We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.
The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.
Hydrogeler er tredimensionale netværk dannet af hydrofile tværbundne polymerer, som er naturligt eller syntetisk, og karakteriseret ved en karakteristisk tredimensional struktur. Disse enheder er mere attraktive i de biomedicinske områder drug delivery, tissue engineering, genbærere og intelligente sensorer 1,2. Faktisk deres høje vandindhold, såvel som deres reologiske og mekaniske egenskaber gør dem egnede kandidater til at efterligne blødt væv mikromiljøer og gør dem effektive redskaber til vandopløseligt cytokin eller vækstfaktor levering. En af de mest lovende anvendelse er som en injicerbar biomateriale transporterer celler og bioaktive forbindelser. Hydrogeler kan forbedre celleoverlevelse og kontrol stamceller skæbne ved at holde og præcist at levere stamcelle regulatoriske signaler i en fysiologisk relevant måde, som observeret i in vitro og i in vivo eksperimenter 3,4. Den førende Fordelen ved dette er mulighedenat opretholde injicerede celler i zonen af inokulering (in situ), minimere mængden af celler, der forlader området og ekstravaserer i kredsløbssystemet torrent, migrerer over hele kroppen og miste målet mål 5. Stabiliteten af de tredimensionale hydrogel net skyldes dens tværbindingssteder, der dannes ved kovalente bindinger eller kohæsive kræfter blandt polymerkæderne 6.
Inden for disse rammer, retvinklede selektiv kemi anvendt på polymer kæder er et alsidigt værktøj stand til at forbedre hydrogel forestillinger 7. Faktisk kunne modifikation af polymerer med egnede kemiske grupper medvirke til at give passende kemisk, fysisk og mekaniske egenskaber, der kan forbedre cellernes levedygtighed og deres anvendelse i formation væv. På samme måde, blandt de teknikker til at indlæse celler eller vækstfaktorer i gelmatrixen, anvendelsen af RGD peptid giver forbedringer i celleadhæsion og overlevelse. RGD er et tripeptid sammensataf arginin, glycin og asparaginsyre, som er langt den mest effektive og ofte ansat tripeptid grund af sin evne til at behandle mere end én celle adhæsion-receptor og dens biologiske virkning på celle forankring, adfærd og overlevelse 8,9. I dette arbejde, er syntesen af RGD-funktionaliserede hydrogeler undersøgt med det formål at designe net karakteriseret ved tilstrækkelige biokemiske egenskaber for et gæstfrit celle mikromiljø.
Brugen af mikrobølgestråling i hydrogel syntese tilbyder en enkel procedure for at minimere sidereaktioner og opnå højere reaktionshastigheder og udbytter i en kortere periode i forhold til de konventionelle termiske processer 10. Denne metode kræver ikke rensningstrin og udbytter sterile hydrogeler på grund af de interaktioner af de polymerer og fravær af organisk opløsningsmiddel i reaktionssystemet 11. Derfor er det sikrer høje procentdele af RGD knyttet til det polymere netværk, fordi ingen modifications skal de polymere kemiske grupper, der er involveret i geldannelse. Carboxylgrupper, fra PAA og carbomer, og hydroxylgrupper, fra PEG og agarose, give anledning til hydrogelen tredimensionelle struktur gennem en polykondensationsreaktion. De nævnte polymerer anvendes til syntesen af hydrogeler i rygmarvsskader reparation behandlinger 12. Disse enheder, som rapporteret i tidligere værker 13,14, viser høj biokompatibilitet samt mekaniske og fysisk-kemiske egenskaber, der ligner dem af mange levende væv og i thixotrope egenskab. Desuden forbliver de lokaliseret in situ, ved zonen for injektion.
