Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Indusere en Stedsspesifikk Replication Blokkering i doi: 10.3791/54434 Published: August 21, 2016

Abstract

Hindringer stede på DNA, inkludert tett bundet proteiner og ulike lesjoner, kan alvorlig hemme utviklingen av cellens replikering maskiner. Den steiling av en replisome kan føre til dets dissosiasjon fra kromosomet, enten delvis eller fullstendig, som fører til kollaps av replikasjonsgaffelen. Gjenvinningen fra dette sammenbruddet er en nødvendighet for cellen å nøyaktig komp kromosomal duplisering og deretter dele. Derfor, når kollaps inntreffer, har cellen utviklet forskjellige mekanismer som finner sted for å gjenopprette den DNA-gaffel og tillate replikasjon for å være ferdig med høy nøyaktighet. Tidligere har disse replikasjon reparasjonsbaner i bakterier blitt undersøkt ved hjelp av UV-skader, noe som har ulempen av ikke å være lokalisert til et visst område. Dette manuskriptet beskriver et system som benytter en fluorescens Repressor Operator System (Frøs) for å skape et stedsspesifikt protein blokk som kan indusere steiling og kollaps av replikering foRKS i Escherichia coli. Protokoller detalj hvordan status for replikasjon kan visualiseres i enkle levende celler ved hjelp av fluorescens mikroskopi og DNA-replikasjonsmellomprodukter kan bli analysert ved to-dimensjonal agarosegelelektroforese. Temperatursensitive mutanter av replisome komponenter (f.eks DnaBts) kan være inkorporert i systemet for å indusere en synkron sammenbrudd av de replikasjonsgafler. Videre kan rollene til de rekombinasjon proteiner og heli som er involvert i disse prosessene studeres ved hjelp av genetiske knockouts i dette systemet.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Under DNA replikasjon, den replisome møter hindringer på DNA som svekke dens progresjon. DNA-skader inkludert lesjoner og hull samt avvikende strukturer kan hindre replisome fra fortsetter en. Nylig har det blitt funnet at proteiner bundet til DNA er den vanligste kilde til hinder for replikering gaffel progresjon 2. Kunnskapen om hendelsene etter møtet av replisome med en nukleoprotein blokk har tidligere vært begrenset av den manglende evne til å indusere en slik blokk i kromosomet til en levende celle på et kjent sted. In vitro-analyse har forbedret vår forståelse av den kinetiske oppførsel av en aktiv replisome når den møter en nukleoprotein blokkering 3, så vel som de mekanistiske detaljer av replisome seg 4,5. Nåværende forståelse for reparasjon av replikering er vanligvis gjennomført med UV som skadelig agent og studert ved hjelp av plasmid DNA in vivo 6-8 in vivo-nukleoprotein blokken er generelt forstått fra disse studiene, uansett om det er variasjoner i de molekylære hendelser innen reparasjons trasé på grunn av den distinkte årsak i replikasjonen blokken er likevel ennå å være bestemt.

Her beskriver vi et system som gjør at en nucleoprotein blokk som skal etableres på et bestemt sted i kromosomet ved hjelp av en fluoriserende Repressor Operator System (Frøs). Vi bruker en stamme av E. coli som har hatt en rekke 240 Teto områder innlemmet i kromosom 9. Hver Teto område i matrisen har en 10 bp tilfeldig sekvens som flankerer den til å øke stabiliteten av matrisen ved å hindre RecA-mediert rekombinasjon i matrisen. Denne rekken, og varianter av den, ble opprinnelig brukt til å forstå E. coli-kromosomet dynamikk 10,11, men ble deretter tilpasset prevent in vivo replikering 12. Matrisen har blitt funnet å være stabilt opprettholdt, og for å blokkere nær 100% av replikasjonsgafler når bundet av Tetr 10,12. Bruken av lignende Laco matrisen in vitro har funnet så få som 22 områdene var tilstrekkelig til å blokkere 90% av replikasjon, selv om dette kortere matrisen var mindre effektiv in vivo 13. For å tilpasse matrisen for å skape en nukleoprotein blokkering, må repressor-proteinet være sterkt overprodusert i henhold optimaliserte betingelser hvor det deretter binder seg til matrisen for å skape en hindring. Dannelsen av blokkeringen, og dens etterfølgende frigjøring, kan overvåkes ved bruk av fluorescens mikroskopi hvis en fluorescerende merket variant av Tet repressor blir brukt. Statusen til replikasjon i hver celle er indikert med antall foci sett, hvor et enkelt fokuspunkt betyr at bare ett eksemplar av matrisen er til stede i cellen og multiple brennpunkter er tegn på aktiv replikasjon. Denne aktive regrammet blir aktivert når nucleoproteins blokkeringen blir reversert ved tilsetning av umotivert inducer som reduserer bindingsaffiniteten tetra for operatøren området i tilstrekkelig grad for den replisome å fortsette gjennom matrisen. Den repressor-proteinet er fortsatt i stand til å binde til DNA med høy nok affinitet for at nå flere kopier av matrisen kan visualiseres.

