Abstract
Fødevarebårne infektioner i USA forårsaget af Vibrio arter har vist en opadgående tendens. I slægten Vibrio, V. parahaemolyticus er ansvarlig for hovedparten af Vibrio-associeret infektioner. Således nøjagtig differentiering blandt Vibrio spp. og påvisning af V. parahaemolyticus er kritisk vigtigt at sikre sikkerheden for vores fødevareforsyning. Selv molekylære teknikker bliver mere og mere almindelige, er kultur-afhængig metoder stadig rutinemæssigt gjort, og de betragtes standardmetoder under visse omstændigheder. Derfor blev en hidtil ukendt kromogent agarmedium testet med det mål at tilvejebringe en bedre fremgangsmåde til isolering og differentiering af klinisk relevant Vibrio spp. Protokollen sammenlignede følsomhed, specificitet og detektionsgrænse til påvisning af V. parahaemolyticus mellem den nye kromogene medium og et konventionelt medium. Forskellige V. parahaemolyticus stammer (n = 22) repræsentere forskellige serotyper og kilde til oprindelser blev brugt. De blev tidligere identificeret ved Food and Drug Administration (FDA) og Centers for Disease Control og Forebyggelse (CDC), og yderligere verificeres i vores laboratorium ved TLH -PCR. I mindst fire separate forsøg blev disse stammer inokuleret på de chromogene agar og thiosulfat-citrat-galdesalte-saccharose (TCBS) agar, hvilket er den anbefalede medium til dyrkning af denne art, efterfulgt af inkubation ved 35-37 ° C i 24 -96 time. Tre V. parahaemolyticus stammer (13,6%) er ikke vokset optimalt på TCBS, alligevel udstillet grønne kolonier, hvis der var vækst. To stammer (9,1%) gav ikke de forventede cyan kolonier på det kromogene agar. Ikke V. parahaemolyticus stammer (n = 32) blev også testet for at bestemme specificiteten af det kromogene agar. Blandt disse stammer, havde 31 ikke vokse eller udviste andre koloni morfologier. Den gennemsnitlige inddrivelse af V. parahaemolyticus på chromogenic agar var ~ 96,4% relativt til tryptisk soja-agar suppleret med 2% NaCl. Som konklusion nye kromogent agar er et effektivt medium til påvisning V. parahaemolyticus og at skelne det fra andre vibrioner.
Introduction
Som medlem af Vibrio slægten, V. parahaemolyticus er en gram-negativ, ikke-sporedannende, buede, stavformet bakterie. Det udviser høj motilitet i både flydende og halvfaste miljøer. De fleste V. parahaemolyticus stammer er ikke-patogene for mennesker, men de patogene subtyper har forårsaget epidemier og pandemier, hvorfor denne art anses for at være en vigtig fødevarebårne patogen i mange lande 1,2. Forekomsten af Vibrio-infektion i USA har vist en opadgående tendens siden 2000 3. Blandt Vibrio spp., V. parahaemolyticus er de hyppigst rapporterede arter forårsager sygdomme i USA 4,5. Andre klinisk relevante arter omfatter V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, etc. En lille procentdel af de sygdomme forårsages af flere arter samtidigt.
V. parahaemolyticus er en naturlig, jegnhabitant af havvand og derfor vidt udbredt i marine områder i hele verden, herunder flodmundinger. Arten blev opdaget i 1950 efter et udbrud af fødevareforgiftning i Japan. I USA blev de arter først isoleret i havvand, sedimenter og skaldyr i Puget Sound regionen 6,7. Filter foderautomater i marine habitater, såsom toskallede bløddyr, kan harbor V. parahaemolyticus som en del af deres naturlige flora 8. Som sådan V. parahaemolyticus infektioner i menneskelige er ofte knyttet til forbruget af forurenet fisk og skaldyr, især råt eller utilstrækkeligt skaldyr. En mindre almindelig rute for indrejse opstår, når åbne sår er udsat for havvand, hvilket fører til hudinfektion. De fleste V. parahaemolyticus stammer ikke forårsager sygdom hos mennesker, men visse undertyper huser virulensfaktorer såsom varmestabil direkte hæmolysin (TDH) er sygdomsfremkaldende. De mest udbredte symptomer på fødevarebåren V. parahaemolyticus infektion erdiarré og mavesmerter, efterfulgt af kvalme, opkastning og feber. Hovedpine og kulderystelser er også rapporteret. Medianen Inkubationstiden er 15 timer, men kan være op til 96 timer efter indtagelse af en tilstrækkelig mængde af patogene stammer 9. Sygdommen varer fra to til tre dage. De gastroenteritis symptomer forårsaget af V. parahaemolyticus er stort set selvbegrænsende og derfor særlig behandling er ikke nødvendig. Milde tilfælde af gastroenteritis kan behandles effektivt ved oral rehydrering. Mere alvorlige sygdomme kan behandles med antibiotika, såsom tetracyclin eller ciprofloxacin 10. Dødeligheden er omkring 2% for gastroenteritis tilfælde, men kan være så høj som 29% for dem, der udvikler blodbanen infektion eller sepsis. Enhver person, der indtager skaldyr eller har åbne sår udsat for havvand er i fare for V. parahaemolyticus infektion. Jo mere alvorlig form for sygdomme, livstruende blodforgiftning, er mere almindelig i en subpopulation med underliggende medicinsk cold 11, som omfatter alkoholisme, leversygdom, diabetes, nyresygdom, malignitet og andre betingelser, der fører til en svækket immunrespons. Især denne gruppe af individer er også på et højere risiko for ordregivende alvorlige sygdomme forårsaget af V. vulnificus, som kan findes i naturlige habitater ligner V. parahaemolyticus.