I dette arbejde er PAA carboxylgrupper modificeret med en alkyn del (figur 1), og en RGD-azid forbindelse syntetiseres udnytte reaktiviteten af tripeptidet terminal gruppe -NH2 med en forberedt kemisk forbindelse med struktur (CH2) n – N 3 (<strong> Figur 2). Efterfølgende den modificerede PAA reagerer med RGD-azidderivat gennem CuAAC klik reaktion 15-17 (figur 3). Brugen af en kobber (I) katalysator fører til store forbedringer i både reaktionshastigheden og regioselektivitet. Den CuAAC reaktion er meget udbredt i organisk syntese og i polymer videnskab. Den kombinerer høj effektivitet og høj tolerance over for de funktionelle grupper, og det er upåvirket af anvendelse af organiske opløsningsmidler. En høj selektivitet, hurtig reaktionstid og en enkel oprensningsprocedure tillader opnåelse af stjerne polymerer, blokcopolymerer eller kæder grafting ønskede dele 18. Dette klik strategi gør det muligt at modificere polymerer efter polymerisation for at tilpasse de fysisk-kemiske egenskaber i henhold til den endelige biokemiske ansøgning. De CuAAC forsøgsbetingelser er let at reproducere (reaktionen er ufølsom over for vand, hvorimod kobber oxidation kan forekomme minimalt), og arten afdannet triazol sikrer stabiliteten af produktet. Anvendelsen af kobbermetal kan betragtes som en kritisk punkt, på grund af sin potentielle toksiske virkning mod celler og i biologisk mikromiljø, men dialyse anvendes som rensningsmetode for at tillade fuldstændig fjernelse af katalytiske rester. Endelig PAA modificeret RGD anvendes i hydrogel syntese (figur 4) og de fysisk-kemiske egenskaber af de resulterende net undersøges, for at kontrollere den potentielle funktionalitet af disse systemer som celler eller lægemidler bærere.
Figur 1: PAA modificeret alkyn syntese En ordning af PAA funktionalisering med alkyn gruppe;. "n" angiver de monomerer med carboxylgruppe reagere med propargylamin. Klik her for at seen større version af denne figur.
Figur 2:.. RGD-azid syntese Syntesen af RGD-azidderivat Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Klik reaktion Arrangement med klik reaktion mellem RGD-azidderivat og alkyn-PAA.. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Hydrogel Synthesis. RGD funktionaliserede hydrogel syntese procedure. Klik her for at se en større version af dette tal.
The PAA post-polymerization modification with alkyne moieties and the RGD functionalization with the azide group guarantee the formation of a stable bond between the polymer and the peptide. Indeed, triazole serves as a rigid linking unit among the carbon atoms, attached to the 1,4 positions of the 1,2,3-triazole ring and it cannot be cleaved hydrolytically or otherwise. In addition, triazole is extremely difficult to oxidize and reduce, unlike other cyclic structures such as benzenoids and related aromatic heterocycles<…
The authors have nothing to disclose.
Forfattere vil gerne takke professor Maurizio Masi for frugtbar diskussion og Miss Chiara Allegretti for sprog redigering. Forfatternes forskning er støttet af Bando Giovani Ricercatori 2010 (Ministero della Salute GR-2010- 2.312.573).
Poly(acrylic acid) solution average Mw ~ 100,000, 35 wt % in H2O | Sigma Aldrich | 523925 | CAS 9003-01-4 |
Poly(ethylene glycol) 2,000 | Sigma Aldrich | 84797 | CAS 25322-68-3 |
Carbomeer 974P | Fagron | 1387083 | |
Agarose | Invitrogen Corp. | 16500-500 | UltraPure Agarose |
RGD peptide | abcam | ab142698 | |
4-azidobutanoic acid | Aurum Pharmatech | Z-2421 | CAS 54447-68-6 |
Oxalyl chloride | Sigma Aldrich | O8801 | CAS 79-37-8 |
Propargylamine hydrochloride 95% | Sigma Aldrich | P50919 | CAS 15430-52-1 |
Copper(I) iodide | Sigma Aldrich | 3140 | CAS 7681-65-4 |
Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | Y0000039 | CAS 134-03-2 |
Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
Dialysis Membrane | Spectrum Laboratories, Inc. | 132725 | Spectra/Por 3 Dialysis Membrane Standard RC Tubing MWCO: 3,5 kD |