Mer intrikate detaljer om hendelsene på nucleoprotein blokkering kan oppdages ved hjelp av nøytral-nøytral todimensjonal agarosegelelektroforese og Southern hybridisering 14-16. Disse teknikker tillater analyse av DNA-strukturer i befolkningen. Replikering mellomprodukter som dannes under arrangementet, og potensielt forbli ureparert, kan visualiseres. Ved å variere restriksjonsenzym og probe anvendes, kan mellomproduktene bli visualisert ikke bare i matrisen regionen, men også på oppstrømsiden av matrisen når replikasjonsgaffelen regresses 17,18. Deregresjon finner sted i etterkant av replisome dissosiasjon; de ledende og lagging begynnende tråder atskilt fra malen tråder og gløding til hverandre som malen tråder samtidig re-anneal resulterer i en fireveis DNA struktur (en Holliday krysset).

Ved hjelp av dette system har det vist seg at replikasjonsgaffelen er ikke stabil når den støter på denne blokken 18. I tillegg kan temperaturfølsomme derivater av replisome komponenter benyttes for å forhindre omlasting av replikasjonsgaffelen når den har kollapset. Når en blokk blir etablert, kan belastningen flyttes til en ikke-permissive temperatur for å sikre en synkron deaktivering av replisome og en kontrollert forebygging av omlasting. Denne temperaturinduserte deaktivering sikrer at alle av gaflene i befolkningen har kollapset på et gitt tidspunkt, og tillater evaluering av hva som skjer når den replisome kollapser, hvor DNA blir behandlet, og det som er nødvendig for å gjenstarte prosessen med DNA-replikasjon.

En fordel med systemet beskrevet her er at nucleoproteins blokken er fullstendig reversibel; Derfor, evne til cellene for å komme seg fra nucleoproteins blokken er i stand til å bli fulgt. Tilsetningen av anhydrotetracycline til cellene vil avlaste den tette binding av repressor, slik at en replikasjons gaffel for å gå gjennom, og cellen for å gjenvinne levedyktighet. Lindring av blokkeringen kan visualiseres ved nøytral-nøytral todimensjonal agarosegel-elektroforese etter 5 min, og ved mikroskopi innen 10 min. Videre kan levedyktighet analyse åpenbare evne av stammen for å gjenopprette fra replikasjon blokkert og fortsette å spre seg.

Ved å endre den genetiske bakgrunn av stammene som anvendes i den eksperimentelle fremgangsmåte som er beskrevet her, kan reparasjonsbaner for denne type blokkering bli belyst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Blokkering Replication med Frøs

  1. Indusere Replication blokkering
    1. Fortynn en frisk over natten kultur av en E. coli-stamme som bærer en Teto matrise og pKM1 18 til OD 600 nm = 0,01 i en fortynnet komplekst medium (0,1% trypton, 0,05% gjærekstrakt, 0,1% NaCl, 0,17 M KH 2PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) med antibiotika som kreves for valg.
      Merk: Ikke legg tetracyklin for utvalget som det ikke er kompatibelt med dette systemet. Gjøre volumet av kulturen tilsvarende 10 ml per prøve som kreves. For eksempel, kulturen volum for eksperimentell design i figur 1 er 60 ml.
    2. Vokse ved 30 ° C med risting inntil OD 600 nm = 0,05-0,1. Fjerne en 10 ml prøve for å tjene som ikke-indusert kontroll og tilsett 0,1% arabinose til den gjenværende kultur for å indusere produksjonen av Tetr-YFP fra pKM1. Fortsette å vokse både ikke-indusert og Inducedkulturer. Etter en time, se på tilstedeværelsen av et enkelt kontaktpunkt i hver celle av den induserte kultur med fluorescens mikroskopi (se punkt 2).
    3. Dersom de induserte celler blir bekreftet blokkert (mer enn 70% av cellene har en enkelt fokus), registrerer OD 600nm og ta en 7,5 ml prøve for analyse ved 2-D geler (se punkt 3). Ta en tilsvarende prøve fra den ikke-indusert kontrollkulturen.
  2. Slippe Replication blokkering
    1. For å frigjøre replikasjonsblokken, tilsett 100 ml ng -1 av umotivert inducer anhydrotetracycline (AT) til en 10 ml prøve av de blokkerte celler. Fortsette å vokse ved 30 ° C i 10 minutter og ta prøver for celletetthet (1 ml), mikroskopi-analyse (10 pl) og nøytral-nøytrale to-dimensjonale agarosegeler (7,5 ml).
  3. Indusere Sammenbruddet av Replisome
    1. Dersom cellene inneholder en temperaturfølsom allel som DnaB-ts eller dnaC ts som krever deactivasjon, beveger den kolbe som inneholdt de blokkerte cellene til 42 ° C. Ta prøver for analyse på tidspunkter som kreves (f.eks en time etter inkubasjon). Etter at cellene har inkubert ved 42 ° C i 1 time, skifte cellene til 30 ° C i 10 minutter (se figur 1).
      Merk: Cellene kan flyttes til 30 ° C for å starte på nytt analyse.

