dNTP Set | Bioline | BIO-39025 | |
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP | PerkinElmer | BLU502A | |
Storage Phosphor Screen | GE Healthcare Life Sciences | GEHE28-9564-76 | BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35x43cm screen |
Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Visualization of blot |
Hybridization bottle | UVP | 07-0194-02 | 35 x 300mm |