치료 응용 프로그램을위한 도구로 RGD-작용 히드로 겔의 합성
Summary
We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.
Abstract
The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.
Introduction
하이드로 겔은 천연 또는 합성, 및 독특한 입체 구조 특징 친수성 가교 중합체에 의해 형성되는 삼차원 네트워크이다. 이 장치는 약물 전달, 조직 공학, 유전자 사업자와 스마트 센서 1, 2의 생물 의학 분야에서 점점 더 매력적이다. 실제로, 높은 수분 함량뿐만 아니라 유동 학적 및 기계적 특성들에게 연조직 미세 환경을 모방 수용성 사이토킨 또는 성장 인자의 전달을 위해 그들에게 효과적인 도구를 만들기에 적합한 후보를 만든다. 가장 유망한 사용 중 하나는 세포 및 생물 활성 화합물을 담지 주사 생체 같다. 생체 외 및 생체 내 실험 3,4에서 관찰 하이드로 겔은 잡고 정확하게 생리 관련 방식으로 줄기 세포 규제 신호를 제공함으로써 세포 생존 및 제어 줄기 세포 운명을 향상시킬 수 있습니다. 이것의 주요 장점은 가능성신체를 통해 모든 마이그레이션 및 대상 목표 (5)를 잃고, 순환 토런트로 지역과 extravasates 잎 세포의 양을 최소화 (현장에서) 접종의 영역 내 주입 된 세포를 유지합니다. 삼차원 네트워크 하이드로 겔의 안정성은 고분자 사슬 6 간의 공유 결합 또는 응집력에 의해 형성의 가교 부위에 기인한다.
이 프레임 워크에서는 직교 선택적 화학 고분자 사슬에 적용이 하이드로 겔 공연 (7)을 개선 할 수있는 다목적 도구입니다. 실제로, 적절한 화학기를 갖는 중합체의 변형은 세포 생존 및 조직 형성에서의 사용을 향상시키기 위해 적절한 화학적, 물리적 및 기계적 성질을 제공하도록 도울 수있다. 동일한 방식으로, 기술 중 RGD 펩티드의 사용은 세포 부착 및 생존율의 개선을 허용 겔 매트릭스 내에 세포 성장 인자를로드한다. RGD는 구성된 트리 펩티드이다지금까지 아르기닌, 글리신, 아스파르트 산, 가장 효과적인 인해 종종 하나 이상의 세포 부착 수용체를 처리 할 수있는 능력 및 세포 정박 동작 생존 8,9에 생물학적 충격 트리 펩티드를 사용. 본 연구에서는 RGD-작용 하이드로 겔의 합성은 친절 세포 미세 환경에 대한 충분한 생화학 적 특성을 특징으로 네트워크를 설계하는 목적으로 연구되고있다.
하이드로 젤 합성 마이크로파 방사선의 사용은 부반응을 최소화하고, 종래의 열 공정 (10)에 비해 짧은 시간에 높은 반응 속도 및 수율을 얻을 수있는 간단한 방법을 제공한다. 이 방법은 중합체의 상호 작용 및 반응 시스템 (11) 내의 유기 용매의 부재에 의한 정제 단계 및 수율 멸균 하이드로 겔을 필요로하지 않는다. 따라서, 어떤 모드 때문에 고분자 네트워크에 연결 RGD의 높은 비율을 보장합니다ifications 겔 형성에 관련된 고분자 화학 그룹으로 요구된다. 카르복실기, PAA와 카보 머, 하이드 록실 그룹, PEG에서 아가 로스에서 중축 합 반응을 통해 하이드로 겔 입체 구조를 야기. 언급 된 중합체는 척수 손상 수리먼트 (12) 하이드로 겔의 합성에 사용된다. 이러한 장치는 이전에보고 된 생체 적합성뿐만 아니라 많은 생체 조직들 및 요변 특성에 유사한 기계적 물리 화학적 특성을 보여, 13, 14 일. 또한, 그들은 주입의 영역에서, 현장에서 현지화 된 상태로 유지됩니다.