V. parahaemolyticus rutinemæssigt isoleres ved anvendelse thiosulfat-citrat-galdesalte-saccharose (TCBS) agar som en selektiv og differentieret medium. Berigelse med alkalisk peptonvand kan gå forud for isolation på TCBS agar. Formodede kolonier på TCBS derefter yderligere testes i en matrix af biokemiske tests og / eller molekylære assays målrettet nærvær af artsspecifikke gener. PCR-baserede metoder bruges ofte til at bekræfte identiteten på V. parahaemolyticus ved at forstærke den termolabile hæmolysin genet, tlh 12.
Uanset hvilken lmOICE af bekræftelse metoder, er det vigtigt at have et effektivt medie til at isolere og differentiere V. parahaemolyticus fra andre marine vibrioner i første omgang. TCBS har rutinemæssigt været anvendt til at differentiere arter inden for Vibrio slægten efter evne til at fermentere sakkarose 12. Positiv fermenteringsreaktion er ledsaget af en farveændring af pH indikatoren bromthymolblåt. V. parahaemolyticus kolonier er temmelig karakteristisk på TCBS, udstiller blå til grøn farve. Dog kan dette medie ikke let skelne V. alginolyticus og V. cholerae. Saccharose-fermenterende Proteus arter kan producere gule kolonier ligner V. cholerae eller V. alginolyticus 13. Ved første isolation på TCBS, V. parahaemolyticus kan også fejlidentificerede som Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides, og Pseudomonas-arter 14. Stammer med saccharose ferm forsinketentation kan forveksles med andre saccharose nonfermenting Vibrio 13, som omfatter V. parahaemolyticus. TCBS viste sig at være ikke følsomme over for blandt andre Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens,. Flere andre arter giver grøn til grå kolonier, som potentielt forveksles med V. parahaemolyticus eller V. vulnificus 15. Som følge heraf er det ønskeligt at udvikle alternative dyrkningsmedier med bedre følsomhed og specificitet mod påvisning og isolering V. parahaemolyticus og andre nært beslægtede arter.
Flere medier alternativer er for nylig blevet udviklet. Udover medtagelse af selektive midler, mest indarbejde kromogene substrater at differentiere arter baseret på deres differentielle enzymatiske aktiviteter. For eksempel har indoxyl-β-glucosid og indoxyl-β-galactosid blevet anvendt som de chromogene substrater at differentiere V. parahaemolyticus kolonier (som synes blålig-grøn) fra dem af V. cholerae (lilla) på grund af deres differentielle evner til at producere β-glucosidase og β-galactosidase 16. Forskellige formuleringer af kromogent agar udviklet af flere grupper er blevet evalueret og rapporteret til at udføre sammenligneligt med eller bedre end TCBS 17,18,19. En fordel ved anvendelse af et kromogent medium er, at farvning af det omgivende medium er minimal hvilket letter isoleringen af bestemte kolonier. I denne undersøgelse vurderede vi evnen hos en nyformulerede kromogent medium til påvisning og isolering af V. cholerae, V. parahaemolyticus, og V. vulnificus; med særlig fokus på dens evne til at differentiere V. parahaemolyticus fra andre arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Medier og Dyrkning af mikrobielle stammer
BEMÆRK: Brug aseptisk teknik i alle eksperimenter. Brug sterile materialer. Sterilisere alle containere, værktøjer og reagens før brug. Autoklavér alle affaldsmaterialer forud for bortskaffelse, fordi de betragtes som biologisk farligt. Autoklave temperatur og tid kombination er ≥121 ° C x ≥15 min for alle de følgende procedurer.
- For at gøre ~ 1-L tryptisk agar (TSA), først tilsættes 1 L deioniseret vand i en 2-L Erlenmeyer-kolbe indeholdende en magnetisk omrører. Brug en kolbe, der er mindst to gange større end den endelige volumen. Der tilsættes 30 g tryptisk bouillon pulver og 20 g agar granulat ind i kolben.
BEMÆRK: Brug 2% agar i stedet for 1,5% for at begrænse myldrer af nogle Vibrio spp.- Bland grundigt ved at tænde for omrører. Under omrøring, tænde for varmen at koge blandingen. Fjern kolben fra ovnen, så snart blandingen begynder at koge. Løst dækker the kolbe med en tin folie. Tape folien at fastgøre den til kolben før autoklaven.
- For at gøre tryptisk soja bouillon (TSB), udelade agar fra opskriften i trin 1.1.
BEMÆRK: Kan bruge flasker i stedet for Erlenmeyerkolbe. - For at gøre tryptisk soja-agar suppleret med 2% natriumchlorid eller NaCl (TSAs), tilsættes 20 g NaCI i blandingen inden omrøring og opvarmning. For at gøre tryptisk soja-bouillon suppleret med 2% NaCl (TSBS), udelade agar, tilsættes 20 g NaCI i blandingen inden omrøring og opvarmning.
- For at gøre Brain Heart Infusion (BHI) agar, suspendere 37 g BHI pulver og 15 g agar granulat i 1 l renset vand. Varme med hyppig omrøring for at opløse pulveret. Autoklave. Udelade agar at gøre BHI-bouillon.
- For at gøre TCBS agar, suspendere 89 g af TCBS pulver i 1 liter renset vand. Heat med hyppig omrøring og kog i 1 minut for at opløse pulveret. Må ikke autoklaveres.
- For alle agarmedier, afkøle den varme agar til 45-50 ° C i et vandbad. Arrangere tomme petriskåle i stakke af fem til seks plader. Begyndende fra bunden af stakken, hæld den smeltede agar i hver petriskål til at nå omkring halvt fyldt. Luk petriskål låget efter overhældning. Tillad agaren størkner ved at lade pladerne sidde ved stuetemperatur.