Figur 1
Figur 1:. Oversikt over Frøs Replication Block and Release Eksperimentell Prosedyre E. coli-stammer som bærer de Teto matrisen blir dyrket ved 30 ° C. Når cellene når en OD 600nm på over 0,05, er Tetr-YFP produksjon indusert med arabinose (Ara; 0,1%). Fortsette å vokse en subpopulasjon av ikke-induserte celler for å virke som kontroll ved 30 ° C. En prøve av de induserte celler blir analysert via fluorescens mikroskopi etter 1 - 2 timer (se 2.1). Hvis replikering erbekreftet å være blokkert, blir prøver tatt for 2-D-gel-analyse antydet med testrørene (se 3.1) og for levedyktighet tester (valgfritt). Replikasjonsblokkeringen kan fjernes med anhydrotetracycline (AT, 0,1 ug / ml) og cellene analyseres 10 min senere. Hvis cellene bære en temperaturfølsom allel (f.eks DnaB ts), kan dette bli inaktivert ved å flytte de blokkerte cellene til 42 ° C for riktig analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. Fluorescensmikroskopi

  1. Fremstille en agarose puten ved pipettering av 500 ul av smeltet agarose (1% i vann) på et objektglass; overlappe dekk umiddelbart før agarose stivner. Oppbevar lysbilde (e) i våt vev ved 4 ° C inntil nødvendig.
  2. Når agarose har stivnet, fjerner dekkglass fra agarose puten og pipette 10 mL av bakteriellkultur på midten av puten for å hindre bevegelse av cellene under visualisering. Når prøven har tørket (ca. 5 min), erstatte dekkglass. Plasser en dråpe nedsenkning olje på dekkglass og plasser skyve under optikk.
  3. Visualisere celler Bruke Fase Mikros ved 100X forstørrelse.
    1. I dialogboksen Acquire boksen i bildebehandlingsprogrammer, sett eksponeringstiden til 100 ms. Fange bildet ved å velge Acquire. Ikke flytt på scenen. I Acquire dialogboksen velger YFP som belysning for ekstern Shutter Koblet til kamera. Sett exporsure tid til 1000 ms. Slå av scenen lys. Fang fluorescens bilde ved å velge Acquire.
      Merk: Tiden kan variere avhengig av lyskilden, mikroskop og kamera som brukes.
    2. For å overlappe fasen og fluoriserende bilder, velg Color Kombiner innenfra Skjerm-menyen. I Color Kombiner dialogboksen velger YFP bildet som den grønne komponent og fase bildet som blue komponent. Klikk på farge kombinere. Finn ut om befolkningen har hadde replikering vellykket blokkert ved å etablere om majoriteten av cellene har en fokus per celle.
      Merk: Sammenligning med en prøve fra kontroll uten tilsatt arabinose er nyttig for visuelt å identifisere forskjellen i EYFP produksjon.

3. DNA-ekstraksjon / agarosepluggene

  1. Legg natriumazid (sluttkonsentrasjon på 0,1%) til 7,5 ml kulturprøver fra trinn 1.1.3 og 1.2.1. Inkuber på is i minst 5 min.
    Merk: Natriumazid er ekstremt giftig. Ta kontakt med HMS-datablad før arbeidet påbegynnes og ikke håndterer det før alle advarsler er lest og oppfattet.
  2. Sentrifuger cellene 5000 xg i 10 minutter for å pelletere cellene. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 200 pl Pett IV (PIV) buffer (10 mM Tris: HCI (pH 8,0), 1 M NaCl). Mikrosentrifuge (13, 000 xg i 2 min) for å pelletere cellene. discard supernatanten. På dette stadiet, prosessen pellets videre eller oppbevares ved -20 ° C.
  3. Resuspender cellene med den laveste celletetthet i 50 ul PIV og sted ved 50 ° C. For alle andre prøver, justere volumene av PIV slik at den endelige celletettheten er den samme i hvert rør (f.eks Prøve 1 (OD 600 nm = 0,128) ble resuspendert i 50 ul Prøve 2 (OD 600 nm = 0,138) resuspendert i 54 ul).
    1. Legge til et like stort volum ferskt fremstilt 0,8% agarose oppløsning i PIV (sluttkonsentrasjon 0,4%;. F.eks Prøve 1 50 pl, prøve 2 54 mL). Sørg for at prøvene, agarose og PIV er over 50 ° C for å hindre størkning.
  4. Behandle et objektglass med 40 ul av en passende glass vannavstøtende eller silikon oppløsning. Gni lysbilde med en vev før det er tørt.
    Merk: Dette kan gjøres på forhånd, og de behandlede objektglass lagret i lengre tid ved værelsestemperatur.
  5. Plasser 20 mL dråper than celle / agarose fjæring på lysbildet for å produsere plugger som er halvkuleformet.
    Merk: Den første prøven (resuspendert i 50 ul PIV) vil produsere 5 plugger på ett lysbilde.
  6. Når pluggene er størknet, skyver dem forsiktig inn i et mikrosentrifugerør og tilsett 1 ml cellelyseringsbuffer (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1 M NaCl, 100 mM Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 0,2% natriumdeoksykolat, 0,5% N-lauroyl-sarcosin-natriumsalt (Sarkosyl), 100 ug ml - 1 lysozym, 50 ug ml - 1 RNase A). Inkuber ved 37 ° C i 2 timer.
  7. Fjerne cellelyseringsbuffer og tilsett 1 ml EDTA / sarkosyl / proteinase K (ESP) løsning (0,5 M EDTA, 1% N-lauroyl-sarcosin-natriumsalt (Sarkosyl), 1 mg ml - 1 proteinase K). Inkuber ved 50 ° C over natten eller inntil pluggene er gjennomsiktig. Hvis en annen over natten inkubasjon er nødvendig, bytt ESP løsning med frisk buffer etter ca 18 timer.
  8. FjernESP-buffer og vaske proppene 5 ganger med 12 ml Tris-EDTA (TE) buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0), slik at en 30 min ekvilibrering med hver vask. Oppbevar ved 4 ° C i 1 ml TE-buffer.