이 연구에서, PAA의 카르복실기 알킨 잔기 (도 1)를 수정하고 RGD 지드 화합물 구조 (CH 2) N으로 준비된 화합물과 트리 펩티드 단기 -NH (2)의 반응을 이용한 합성 – N 3 (<강한> 그림 2). 그 후, 수정 된 PAA는 CuAAC 클릭 반응 15-17 (그림 3)를 통해 RGD-아 지드 유도체와 반응한다. 구리 (I) 촉매를 사용하여 반응 속도 및 선택성 둘 다의 주요 개선 리드. CuAAC 반응은 유기 합성에서 폭넓게 중합체 과학 분야에서 사용된다. 이는 작용기 고효율 및 높은 내성을 결합하고, 유기 용매의 사용에 의해 영향을받지 않는다. 높은 선택성, 빠른 반응 시간 및 간단한 정제 과정은 원하는 부분 (18)을 이식 성 중합체, 블록 공중 합체 또는 사슬의 획득을 허용한다. 이 클릭 전략은 가능한 최종 생화학 응용 프로그램에 따라 물리 화학적 특성을 사용자 정의 할 수 중합 후 폴리머를 수정할 수 있습니다. CuAAC 실험 조건은 쉽게 (구리의 산화가 최소한으로 발생할 수있는 반면, 반응이 물에 민감하다) 재현, 그리고 자연이다졸 형성된 제품의 안정성을 보장한다. 구리 금속의 사용으로 인해 세포에 대한 잠재적 인 독성 효과 및 생물학적 미세 환경에서 중요한 점으로 간주 될 수 있지만, 투석 촉매 잔기의 완전한 제거를 허용하도록 정제 방법으로 사용된다. 마지막으로, PAA는 RGD 세포 또는 약물 담체로서 이러한 시스템의 잠재적 기능을 확인하기 위해 조사되는 하이드로 겔의 합성 (도 4) 및 생성 된 네트워크의 물리 화학적 특성에 사용되는 변성.
그림 1 : PAA는 알킨의 합성을 수정 알킨 그룹과 PAA의 작용의 방식을,. "N"은 카르복실기가 propargylamine와 반응에 단량체를 나타냅니다. 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전.
그림 2 :.. RGD-아 지드 합성 RGD-아 지드 유도체의 합성 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 반응을 클릭 제도 RGD-아 지드 유도체 및 알킨-PAA 사이 클릭 반응의.. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 히드로 겔 SYNThesis. RGD 작용 하이드로 겔 합성 절차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
The PAA post-polymerization modification with alkyne moieties and the RGD functionalization with the azide group guarantee the formation of a stable bond between the polymer and the peptide. Indeed, triazole serves as a rigid linking unit among the carbon atoms, attached to the 1,4 positions of the 1,2,3-triazole ring and it cannot be cleaved hydrolytically or otherwise. In addition, triazole is extremely difficult to oxidize and reduce, unlike other cyclic structures such as benzenoids and related aromatic heterocycles<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 언어 편집을위한 유익한 토론을위한 교수 마우리 치오 MASI 미스 키아라 Allegretti에게 감사의 말씀을 전합니다. 저자의 연구는 반도 히오바니 Ricercatori 2010 (Ministero 델라 경례 GR-2010-2312573)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Poly(acrylic acid) solution average Mw ~ 100,000, 35 wt % in H2O | Sigma Aldrich | 523925 | CAS 9003-01-4 |
| Poly(ethylene glycol) 2,000 | Sigma Aldrich | 84797 | CAS 25322-68-3 |
| Carbomeer 974P | Fagron | 1387083 | |
| Agarose | Invitrogen Corp. | 16500-500 | UltraPure Agarose |
| RGD peptide | abcam | ab142698 | |
| 4-azidobutanoic acid | Aurum Pharmatech | Z-2421 | CAS 54447-68-6 |
| Oxalyl chloride | Sigma Aldrich | O8801 | CAS 79-37-8 |
| Propargylamine hydrochloride 95% | Sigma Aldrich | P50919 | CAS 15430-52-1 |
| Copper(I) iodide | Sigma Aldrich | 3140 | CAS 7681-65-4 |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | Y0000039 | CAS 134-03-2 |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Dialysis Membrane | Spectrum Laboratories, Inc. | 132725 | Spectra/Por 3 Dialysis Membrane Standard RC Tubing MWCO: 3,5 kD |
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