- Brug agarpladerne den næste dag eller efter 12 timer. ubrugte plader opbevares i køleskab i op til to uger. Før brug fjernes pladerne ud af køleskabet og ligevægt dem ved stuetemperatur i mindst 15 min.
BEMÆRK: En-liters agar gør ~ 45 agarplader. Tillad agarpladerne at tørre tilstrækkeligt på dagen for forberedelse, og tempereres dem til stuetemperatur efter kold opbevaring for effektivt at reducere spredningen af kolonierne.
- Brug agarpladerne den næste dag eller efter 12 timer. ubrugte plader opbevares i køleskab i op til to uger. Før brug fjernes pladerne ud af køleskabet og ligevægt dem ved stuetemperatur i mindst 15 min.
- Opnå chokolade og chromogent agarplader og tempereres dem ved stuetemperatur før hvert eksperiment.
- Subkultur alle 54 mikrobielle stammer vist i tabel 1 med få days.
- Brug en steril podenål at overføre kulturer fra en frossen bestand eller en tidligere batch til selektive medier som BHI, TSB / TSA eller chokolade agar. Grow halofile Vibrio spp. på TSBS / TSAs.
- For at kontrollere renheden af kulturen, streak alle stammer i et mønster, som ville give mulighed for observation af isolerede kolonier. For eksempel bruger en trefaset striber mønster til at fortynde en stor mængde bakterier til mindre beløb, i sidste ende giver isolerede kolonier.
- Inkubér pladerne på hovedet ved 35-37 ° C i op til 48 timer. For Campylobacter spp., Inkuberes rør eller plader i et lukket låg beholder indeholdende en gas pose til at producere en mikroaerofil miljø. Overhold kolonimorfologi efter inkubation. Rene kulturer skulle give kolonier, der udviser lignende koloni morfologi.
BEMÆRK: Inkubér alle plader på hovedet for at forhindre kondenserede vanddråber dannet på undersiden af låget i at falde på colonies.
2. artsbestemmelse ved PCR
- Gennemføre tlh -PCR at bekræfte identiteten af V. parahaemolyticus stammer. Brug primere tlh -F (5 'AAA GCG GAT TAT GCA GAA GCA CTG 3') og tlh -R (5 'GCT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC 3') til at amplificere et 450 bp fragment af termolabile hæmolysin gen 20 .
- Brug en steril podenål at overføre et par isolerede kolonier af hver V. parahaemolyticus stamme fra TSAs til 5 ml TSBS. Inkuber ved 35-37 ° C i 16-24 timer.
- Centrifuger kulturer ved 14.000 x g i 1 min. Fjern supernatanten og vask pellet to gange med phosphatbufret saltvand (PBS). Kog suspensionen i 3 minutter, hvilket gav cellelysat.
BEMÆRK: V. parahaemolyticus er let at blive lyseret. lysis reagens derfor ikke påkrævet. Det er også muligt at anvende en lidt koloni direkte som templaten. - Udfør PCR i et 25-ul reaktion vlydstyrken. Forbered en reaktionsblanding indeholdende en slutkoncentration på 1 x PCR-buffer, 1,5 mM MgCl2, 100 pM af hver dNTP, 1 uM af hver primer, 1 U Taq polymerase og 1 pi cellelysat. Efter præinkubation ved 94 ° C i 5 minutter, køre 35 amplifikationscykler ved 94 ° C i 30 sek, 58 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 60 sek 21.
- Load alikvoter af 5-pi amplikon i 1,5% agarosegeler. Tænd strømforsyningen til starte elektroforese. Visualisere tilstedeværelsen eller fraværet af amplikoner under UV belysning efter farvning med ethidiumbromid.
3. Vækst på Selektiv og Differential Media
- To til fire dage før eksperimentet streak alle mikrobielle stammer vist i tabel 1 på ikke-selektivt medium (TSAs, BHI eller chokoladeagar) for koloni isolation. Pladerne inkuberes ved 35-37 ° C i 48 timer. Kontrollér renheden af kulturerne ved at observere kolonimorfologi efter inkubation. Rene kulturer skulle give kolonier, der udviser lignende koloni morfologi.
- Overfør et par isolerede kolonier fra trin 3.1 i 5 ml bouillon. Inkuber rørene ved 35-37 ° C i 16-24 timer.
BEMÆRK: Brug unge kolonier, som er mindre end fire dage gammel, til at forberede overnatskulturer i alle forsøg. - Streak en løkkefuld overnatskulturer om selektiv og differentieret medier (TCBS og kromogent agar) til koloni isolation. Pladerne inkuberes ved 35-37 ° C i op til 96 timer.
- Optag den samlede vækst i alle stammer ved at undersøge både kultur tæthed på pladen og størrelsen af isolerede kolonier. Notér Koloniernes farve under omgivende og / eller UV-lys. Bemærk andre egenskaber ved isolerede koloni såsom højde, margin og form.
4. Inddrivelse Assay
- Vælg en repræsentativ delmængde af V. parahaemolyticus stammer (n = 14), der omfatter forskellige serotyper og oprindelsen af isolation
- Gennemføre en Standard Plate Count metode af de overnattende kulturer som beskrevet nedenfor.
- Vortex at blande overnatskulturer godt. Foretag en 10 gange eller 10 -1 fortynding ved at overføre 100 pi af overnatskulturen til et rør indeholdende 900 pi PBS. Vortex for at blande godt.