4. Nøytral-nøytral to-dimensjonal elektroforese

  1. Overføre en agarose plugg fra trinn 3,8 til en frisk mikrosentrifugerør og tilsett 150 ul restriksjonsenzymbuffer (1x konsentrasjon). Legg 25-100 enheter av restriksjonsenzym (f.eks, 60 enheter av EcoRV, (se figur 3A)). Fordøye ved 37 ° C i 6-8 timer.
  2. Ved 4 ° C, helles en 0,4% agarose-gel (300 ml) i 1 x Tris / borat / EDTA (TBE) til en gel brett på ca 25 x 25 cm. Sett inn en kam for å gjøre brønner omtrent samme bredde som diameteren av pluggen. Når gelen er stilt inn, fjerne kammen og flytte gelen til romtemperatur.
  3. Skyv en av de nedbrutte agaroseplugger inn i en brønn, posisjonering flate lysbilde av pluggen mot den side av brønnen hvor tHan DNA vil gå inn i gel. Sett inn en enkelt plugg på samme måte i alle andre også.
  4. Pipette smeltede 0,4% agarose i brønnene for å forsegle pluggen i stilling.
  5. Belastning 1 kb DNA-stige i en tom brønn, igjen etterlater et gap mellom stigen og prøver, og kjøre gelen over natten (16 timer, 55 V) i 1 x TBE ved romtemperatur.
  6. Flekk gelen i et vannbad inneholdende etidiumbromid (0,3 ug ml -1) i 20 min.
    Merk: Etidiumbromid er ansett som en potent mutagen og et giftstoff. Ta kontakt med HMS-datablad før arbeidet påbegynnes og ikke håndterer det før alle advarsler er lest og oppfattet.
  7. Visualisere DNA med en langbølget UV transilluminator og kutte ut hvert kjørefelt fragment med en rett, selv kuttet, noe som minsker inkludering av overflødig agarose på hver side av kjørefeltet.
    Merk: For eksempel, hvis fragment av interesse er 5,5 kb, kuttet en 7,5 cm fragment å inkludere DNA-fragmenter fra 5 kb til omtrenteligEly 12 kb (se figur 3A).
  8. Plasser utskåret gel kjørefelt i en gel brett på 90 ° til retningen av DNA migrasjon.
    Merk: To rader med 3 gel fragmenter kan passe i en 25 x 25 2 cm gel skuffen. Den første raden med gel baner er på toppen av skuffen, andre rad på 12,5 cm.
  9. Fremstille 300 ml agarose for den andre dimensjon gel (0,9% i 1 x TBE med 0,3 ug ml -1 etidiumbromid). Når agarose avkjøles til 50 ° C, pipette den smeltede agarose gel rundt skivene til å størkne sin stilling. Hell resten av agarose i skuffen til en dybde som er minst på nivå med gel skiver.
  10. Så snart gelen er størknet, electrophorese ved 4 ° C i 1 x TBE inneholdende 0,3 ug ml -1 etidiumbromid ved 220 V, inntil DNA har vandret ca. 10 cm.
    Merk: 4 timer er tilstrekkelig for et 5,5 kb-fragment, men et mindre fragment vil trenge mindre tid.
  11. Skjære blokkene hvor genomisk DNA er tilstede usynge kanten av et metall linjal, inkludert gel ovenfor det å inkludere de DNA som ikke er synlig (se figur 3C).

