We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.
The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.
Gli idrogel sono reti tridimensionali formate da polimeri reticolati idrofili, che sono naturali o sintetici, e caratterizzata da una struttura tridimensionale distintivo. Questi dispositivi sono sempre più interessante nel campo biomedico di drug delivery, l'ingegneria dei tessuti, portatori del gene e sensori intelligenti 1,2. Infatti, il loro elevato contenuto di acqua, come pure le proprietà reologiche e meccaniche li rendono idonei ad imitare microambienti tessuti molli e renderli strumenti efficaci per citochine idrosolubile o la crescita consegna fattore. Uno degli utilizzi più promettenti è come biomateriale iniettabile trasportano cellule e composti bioattivi. Gli idrogel possono migliorare la sopravvivenza delle cellule e il destino delle cellule staminali di controllo tenendo premuto e consegnando precisamente segnali regolatori di cellule staminali in modo rilevante fisiologico, come osservato in in vitro e in esperimenti in vivo 3,4. Il vantaggio principale di questo è la possibilitàmantenere cellule iniettate nella zona di inoculazione (in situ), minimizzando la quantità di cellule che lascia la zona e extravasates nel torrente circolatorio, migrando tutto il corpo e perdere l'obiettivo di destinazione 5. La stabilità delle reti idrogel tridimensionali è dovuto suoi siti di reticolazione, formate da legami covalenti o forze di coesione tra le catene polimeriche 6.
In questo quadro, ortogonale chimica selettiva applicata a catene polimeriche è uno strumento versatile in grado di migliorare le prestazioni di idrogel 7. Infatti, la modifica di polimeri con opportuni gruppi chimici potrebbe contribuire a fornire proprietà meccaniche chimiche appropriate, fisica e migliorare la vitalità cellulare e il loro uso nella formazione di tessuto. Allo stesso modo, tra le tecniche per caricare cellule o fattori di crescita nella matrice del gel, l'uso del peptide RGD permette miglioramenti nella adesione cellulare e la sopravvivenza. RGD è un tripeptide compostodi arginina, glicina e acido aspartico, che è di gran lunga il più efficace e spesso impiegato tripeptide grazie alla sua capacità di affrontare più di un recettore adesione cellulare e il suo impatto biologica sulla ancoraggio delle cellule, il comportamento e la sopravvivenza 8,9. In questo lavoro, la sintesi di idrogel RGD-funzionalizzato è studiato con l'obiettivo di progettare reti caratterizzate da sufficienti proprietà biochimiche per un microambiente delle cellule ospitale.
L'uso di radiazione a microonde nella sintesi idrogel offre una semplice procedura per minimizzare le reazioni collaterali e di ottenere velocità di reazione più elevate e rendimenti in un periodo di tempo più breve rispetto ai processi termici convenzionali 10. Questo metodo non richiede fasi di purificazione e rese idrogel sterili a causa delle interazioni dei polimeri e l'assenza di solvente organico nel sistema di reazione 11. Pertanto, si garantisce elevate percentuali di RGD collegati alla rete polimerica perché no modifications sono tenuti ai gruppi chimici dei polimeri coinvolti nella formazione di gel. gruppi carbossilici, da PAA e carbomer, e gruppi idrossilici, da PEG e agarosio, danno luogo alla struttura tridimensionale idrogel attraverso una reazione di policondensazione. I polimeri citati sono utilizzati per la sintesi degli idrogel nelle lesioni del midollo spinale trattamenti riparazione 12. Questi dispositivi, come riportato nel precedente opere 13,14, presentano un'elevata biocompatibilità e proprietà meccaniche e chimico-fisiche che assomigliano a quelli di molti tessuti viventi e in natura tissotropica. Inoltre, essi rimangano localizzati in situ, in corrispondenza della zona di iniezione.