- Brug en ny pipettespids til at overføre 100 pi fra 10 -1 fortynding rør til et andet rør indeholdende 900 pi PBS. Vortex for at blande godt. Dette udgør 10 -2 fortynding. Gentag processen sekventielt at opnå 10 -7 fortynding.
- Brug af 10 -4 til 10 -7 udvanding rør, plade 100 pi hver af de kromogene, TCBS og TSAs agarplader.
BEMÆRK: fortyndingsfaktor (df) på pladen bliver 10 -5 til 10 -8 hhv. - Spred portioner jævnt på than agaroverfladen.
BEMÆRK: Det er fint at bruge samme sprederen pr pres på det samme medium, så længe det mest fortyndede prøve spredes først (dvs. fra 10 -8 til 10 -5). Brug ikke den samme spreder til forskellige medier. - Pladerne inkuberes ved 35-37 ° C i op til 96 timer. Tæl kolonier på pladerne. Ignorere plader forsynet kolonier, som er for talrige til at tælle (tntc) eller mindre end 25. Beregn CFU / ml i henhold til følgende:
Hvor
N = antallet af celler i den ufortyndede rør, udtrykt som CFU / ml eller CFU / g
C = det samlede antal talte kolonier på plader, der bærer 25-300 kolonier
n 1 = antallet af pladen (er), hvor optalte kolonier fra den nedre df
n2 = antallet af pladen (er), hvor optalte kolonier fra den efterfølgende 10 ganges fortynding
df = nedre fortyndingsfaktor (dvs. mere koncentreret fortynding)
- Undersøg CFU / ml mellem forskellige medier. Brug CFU / ml på TSAs som 100%, beregne inddrivelse% af V. parahaemolyticus dyrket på det kromogene og TCBS agar.
- Gennemføre en Standard Plate Count metode af de overnattende kulturer som beskrevet nedenfor.
5. Konkurrence-assay
- Vælg en undergruppe af stammer, der udviser forskellige koloni morfologier på det kromogene og TCBS agar.
BEMÆRK: Denne måde vil det være muligt at tælle kolonier stammer fra V. parahaemolyticus kun, på trods af tilstedeværelsen af andre arter i podestoffet.- Vælg et V. parahaemolyticus stamme, der giver de forventede turkis og cyan kolonier på TCBS og det kromogene agar hhv.
- Vælg en ikke V. parahaemolyticus og en ikke Vibrio arter, som ikke vokser på hver af disse medier, eller har forskellige koloni farve.
BEMÆRK: For eksempel V. metschnikovii vokser meget svagt on TCBS og voksede ikke på det kromogene agar. Shigella sonnei vokser ikke på TCBS men giver magenta kolonier på det chromogene agar.
- Efter udvælgelsen af de ovennævnte stammer, forberede natten bouillon kulturer ved hjælp af isolerede kolonier dyrket på selektive medier.
- Lav natten kulturer af V. parahaemolyticus og V. metschnikovii ved at overføre nogle få isolerede kolonier fra TSAs til 5 ml TSBS. Inkuber ved 35-37 ° C i 16-24 timer.
- Lav natten kulturer af Shigella sonnei ved at overføre nogle få isolerede kolonier fra BHI agar til 5 ml BHI bouillon. Inkuber ved 35-37 ° C i 16-24 timer.
- For hver stamme, udføre en fortyndingsrække ligner trin 4.2.1 og 4.2.2. Plate passende fortyndinger på TSAs eller BHI at bestemme CFU / ml af natten over kultur, anvendelse af ligningen vist i trin 4.2.5.
BEMÆRK: Typisk 100 pi fra 10 -5 til 10 -7 fortyndingrør virker for de fleste kulturer. Brug CFU / ml værdier til at bakke beregne den nøjagtige mængde af celler, der anvendes i næste trin. De beregnede CFU / ml værdier opnås efter inkubation, selvom udføres følgende trin på samme dato som trin 5.3. - Brug af overnatskulturer og fortynding rør i trin 5.2 og 5.3, blande forskellige mængder af en V. parahaemolyticus stamme og en ikke V. parahaemolyticus arter. For eksempel blande 500 pi af 10 -5 fortynding tube V. parahaemolyticus med 500 pi overnight kulturer af V. metschnikovii.
BEMÆRK: Denne blanding simulerer høj mikroflora baggrund. For at simulere en lav mikroflora baggrund, bland 500 pi hver af de 10 -5 fortynding røret fra begge arter. - Spred 100 pi af blandingen hver på de chromogene, TCBS og TSAs agarplader.
- Efter inkubation ved 35-37 ° C i op til 96 timer, tæller kolonier af V. parahaemolyticus og den manglende V. parahaemolyticus arter baseret på deres forskel i vækst og kolonimorfologi på det kromogene og TCBS agar.
BEMÆRK: Hvis f.eks ikke- V. parahaemolyticus arter vokser ikke på det kromogene og TCBS agar, alle kolonier vil være af V. parahaemolyticus. Hvis den ikke V. parahaemolyticus arter vokser på begge medier, vil kun de turkise kolonier på TCBS og cyan kolonier på kromogen agar være af V. parahaemolyticus. Den ikke V. parahaemolyticus arter kan eller ikke kan udvise lignende koloni morfologi til V. parahaemolyticus i TSAs.- Hvis den ikke V. parahaemolyticus arter vokser på samme måde som V. parahaemolyticus på denne ikke-selektivt medium, opdele kimtal med to for at få tal for V. parahaemolyticus kun. Sammenlign faktiske kimtal med det forventede antal stammer fra trin 5.3.
6. Effects af Oyster Homogenater
- Afvejes ≥50 g østers kød fra ≥12 bløddyr herunder kød og spiritus.