5. Southern Hybridisering

  1. løsning Forberedelse
    1. Forbered depurinering buffer (0,125 M HCl-løsning).
      Merk: Denne bufferen kan brukes på nytt og som er stabilt ved romtemperatur i opp til en måned.
    2. Forbered Denaturering buffer (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH).
      Merk: Denaturering buffer kan brukes på nytt en gang, og er stabil i inntil 3 måneder ved romtemperatur.
    3. Forbered Nøytralisering buffer (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris). Juster til pH 7,5 med HCl.
      Merk: Nøytralisering buffer kan brukes på nytt en gang, og er stabil i inntil 3 måneder ved romtemperatur.
    4. Forbered 10x Saline natriumcitrat (SSC) buffer (0,15 M Tri-natriumcitrat, 1,5 M NaCl, pH-verdi er 7 - 8) for bruk i trinn 5.2.4 og 5.2.6. Fra denne buffer, lage et 2 x SSC lager (for bruk i trinn 5.2.9).
      Merk: 10x SSC og 2x SSC enre stabil ved RT i 3 måneder.
    5. Forbered Modifisert Church og Gilbert Hybridisering buffer 19 (0,5 M fosfatbuffer [pH 7,2], 7% (w / v) natriumdodecylsulfat (SDS), 10 mM EDTA). La ved 65 ° C for å oppløse grundig før bruk.
  2. Overføre
    1. Skyll det utskårede gel blokkene i depurinering løsning i 10 minutter ved RT på en vippe eller orbitalrister. Hold omrøringshastighet lavt for å unngå å skade agarose blokker.
    2. Skyll gel blokkene kort med destillert vann og deretter med denaturering buffer i 30 min. Skyll igjen raskt i destillert vann, og deretter inkuberes gel blokkene i nøytralisering buffer i 30 minutter med forsiktig omrøring ved romtemperatur.
    3. Skjær en nylonmembran til den nøyaktige størrelse av gelen (e). Skjær et nick i øvre høyre hjørne for å bistå i å orientere membranen i fremtidige trinn.
      Merk: To gel blokker (6 prøver) kan visualiseres på en membran.
    4. Hell nok 10x SSC i en tray, slik at det ikke vil tørke ut over natten. Skape en plattform ca. 5 cm over nivået av bufferen. Mette 3 ark med 3MM kromatografi papir med 10x SSC og plass på plattformen. Kutt kromatografi papiret slik at den er lang nok til å bli nedsenket i buffer ved begge ender og bred nok til å passe membranen på gelen.
    5. Plasser gel (e) på toppen av den mettede kromatografi papiret. Ramme gelen med plastfolie for å hindre at buffer by-passing gelen under overføringen. lå forsiktig kuttet membran på toppen av gelen (e). Fjerne luftbobler mellom membranen og gelen ved å rulle en flaske eller serologisk pipette forsiktig over membranen.
    6. Skjær tre ark av 3 MM papir-kromatografi til samme størrelse som membranen. Mette kromatografi papirark med 10x SSC og legg på toppen av membranen. Fjern eventuelle luftbobler som har dannet.
    7. Stack tørkepapir minst 5 cm høye på toppen av trekkpapir etterfulgt av en solid støtte (approximate vekt på 1 kg for en 23 x 16 cm membran). Tillate overføring for å fortsette over natten.
    8. Utsette membranen (DNA-siden opp) til 1200 J / m2 av UV å tverrbinde DNA til membranen. Ikke skyll før dette trinnet.
    9. Skyll membranen grundig i 2x SSC for å forebygge høyt bakgrunnen på blot bildene. Bruk blot umiddelbart for hybridisering (se 5.3) eller tørke det ved RT, pakk i plastfolie og oppbevar ved 4 ° C.
  3. hybridisering
    1. Forvarm hybridisering stekeovn og flasker til 55 ° C.
    2. Legg 100 ug ml -1 bovint serumalbumin (BSA) og 10 ug ml -1 ikke-spesifikk DNA (som laksesperma DNA) til den forvarmes hybridiseringsbuffer.
    3. For å muliggjøre jevn dekning av den hybridiseringsbuffer når membranen er rullet opp, plasser blot på en tilsvarende dimensjonert kvadratet av nylon mesh med DNA-bundet side av membranen som vender oppover. Rull blot langs langsiden. Lysbildeblot / gitter inne i en hybridisering flaske. Tilsett en passende mengde av forvarmet hybridiseringsbuffer å rulle den blot (for eksempel 30 ml av en 23 x 16 cm 2-membran).
    4. Inkuber i en forvarmet ovn, roterende flaskene, i 1 time.
    5. Fremstille sonden ved å blande 50 ng av renset PCR-produkt homolog med regionen av interesse, 150 ng av tilfeldige heksamerprimere, buffer for Klenow-fragmentet og H 2 O for å lage et volum på 13 pl. Kok i 3 minutter og deretter plassere umiddelbart på is. Tilsett 1 mL av en mM dCTP / dGTP / dTTP mix, 1 mL av Klenow fragment (5U) og 50 pCi deoxyadenosine 5'-trifosfat radiomerket på alpha fosfat (α 32P-dATP).
    6. Inkuber ved romtemperatur i 1 time. Tilsett 1 mL av en mM dNTP mix og 1 mL av Klenow fragment. Inkuber i 20 minutter ved RT.
    7. Kok sonde i 5 minutter og tilsett umiddelbart til hybridiserings-rør. Hybridisere over natten ved 55 ° C med rotasjon.
    8. Dekanter probe fra membran.
      Merk: Sonden er i stand til å brukes om igjen en gang.
    9. Skyll membranen kort i forvarmet, lav stringens vaskebuffer (2x SSC, 0,1% (w / v) SDS). Legg frisk lav stringens vaskebuffer og inkuber i 5 minutter ved 55 ° C med rotasjon. Gjenta.
    10. Vask to ganger i medium stringens vaskebuffer (1 x SSC, 0,1% (w / v) SDS) i 10 minutter ved 55 ° C med rotasjon.
    11. Vask to ganger i høy stringens vaskebuffer (0,1 X SSC, 0,1% (w / v) SDS) i 5 minutter ved 55 ° C med rotasjon.
    12. Fjerner membranen og DAB med vevet for å fjerne overskudd av væske. Pakk i plast sikre det er ingen gjenværende fuktighet på plastfolie og legg i eksponering kassett med en pre-slukket lagring fosfor skjermen. Lukk kassett og utsett i minst 2 timer før visualisering ved hjelp av en fosforavbilder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den Frøs er en induserbar, stedsspesifikke nucleoprotein blokk som gjør at replikering mellom å bli visualisert i levende celler 12,18. En generell eksperimentell design for prøvetaking celler er illustrert i figur 1. Tidspunktet for prøvetaking og variasjoner i genetisk bakgrunn gjør dette til et allsidig system for å studere reparasjon av en slik blokk. Den skjematiske illustrerer hvordan temperatursensitive mutanter som DnaB-ts og dnaC ts som er blitt anvendt tidligere, 18 kan benyttes i dette systemet.