In questo lavoro, PAA gruppi carbossilici vengono modificati con un residuo alchino (figura 1), e un composto RGD-azide viene sintetizzata sfruttando la reattività del gruppo terminale tripeptide -NH 2 con un composto chimico preparato con struttura (CH 2) n – N 3 (<strong> Figura 2). Successivamente, il PAA modificato reagisce con il derivato RGD-azide attraverso CuAAC click reazione 15-17 (Figura 3). L'uso di rame (I) catalizzatore comporta notevoli miglioramenti sia la velocità di reazione e la regioselettività. La reazione CuAAC è ampiamente utilizzato nella sintesi organica e nella scienza dei polimeri. Esso combina alta efficienza e un'alta tolleranza ai gruppi funzionali, ed è influenzato dalla uso di solventi organici. Una alta selettività, un tempo di reazione veloce e semplice procedura di purificazione consentono l'ottenimento di polimeri stella, copolimeri a blocchi o catene innesto frazioni desiderate 18. Questa strategia scatto consente di modificare polimeri dopo la polimerizzazione per personalizzare le proprietà fisico-chimiche a seconda dell'applicazione finale biochimico. Le condizioni sperimentali CuAAC sono facilmente riproducibile (la reazione è insensibile all'acqua, mentre l'ossidazione del rame può verificarsi minimamente), e la natura ditriazolo formata assicura la stabilità del prodotto. L'uso di rame metallico può essere considerato un punto critico, per il suo potenziale effetto tossico sulle cellule e nel microambiente biologico, ma la dialisi è utilizzato come metodo di purificazione per consentire la completa rimozione dei residui catalitici. Infine, PAA modificato RGD è utilizzato nella sintesi idrogel (figura 4) e le proprietà fisico-chimiche delle reti risultanti sono indagati, al fine di verificare il potenziale funzionalità di questi sistemi come cellule o farmaci vettori.
Figura 1: PAA modificato sintesi alkyne Uno schema di PAA funzionalizzazione con il gruppo alkyne;. "n" indica i monomeri con gruppo carbossilico reagendo con propargylamine. Clicca qui per vedereuna versione più grande di questa figura.
Figura 2:.. RGD-azide sintesi La sintesi di derivato RGD-azide Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Clicca reazione Schema di reazione click tra RGD-azide derivato e alchini-PAA.. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Hydrogel SyntESI. RGD funzionalizzato procedura di sintesi idrogel. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
The PAA post-polymerization modification with alkyne moieties and the RGD functionalization with the azide group guarantee the formation of a stable bond between the polymer and the peptide. Indeed, triazole serves as a rigid linking unit among the carbon atoms, attached to the 1,4 positions of the 1,2,3-triazole ring and it cannot be cleaved hydrolytically or otherwise. In addition, triazole is extremely difficult to oxidize and reduce, unlike other cyclic structures such as benzenoids and related aromatic heterocycles<…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare il Prof. Maurizio Masi per la discussione proficua e Miss Chiara Allegretti per la modifica della lingua. Autori 'è supportata dal Bando Giovani Ricercatori 2010 (Ministero della Salute GR-2010- 2.312.573).
Poly(acrylic acid) solution average Mw ~ 100,000, 35 wt % in H2O | Sigma Aldrich | 523925 | CAS 9003-01-4 |
Poly(ethylene glycol) 2,000 | Sigma Aldrich | 84797 | CAS 25322-68-3 |
Carbomeer 974P | Fagron | 1387083 | |
Agarose | Invitrogen Corp. | 16500-500 | UltraPure Agarose |
RGD peptide | abcam | ab142698 | |
4-azidobutanoic acid | Aurum Pharmatech | Z-2421 | CAS 54447-68-6 |
Oxalyl chloride | Sigma Aldrich | O8801 | CAS 79-37-8 |
Propargylamine hydrochloride 95% | Sigma Aldrich | P50919 | CAS 15430-52-1 |
Copper(I) iodide | Sigma Aldrich | 3140 | CAS 7681-65-4 |
Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | Y0000039 | CAS 134-03-2 |
Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
Dialysis Membrane | Spectrum Laboratories, Inc. | 132725 | Spectra/Por 3 Dialysis Membrane Standard RC Tubing MWCO: 3,5 kD |