- Tilføj samme mængde PBS til østers kød og spiritus. Blend blandingen ved høj hastighed i 90 sek. Dette udgør 2 -1 fortyndet østers homogenat.
- Tilsættes 100 g 2 -1 fortyndet østers homogenat til 400 g PBS. Brug en skala til vejning, ikke volumen. Blend blandingen ved høj hastighed i 1 min. Autoklaver østers homogenat.
BEMÆRK: Dette vil være østers homogenatet bruges til spiking.
- Gentag Recovery assay (trin 4) i tilstedeværelse af østers homogenat.
- Efter 500 g østers homogenat køler ned, tilsættes 100 ul V. parahaemolyticus overnatskulturer dyrket i TSBS til det. Bestem den faktiske mængde V. parahaemolyticus celler i inokulum ved udførelse af Standard kimtal, der er beskrevet i trin 4.2.
- Repspiser Competition assay (trin 5) i tilstedeværelse af østers homogenat.
- Efter 500 g østers homogenat køler ned, tilsættes 100 pi hver af natten kulturer af V. parahaemolyticus og ikke- V. parahaemolyticus til den. Bestem den faktiske mængde af bakteriel celler i inokulum ved udførelse af Standard kimtal procedurer beskrevet i trin 4.2
- Bland bakteriecellerne med oyster homogenat godt ved anvendelse af en homogenisator.
BEMÆRK: Efter blanding, østers homogenatet indeholder de tilsatte celler kaldes spiked østers homogenat. - Gør fortyndinger af den spidse østers homogenatet at opnå 10 -1 til 10 -3 fortyndingstrin rør i overensstemmelse med procedurerne beskrevet i trin 4.2.2. Spred 100 pi af hver fortynding på kromogene, TCBS og TSAs agar. Pladerne inkuberes ved 35-37 ° C i op til 96 timer.
- Sammenlign faktiske kimtal på kromogen og TCBS agar med exventet kimtal udledes trin 6.2.1 og 6.3.1.
BEMÆRK: Hvis f.eks et rør af V. parahaemolyticus overnatskultur indeholder 10 8 CFU / ml, et inokulum på 100 pi betyder, at 10 7 celler tilsættes til en 500 g østers homogenat, hvilket gav 5 x 10 4 celler / g. Efter fortynding og plating, den plade har df = 10 -2 bør give 500 kolonier; mens der df = 10 -3 bør give 50 kolonier. Disse er de forventede kolonitællinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne undersøgelse blev 54 mikrobielle stammer samlet, som omfattede 22 stammer i V. parahaemolyticus arter, 19 andre Vibrio arter, og 13 ikke- Vibrio arter (tabel 1). De fleste V. parahaemolyticus stammer blev enten modtaget fra FDA, CDC eller andre statslige sundhed afdelinger. De repræsenterer forskellige serotyper og isolation kilder. Disse stammer blev tidligere identificeret af de regulerende myndigheder. Vi bekræftede yderligere identiteten på disse V. parahaemolyticus ved at gennemføre en tlh -PCR 21,22.
| Arter | Antal stammer testet | Vækst og Koloniernes farve | |
| TCBS | Chromogenic medium | ||
| Aeromonas hydrophila | 2 | ingen vækst | 1 stamme ingen vækst; |
| 1 stamme magenta farve | |||
| Candida albicans | 1 | Svag vækst, gul | ingen vækst |
| Campylobacter jejuni | 1 | ingen vækst | ingen vækst |
| Escherichia coli | 1 | ingen vækst | Svag vækst, magenta |
| Proteus mirabilis | 1 | ingen vækst | ingen vækst |
| Pseudomonas aeruginosa | 2 | turkis | Gul |
| Staphylococcus aureus | 1 | Svag vækst, gul | ingen vækst |
| Salmonella choleraesuer | 1 | ingen vækst | ingen vækst |
| Shigella boydii | 1 | ingen vækst | ingen vækst |
| Shigella flexneri | 1 | ingen vækst | ingen vækst |
| Shigella sonnei | 1 | ingen vækst | Svag vækst, magenta |
| Vibrio alginolyticus | 3 | Gul eller turkis | Gul |
| V. cholerae | 4 | Gul eller turkis | Magenta |
| V. damsela | 1 | turkis | Cobalt |
| V. fisheri | 1 | Svag vækst, gul | ingen vækst |
| V. fluvialis | 1 | turkis | Cobalt |
| V.furnissii | 1 | Gul | Gul |
| V. hollisae | 1 | turkis | Gul |
| V. metschnikovii | 1 | ingen vækst | ingen vækst |
| V. mimicus | 1 | turkis | Magenta |
| V. parahaemolyticus | 22 | De fleste stammer turkis | De fleste stammer cyan; få klar |
| V. proteolyticus | 1 | turkis | Cobalt |
| V. vulnificus | 4 | Turkis eller klar | Magenta |
Tabel 1. Mikrobielle arter, der anvendes i denne undersøgelse, og deres vækst- karakteristika på selektive og differentierede medier. Color kald var based på et farvehjul. Cyan ligner teal; magenta ligner rosa lavendel, turkis ligner grøn, gul omfatter oliven og brun.
Fire særskilte forsøg blev udført for at bestemme væksten og kolonimorfologi af disse stammer på den selektive og differentierede medier - TCBS og det kromogene agar. TCBS er traditionelt medium anvendes til isolering af visse Vibrio arter, herunder V. cholerae og V. parahaemolyticus 12. Farve variation af kolonier dyrket på TCBS var gul, turkis (grøn) eller klar (figur 1).