Induksjonen av Fros ble utført i en E. coli-stamme som vist i Figur 1 for ikke-temperatursensitive stammer. For å bekrefte at en nucleoprotein blokk hadde blitt etablert, celler ble visualisert ved hjelp av fluorescens mikroskopi etter en time av veksten i 0,1% arabinose. Dettetidsramme er vanligvis tilstrekkelig for å fremstille blokken i en villtypestamme, men mer krevende stammer kan kreve optimalisering. De fleste av cellene inneholdt en fokus (figur 2A, + ara), tilsvarende bare én kopi av matrisen inne i cellen og derved indikerer replikasjon hadde blitt blokkert. Antallet av celler med en fokus, 2 brennpunkter eller mer enn 2 foci ble tellet i en befolkning på mer enn 100 celler. 92% av cellene ble funnet å ha en fokus med de resterende 8% med 2 foci. Det ble antatt at celler som hadde to brennpunktene plassert godt fra hverandre, som representerer to kopier av array, ville ha den neste runden av replikering blokkert. Celler med to brennpunkter i nærheten av hverandre bety at gruppen har nylig blitt kopiert og nucleoproteins blokken har ennå ikke blitt oppnådd.

Nucleoproteins blokken ble reversert ved tilsetning av anhydrotetracycline (AT) og påfølgende duplisering av oppstillingen visualisert somakkumulering av celler med multiple brennpunkter (figur 2A, + ara / AT). Flere foci i en celle visualisert ved fluorescens microcopy betegne gruppen har blitt kopiert og tilstrekkelig tid har gått for å tillate loci for å bevege seg fra hverandre, overvinne enhver søster kromosom kohesjon som var til stede. I dette tilfellet, 10 minutter etter tilsetningen av AT, 94% av cellene hadde 2 eller flere brennpunkter, og opp til 8 brennpunkter per celle ble visualisert.

For å sikre at nucleoproteins blokken gjorde faktisk hemmer replikasjon, ble cellenes levedyktighet analysert (figur 2B). Celler som har hatt replikasjon inhiberes av de Fros viser en ca 1000 gangers reduksjon i kolonidannende enheter sammenlignet med celler som ikke ble dyrket i nærvær av arabinose. Celler som deretter ble dyrket i nærvær av anhydrotetracycline viser reverseringen av denne veksthemming. Dersom cellene ikke var i stand til å reparere DNA etter frigjøringav nucleoproteins blokkering, vil en reduksjon i levedyktighet resultat.

For å visualisere de replikasjonsmellomprodukter, kan celler lyseres i løpet av agaroseplugger og proteinet og RNA fjernet. DNA kan deretter bli spaltet med et egnet restriksjonsenzym for området av interesse. DNA som er avbildet på figur 3A ble spaltet med EcoRV som spalter DNA umiddelbart før matrisen, i matrisen, og etter at matrisen for å gi 5,5 kb og 6,7 kb fragmenter i området av interesse (figur 3B). Fragmenter er ideelt ~ 3-7 kb til protokollen beskrevet her. Fragmenter utenfor dette området kan kreve endring av agarose anvendte konsentrasjoner og elektroforese betingelser for å oppnå god separasjon. DNA ble elektroforesebehandlet i den første dimensjon og visualisert (figur 3A). Dersom DNA er helt fordøyd, vil alle baner har kjørt jevnt og det vil væreen stor mengde av lav molekylvekt (mindre enn ca. 3 kb, avhengig av restriksjonsenzymet). DNA som er tilstede i brønnen antyder ufullstendig cellelysering og en masse av høy molekylvekt-DNA (over 10 kb) antyder ufullstendig DNA-fordøyelse.

DNA av interesse i hvert felt ble skåret ut. I figur 3A, ble DNA ovenfor 5 kb inkludert. Den etterfølgende andre dimensjon av gelen ble elektroforisert, noe som resulterer i en diagonal av lineært DNA (figur 3C). Matrisen DNA i denne gel ble deretter visualisert ved Southern hybridisering (figur 3D). I den ublokkerte (- ara prøve), kan to flekker sees, svarende til 5,5 kb og 6,7 kb fragmenter av matrisen, som forventet. Prøven som hadde replikasjon blokkert (+ ara) viste en reduksjon i den 5,5 kb sted i sammenligning, og tilsetningen av en elliptisk signal, som indikerer en opphopning av Y-formet DNA i prøven. Signalet erlokalisert til én posisjon, som betegner replikering gaflene arrestere i et lignende sted i hele befolkningen. Ved tilsetning av anhydrotetracyline, kan den Y-formede DNA-signalet ikke lenger bli sett. En ny start er indikert ved nærværet av et signal av hele Y-bue, som viser gaflene migrere gjennom regionen.

Det er viktig å normalisere DNA i hver agarose plugg for å sikre at signalene fra prøvene er jevne. Signalene kan kvantifiseres med passende bildebehandlingsprogrammer. En annen vanlig mellom sett er at indikerer Holliday krysset (HJ) formasjon. En HJ visualiseres som en kjegle signal på toppen av den Y-buen og en pigg fra den lineære DNA ved enden av buen Y (figur 3D).