Figur 1. Colony morfologi af Vibrio spp. på TCBS agar. V. parahaemolyticus (turkis), V. cholerae (gul), og am KOMBINERET inokulering af de to arter (a). Kolonier af V. parahaemolyticus synes turkis, med en cirkulær, hel, og konvekse morfologi (b). Klik her for at se en større version af dette tal.
Evnen af et nyt kromogent medium for at selektere for klinisk relevante Vibrio arter fra fødevarer og miljøprøver blev testet. Desuden blev evnen hos dette medium til samtidig skelne disse arter fra hinanden evalueret. Kolonifarve observeret på det kromogene agar var cobalt, cyan, magenta, gul eller klar (figur 2). Som vist i tabel 1, både TCBS og det kromogene agar udviste visse grader af selektivitet mod ikke- Vibrio mikroorganismer.
1 ">
Figur 2. Colony morfologi af Vibrio spp. på den nyudviklede chromogene agar. V. parahaemolyticus (cyan), V. cholerae (magenta), og en blandet podning af de to arter (a). Kolonier af V. parahaemolyticus synes cyan, med en cirkulær, hel, og konvekse morfologi (b). Klik her for at se en større version af dette tal.
Efter Standard Plate Count metode på anfordring kulturer, kolonier af V. parahaemolyticus blev observeret på de chromogene agarplader fik den højeste fortyndingsfaktor (dvs. df = 10 -8). Disse resultater var sammenlignelige med dem på et ikke-selektivt medium (TSAs). Dette antyder, at detektionsgrænsen for kromogene substrater ligner ikke-selektive medier, der er ca. 10 celler eller lavere i fravær af fødevarer matrix. Kapaciteten detektion for andre Vibrio arter såsom V. alginolyticus, V. fluvialis og V. frøkenen var også udmærket sammenlignet med den ikke-selektivt medium. Men nogle stammer af V. cholerae, V. vulnificus og V. mimicus viste 10- til 100-fold mindre CFU på det kromogene agar. De selektive midler anvendt i de chromogene eller andre selektive medier uundgåeligt inhibere nogle celler. Skadede celler, for eksempel, kunne ikke komme sig i selektive medier. Ikke desto mindre er lidt dårligere påvisning evne er et ikke-problem i de fleste rutinemæssige procedurer, der anvender en berigelse trin. Lille mængde af mikroorganismer i fødevarer eller miljømæssig prøve ville formere sig til et højt niveau i berigelsesbouillon, overgår detektionsgrænsen. Berigelse i alkalisk peptonvand er oftenn sker for at fastslå forekomsten af Vibrio arter i miljøprøver 12.
Ved tilstedeværelse af østers homogenat, det kromogene agar fortsatte med at vise en god grad af bedring. Med andre ord, en stor andel (> 70%) af V. parahaemolyticus celler var i stand til at vokse på det chromogene agar, upåvirket af tilstedeværelsen af østers matrix (figur 3a). Væksten og inddrivelse af V. parahaemolyticus celler blev heller ikke påvirket af tilstedeværelsen af en anden Vibrio arter (figur 3B). Dette er en vigtig egenskab, fordi miljøprøver er bundet til at indeholde forskellige Vibrio arter, som er ved høje numre især efter en berigelse procedure.
Figur 3. Procent inddrivelse af en V. parahaemolyticus stammen i østers homogenat med og uden en bakteriel konkurrent. Recovery (middelværdi ± SD) blev beregnet efter den observerede vs den forventede CFU regne agarpladerne. Forventet CFU count blev beregnet baseret på den bakterielle belastning i podestoffet. Høj inddrivelse af en V. parahaemolyticus stamme blev observeret på alle medier uden konkurrence (a). Lignende niveau for nyttiggørelse blev observeret, når høje niveauer af V. metschnikovii celler var til stede (b). Klik her for at se en større version af dette tal.
For yderligere at sammenligne den chromogene og TCBS agar, blev følsomheden og specificiteten beregnet. Tabel 2 viser evnen af disse medier til Accufor sig identificere V. parahaemolyticus. Følsomhed er relateret til den procentdel af sande positive, hvilket betyder V. parahaemolyticus stammer gav den forventede kolonimorfologi på mediet. Specificitet er relateret til den procentdel af sand negativ, hvilket betyder ikke- V. parahaemolyticus stammer bør udvise dårlig til ingen vækst, eller en anden koloni morfologi end V. parahaemolyticus. Følsomheden og specificitet for TCBS at identificere V. parahaemolyticus var 86,4% og 71,8%, henholdsvis. Til sammenligning følsomheden og specificiteten af det kromogene medium var 90,9% og 96,9%, henholdsvis.
| en) | ||
| TCBS agar | V. parahaemolyticus | Ikke-V. parahaemolyticus |
| God vækst og turkis colonies | 19 | 9 |
| Dårlig vækst eller ikke-turkis kolonier | 3 | 23 |
| b) | ||
| kromogent agar | V. parahaemolyticus | Ikke-V. parahaemolyticus |
| God vækst og cyan kolonier | 20 | 1 |
| Dårlig vækst eller ikke-cyan kolonier | 2 | 31 |
Tabel 2. Sensitivitet og specificitet TCBS (a) og chromogent (b) agar til påvisning af V. parahaemolyticus. identiteter V. parahaemolyticus blev tidligere bestemt af biokemisk test og tlh- PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse fokuserer på dyrkningsmedier udvikling og evaluering. Konventionelt, TCBS er det selektive og differentierede medie, der anvendes til at isolere og afsløre V. parahaemolyticus, V. cholerae og V. vulnificus 12. Imidlertid er der rapporteret begrænsninger for dette medium, såsom den manglende evne til at differentiere V. cholerae fra andre Vibrio arter. Saccharose og pH-indikator er differentiering agenter for TCBS. Således syreproduktion ved saccharose fermentor forårsager farveændring af mediet. Farvning af mediet er en ulempe ved TCBS fordi det kan sløre observation af kolonimorfologi. Den nyudviklede kromogent medium udnytter høj pH og saltindhold at undertrykke væksten af ikke Vibrio arter, der findes i mange marine prøver. Den nye kromogene medium har en endelig pH på 8,6 ± 0,2. Per liter deioniseret vand, den består af 10 g pepton, 10 g havsalt blanding, 10 g oksegalde, 10 g natriumthiosulfat, 5 g gærekstrakt, 5 g natriumcitrat, 2,2 g natriumcarbonat, 2 g lactose, 0,5 g natriumpyruvat, 0,3 g af et chromogent blanding og 15 g agar. Den chromogene blanding tillader differentiering blandt Vibrio spp. i henhold til deres differentierede evner til at producere bestemte enzymer. Stedet for at ændre farven på TCBS agarmedium, forskellige Vibrio spp. ville udvise forskellige koloni farve på den nye kromogene medie. Til sammenligning indeholder en kommercielle kromogene substrater 15 g agar, 8 g pepton og gærekstrakt, 51,4 g af salte, 0,3 g af et chromogent mix og en endelig pH på 9,0 ± 0,2.
Robustheden af et assay evaluering afhænger af stikprøvestørrelsen. Da denne undersøgelse lægger vægt på effektiviteten af den nye kromogene medie at isolere og opdage V. parahaemolyticus, er det vigtigt at samle mange forskelligartede V. parahaemolyticus stammer. Tidligere studier, der sammenligner TCBS ogny kultur medier ofte involveret miljø- eller mad prøver indeholdende ukendte typer og mængden af mikroorganismer 23,24,25,26. Flere kolonier per prøve blev isoleret endnu den klonale natur af isolaterne var ofte ikke fastsat. Ideelt set bør forskellige stammer testes i assayudvikling ellers nøjagtigheden af assayet ville være oppumpet. Stamme identitet kan fastslås ved konventionelle subtypning metoder såsom pulset-felt-gelelektroforese (PFGE) eller multi-locus sekventering. V. parahaemolyticus stammer i denne undersøgelse blev tidligere præget af ribotyping og PFGE 19.
Under assay udvikling, sensitivitet, specificitet og detektionsgrænsen er blandt de vigtigste faktorer, der skal undersøges. Følsomhed, også kendt som nøjagtighed eller diagnostisk sensitivitet, er den positive procent mellem reference- og prøvningsmetoder. Specificitet, også kendt som præcision eller diagnostisk specificitet, er den negative procent om Greement mellem reference- og prøvningsmetoder. I denne undersøgelse anvendte vi PCR-metode som referencemetode fordi resultaterne blev kontrolleret mellem forskellige grupper. TCBS og kromogene medier var de testmetoder. For at bestemme følsomheden resulterer fra V. parahaemolyticus stammer blev anvendt, dvs Følsomhed = 100% x Ægte Positiv / (True Positive + Falsk negativ). På den anden side, er et resultat af manglende V. parahaemolyticus stammer blev anvendt til at bestemme specificiteten; og dermed Specificitet = 100% x Sand Negative / (sand negativ + Falsk positiv). At give mere pålidelige specificitet resultater, ikke- V. parahaemolyticus stammer skal isoleres fra et miljø, hvor prøvetagning vil blive gennemført. Vores følsomhed og specificitet beregninger er baseret på dokumenter skrevet af regeringen 27, den akademiske verden 28 og videnskabelige organisation 29 om et emne relateret til assay udvikling og validering.
nt "> Baseret på vores resultater viste kromogene medium bedre ydeevne end TCBS i identifikationen af V. parahaemolyticus. Den samlede procent aftale mellem referencemetoden og kromogene medie er 94,4% sammenlignet med 77,8% mellem referencemetoden og TCBS. følsomheden og specificiteten af det kromogene medie er 90,9% og 96,9% henholdsvis, hvilket er større end TCBS (86,4% og 71,9%, henholdsvis). Tidligere undersøgelser evaluerer andre kromogene medier til påvisning af V. parahaemolyticus fandt, at følsomheder varierede 85-88%, mens særlige varierede fra 94 til 95% 23,24,25. Men disse undersøgelser ikke bruge den samme beregningsmetode som vores undersøgelse. Endvidere de brugte nogle gange en anden referencemetoden eller de kombinerede resultater fra både biokemisk analyser og chromogent medium som en testmetode. som følge heraf er det vanskeligt direkte at sammenligne vores resultater med disse tidligere undersøgelser.V. parahaemolyticus, kunne det kromogene agar anvendt i denne undersøgelse også differentiere flere Vibrio arter end TCBS grund af optagelse af et kromogen mix på mellemlang formel, hvilket giver flere farver. Selv om det var ikke fokus for denne undersøgelse at opdage V. cholerae og V. vulnificus, er det værd at bemærke, at magenta kolonier udstillet af disse arter kan yderligere differentieres ved fluorescens under UV. En begrænsning for at bruge det chromogene agar til påvisning af V. cholerae og V. vulnificus er dens tilsyneladende lave opsving for disse arter. For at omgå dette problem, skal en berigelse trin inkluderes. En anden mulig begrænsning af det kromogene agar er dens kortere holdbarhed end TCBS. Løbende optimering af dette nye medie er nødvendig for at opretholde pH under opbevaring.
Trods af populariteten af molekylære teknikker, Kultur-afhængig metoder er stadig værdifulde da de ofte er billigere og har en bedre detektionsgrænse. Disse dyrkningsmetoder kan anvendes som et screeningsværktøj. Omvendt kan de anvendes til at bekræfte identiteten og levedygtighed mikroorganismer følgende molekylære analyser. At opregne bakterier via en kultur-afhængig tilgang, er Standard Plate Count anerkendt som standard metode. Den i trin 4.2.5 ligning er en mere præcis måde at bestemme CFU / g eller CFU / ml end gennemsnit CFU'er fra forskellige fortyndingsfaktorer. Det er vigtigt at bemærke, at alle fortyndingsmidler og medier i hele procedurerne skal være tilstrækkeligt salt til at opretholde levedygtigheden af halofile bakterier, såsom V. parahaemolyticus. Inkubationstemperatur og miljø skal være optimal for bakterievækst.
Den kromogene medie er designet til at detektere Vibrio arter, som er vigtige humane patogener. Derfor skal yderligere undersøgelser udføres for at determine dens effektivitet til at opdage andre miljømæssige Vibrio arter, der ikke er medicinsk relevant. I fremtidige applikationer, kan den nye kromogene agar indarbejdes i rutinemæssig afprøvning af miljøprøver til V. parahaemolyticus. Dette kan gøres ved direkte striber af prøver på det chromogene agar til påvisning for tilstedeværelsen af formodede V. parahaemolyticus. Det kromogene agar kan også anvendes til at optælle V. parahaemolyticus følgende fortyndinger. Kvantificering kan også estimeres ved at udføre en Most Probable Number fremgangsmåde under anvendelse berigelsesbouillon, efterfulgt af udstrygning på det kromogene agar til bekræftelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker M. Channey, E. Chau, og K. Tomas for deres bistand på projektet. Projekt forsyninger blev delvist finansieret af California Polytechnic State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Equipment | |||
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | may use other brands |
| Autoclave | Any | ||
| BHI powder | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | may use other brands |
| Blender | Any | to blend oyster meat | |
| CampyGen gas generator | Hardy Diagnostics | CN035A | to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands |
| Chocolate agar plates | Hardy Diagnostics | E14 | may use other brands |
| Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) | Any | or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014) | |
| Culture tubes | Fisher Scientific | S50712 | may use other brands |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | S348903 | may use other brands |
| Gel doc | Any | ||
| HardyChrom Vibrio agar plates | Hardy Diagnostics | G319 | This study evaluates this medium |
| Incubator | Any | ||
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-606 | 10 microliter-size was used in this study |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | may use other brands |
| Oysters | Any | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | may use other brands |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | may use other brands |
| Pipette and tips | Any | Sterilized tips | |
| Primers for tlh | IDT DNA | ||
| Scale | Any | ||
| Spreader | Fisher Scientific | 08-100-11 | Beads may be used instead |
| Stomacher blender | Stomacher | 400 | Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec. Other homogenizer can be used. |
| Sterile filter bags for blenders | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS powder | Hardy Diagnostics | 265020 | This study evaluates this medium |
| Thermocycler | Any | ||
| TSB powder | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | may use other brands |
| UV viewing cabinet | Any | Emit long-wave UV light | |
| Water bath | Any | |
|
| Name | Sources | Catalog Number | Comments |
| Bacterial species and strains | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| Escherichia coli | ATCC | ||
| Proteus mirabilis | ATCC | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| Shigella boydii | ATCC | ||
| Shigella flexneri | ATCC | ||
| Shigella sonnei | ATCC | ||
| Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) | FDA, ATCC | ||
| V. damsela | FDA | ||
| V. fisheri | Environment | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| V. furnissii | CDC | ||
| V. hollisae | FDA | ||
| V. metschnikovii | ATCC | ||
| V. mimicus | FDA | ||
| V. parahaemolyticus (serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc.) | ATCC, FDA, CDC, Environment | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| V. vulnificus | FDA |
References
- Yeung, P. S., Boor, K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).
- Yeung, P. S. M., Boor, K. J. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. Faruque, S. M. , Caister Academic Press. 153-184 (2012).
- Centers for Disease Control and Prevention. Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food - Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010. Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).
- Centers for Disease Control and Prevention. Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008. , Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591 (2008).
- Scallan, E., et al. Foodborne illness acquired in the United States - major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).
- Baross, J., Liston, J. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State. Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).
- Baross, J., Liston, J. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific. Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).
- Kueh, C. S., Chan, K. Y. Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster. J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).
- Food and Drug Administration. Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , Second Edition, (2012).
- Qadri, F., et al. Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus. J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).
- Food and Drug Administration. Quantitative risk assessment on the public health impact of Vibrio parahaemolyticus in raw oysters. , Available from: http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/ResearchAreas/RiskAssessmentSafetyAssessment/ucm050421.htm (2005).
- Food and Drug Administration. Bacteriological analytical manual online. , Available from: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070830.htm (2004).
- MacFaddin, J. F. Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, Williams & Wilkins. Baltimore, Md. (1985).
- Bottone, E. J., Robin, T. Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features. J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).
- Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms. Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).
- Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).
- Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).
- Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus. J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).
- Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).
- Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).
- Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish. J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).
- Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates. Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).
- Duan, J., Su, Y. -C. Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).
- Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus. Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).
- Canizalez-Roman, A., Flores-Villaseñor, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Leòn-Sicairos, N. Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples. Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).
- Kriem, M. R., et al. Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains. Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).
- Food Drug Administration. Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests. http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).
- Burd, E. M. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).
- World Organisation for Animal Health. Principles and methods of validation of diagnostic assays for infectious diseases. , Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/1.01.05_VALIDATION.pdf (2013).