Figur 2
Figur 2: Fluorescensmikroskopi og Viab ility. (A) En E. coli-stamme som bærer det Teto matrisen ble dyrket ved 30 ° C i nærvær av 0,1% arabinose (Ara +) i 1 time og deretter anhydrotetracycline (AT) ble tilsatt i 10 minutter til en subpopulasjon å frigjøre replikasjonsblokken. Representative mikrografer er vist for YFP produksjon (øverste panel). Scale bar = 2 mikrometer. Andelen av celler som bærer 1, 2 eller flere enn 2 foci ble nummerert og er presentert som en prosentandel (lavere panel). (B) celler dyrket i fravær av arabinose (- ara), med arabinose (+ ara) og med begge arabinose og anhydrotetracycline (AT; 10 min) ble serie fortynnet 10 ganger og enten flekket eller spredt på bare agar som inneholdt ampicillin ( - / + ara prøver) eller ampicillin med anhydrotetracycline (+ aT prøve) og dyrket ved 30 ° C for å bestemme cellenes levedyktighet. Top: representant plate som viser vekst på angitte fortynninger. Bunn: Grafen viser gjennomsnittlig CFU / ml +/- SEM.ww.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Fig. 3: Visualisering av DNA-replikasjon mellomprodukter ved en nukleoprotein blokk (A) Genomisk DNA fra celler (1, - ara, 2, + ara, 3, + ara / AT) som ble lysert i agaroseplugger og spaltet med EcoRV restriksjonsenzym ble separert på en 0,4% agarosegel (55 V, 16 timer). 3 kb, 5 kb og 10 kb band er angitt. DNA ovenfor 5 kb markør ble spaltet som angitt ved de hvite boksene. (B) Skjematisk av EcoRV fordøye av tabellen regionen. Replikasjonsgafler som kommer inn i matrisen fra origo bli blokkert inne i 5,5 kb-fragmentet når cellene er dyrket i nærvær av arabinose. Restriksjonsseter benyttet er angitt med piler og det array er vist som en boks med linjer. (C) Et spaltet DNA ble rotert 90 ° og separert i en 0,8% agarose-gel (220 V, 4 timer). Den hvite boksen indikerer eksisjon av DNA etter separasjon. (D) Matrisen region ble deretter visualisert ved hjelp av Southern blot-analyse ved anvendelse av en radioaktiv probe til array-regionen. Celler med en replikering blokk i denne stillingen vil ha signal svarende til 5,5 kb fragmentet ligger på Y-buen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone Sigma-Aldrich 16922 Growth media component
Sodium Chloride VWR 27810.364 Growth media component
Yeast extract Sigma-Aldrich 92144 Growth media component
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 Growth media component; Potassium buffer component
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786 Growth media component; Potassium buffer component
L-Arabinose Sigma-Aldrich A3256 For induction of TetR-YFP production
Anhydrotetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich 37919 Release of replication bloackage
Axioskop 2 Fluorescence microscope Zeiss 452310 Visualization of cells
eYFP filter set Chroma Technology 41028 Visualization of YFP
CCD camera Hamamatsu Orca-AG Visualization of cells
MetaMorph  Software (Molecular Devices) SDR Scientific 31282 Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript
Agarose Bioline BIO-41025 For agarose plugs and gel electrophoresis
Original Glass Water Repellent (Rain-X) Autobarn DIO1470 For agarose plug manufacture
TRIS VWR VWRC103157P TE, TBE buffer component
Ethylene diaminetetraacetic acid Ajax Finechem AJA180 0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Bacteriostatic agent
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 TE buffer component
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 Cell lysis buffer component
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl) Sigma-Aldrich L5125 Cell lysis and ESP buffer component
Rnase A Sigma-Aldrich R6513 Cell lysis buffer component
Lysozyme Amresco 6300 Cell lysis buffer component
Proteinase K Amresco AM0706 ESP buffer component
Sub-Cell Model 192 Cell BioRad 1704507 Electrophoresis system
UV transilluminator 2000 BioRad 1708110 Visualization of DNA
Ethidium Bromide BioRad 1610433 Visualization of DNA
Boric acid VWR PROL20185.360 TBE component
Hybond-XL nylon memrbane Amersham RPN203S Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used
3MM Whatman chromatography paper GE Healthcare Life Sciences 3030690 Southern blotting
HL-2000 Hybrilinker UVP 95-0031-01/02 Crosslinking of DNA and hybridization
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm Sigma-Aldrich 31149 Hybridization buffer component
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 Denaturation buffer component
Trisodium citrate dihydrate VWR PROL27833.363 Transfer buffer
Sodium dodecyl sulphate (SDS) Amresco 227 Wash buffer component
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906 Hybridization buffer component
Random Hexamer Primers Bioline BIO-38028
Klenow fragment New England BioLabs M0212L
dNTP Set Bioline BIO-39025
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP PerkinElmer BLU502A
Storage Phosphor Screen GE Healthcare Life Sciences GEHE28-9564-76 BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35 cm x 43 cm screen
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Life Sciences 28-9558-09 Visualization of blot
Hybridization bottle UVP 07-0194-02 35 mm x 300 mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Replication fork stalling at natural impediments. Microbiol Mol Biol Rev. 71, (1), 13-35 (2007).
  2. Gupta, M. K., et al. Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (18), 7252-7257 (2013).
  3. McGlynn, P., Guy, C. P. Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro. J Mol Biol. 381, (2), 249-255 (2008).
  4. Tanner, N. A., et al. Single-molecule studies of fork dynamics in Escherichia coli DNA replication. Nat Struct Mol Biol. 15, (2), 170-176 (2008).
  5. Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457, (7227), 336-339 (2009).
  6. Rudolph, C. J., Upton, A. L., Lloyd, R. G. Replication fork stalling and cell cycle arrest in UV-irradiated Escherichia coli. Genes Dev. 21, (6), 668-681 (2007).
  7. Jeiranian, H. A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inefficient replication reduces RecA-mediated repair of UV-damaged plasmids introduced into competent Escherichia coli. Plasmid. 68, (2), 113-124 (2012).
  8. Le Masson, M., Baharoglu, Z., Michel, B. ruvA and ruvB mutants specifically impaired for replication fork reversal. Mol Microbiol. 70, (2), 537-548 (2008).
  9. Wang, X., Liu, X., Possoz, C., Sherratt, D. J. The two Escherichia coli chromosome arms locate to separate cell halves. Genes Dev. 20, (13), 1727-1731 (2006).
  10. Lau, I. F., et al. Spatial and temporal organization of replicating Escherichia coli chromosomes. Mol Microbiol. 49, (3), 731-743 (2003).
  11. Gordon, G. S., et al. Chromosome and low copy plasmid segregation in E. coli: visual evidence for distinct mechanisms. Cell. 90, (6), 1113-1121 (1997).
  12. Possoz, C., Filipe, S. R., Grainge, I., Sherratt, D. J. Tracking of controlled Escherichia coli replication fork stalling and restart at repressor-bound DNA in vivo. EMBO J. 25, (11), 2596-2604 (2006).
  13. Payne, B. T., et al. Replication fork blockage by transcription factor-DNA complexes in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 34, (18), 5194-5202 (2006).
  14. Brewer, B. J., Fangman, W. L. The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae. Cell. 51, (3), 463-471 (1987).
  15. Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. Visualization of UV-induced replication intermediates in E. coli using two-dimensional agarose-gel analysis. J Vis Exp. (46), (2010).
  16. Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol. 98, (3), 503-517 (1975).
  17. Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA damage-induced replication fork regression and processing in Escherichia coli. Science. 299, (5609), 1064-1067 (2003).
  18. Mettrick, K. A., Grainge, I. Stability of blocked replication forks in vivo. Nucleic Acids Res. (2015).
  19. Church, G. M., Gilbert, W. Genomic sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, (7), 1991-1995 (1984).
  20. Michel, B., Grompone, G., Flores, M. J., Bidnenko, V. Multiple pathways process stalled replication forks. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (35), 12783-12788 (2004).
  21. Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. Recombination proteins and rescue of arrested replication forks. DNA Repair (Amst). 6, (7), 967-980 (2007).
  22. Carl, P. L. Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA. Mol Gen Genet. 109, (2), 107-122 (1970).
  23. Nawotka, K. A., Huberman, J. A. Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons. Mol Cell Biol. 8, (4), 1408-1413 (1988).
  24. Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control. J Mol Biol. 103, (1), 39-59 (1976).
Indusere en Stedsspesifikk Replication Blokkering i<i&gt; E. coli</i&gt; Ved hjelp av en fluoriserende Repressor Operator System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mettrick, K. A., Lawrence, N., Mason, C., Weaver, G. M., Corocher, T. A., Grainge, I. Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System. J. Vis. Exp. (114), e54434, doi:10.3791/54434 (2016).More

Mettrick, K. A., Lawrence, N., Mason, C., Weaver, G. M., Corocher, T. A., Grainge, I. Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System. J. Vis. Exp. (114), e54434, doi:10.3791/54434 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter