Abstract
Vibrio türlerinin neden olduğu ABD'de Gıda kaynaklı enfeksiyonlar artış eğilimine göstermiştir. Cins Vibrio, V. parahaemolyticus Vibrio -associated enfeksiyonların çoğunluğu sorumludur. Böylece, Vibrio türleri arasında doğru farklılaşma. ve V. algılama parahaemolyticus gıda arzının güvenliğini sağlamak için büyük önem taşımaktadır. moleküler teknikler giderek daha yaygın olmakla birlikte, kültür-bağlı yöntemleri hala rutin yapılır ve bunlar bazı durumlarda standart yöntemler olarak kabul edilir. Bu nedenle, yeni bir kromojenik agar ortamı izolasyon ve klinik olarak anlamlı Vibrio spp farklılaşması için daha iyi bir yöntem sağlamak amacı ile test edilmiştir. Protokol V. tespiti için duyarlılık, özgüllük ve algılama limitini karşılaştırıldı Yeni kromojenik orta ve geleneksel bir ortam arasında parahaemolyticus. Çeşitli V. parahaemolyticus suşları (n = 22), yenidenfarklı serotipleri ve kökenlerden kaynağını sunan kullanılmıştır. Daha önce Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) ve Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) tarafından tanımlanan ve ayrıca tlh -PCR tarafından laboratuvarda doğrulanmıştır. En az dört ayrı deneylerde, bu suşlara 24 için 35-37 ° C 'de inkübasyon takip kromojenik agar tiyosülfat-sitrat safra tuzları sakaroz, bu tür kültürlenmesi için tavsiye edilen orta (TCBS) ağar, üzerine aşılanmıştır -96 saat. Üç V. Büyüme varsa parahaemolyticus suşları (% 13.6) yine, TCBS üzerinde optimum büyümek yeşil koloniler sergiledi vermedi. İki suş (% 9.1) kromojenik agar üzerinde beklenen camgöbeği kolonileri vermemiştir. Olmayan V. parahaemolyticus suşları (n = 32), aynı zamanda kromojenik agar özgünlüğünü belirlemek için test edildi. Bu suşların arasında, 31 büyüyecek ya da diğer koloni morfolojileri sergilenmektedir vermedi. V. ortalama geri chromoge üzerinde parahaemolyticusnic Agar ~% 2 NaCl ile desteklenmiş triptik soya agar% 96.4 akrabasıydı. Sonuç olarak, yeni kromojenik ağar V. algılamak için etkili bir orta parahaemolyticus ve vibrios ayırmak için.
Introduction
Vibrio cinsi, V. bir üyesi olarak parahaemolyticus Gram negatif, spor oluşturan eğik, çubuk şeklinde bir bakteridir. Sıvı ve yarı-katı ortamları yüksek hareketliliğini göstermektedir. Çoğu V. parahaemolyticus suşları insanlara patojenik olmayan, henüz patojen alt tipi bir çok ülkede 1,2 dolayısıyla bu türün önemli gıda kaynaklı patojen olarak kabul edilir salgınlara, yol açmıştır. ABD'de Vibrio enfeksiyon insidansı 2000 3 itibaren artış eğilimi göstermiştir. Vibrio spp arasında., V. parahaemolyticus ABD 4,5 yılında hastalıklara neden olan en sık bildirilen türdür. Diğer klinik olarak anlamlı türler V. dahil alginolyticus'un, V. vulnificus, V. cholerae vb hastalıkların küçük bir yüzdesi, aynı anda birden fazla türün neden olur.
V. parahaemolyticus doğal iDeniz suyu nhabitant ve bu nedenle yaygın olarak haliç dahil olmak üzere dünya çapında deniz sularında dağıttı. türler Japonya'da gıda zehirlenmesi salgını aşağıdaki 1950 yılında keşfedildi. ABD'de, türler ilk Puget Sound bölgesinde 6,7 deniz suyu, sediment, ve kabuklu deniz ürünleri izole edildi. Böyle çift kabuklu kabuklu deniz ürünleri gibi deniz habitatlarının, Filtre besleyiciler, V. liman olabilir doğal floranın 8 parçası olarak parahaemolyticus. Bu, V. olarak İnsanda parahaemolyticus enfeksiyonları genellikle kontamine deniz ürünleri, özellikle çiğ veya az pişmiş kabuklu deniz ürünleri tüketimi ile bağlantılıdır. açık yara cilt enfeksiyona yol açan, deniz suyuna maruz kaldığında giriş Daha az yaygın yol meydana gelir. Çoğu V. parahaemolyticus suşları insan hastalığına neden olmaz, henüz böyle termostabil doğrudan hemolizin (TDH) olarak virülans faktörleri barındıran bazı alt tipler patojenik bulunmaktadır. Gıda kaynaklı V. en yaygın belirtileri parahaemolyticus enfeksiyonubulantı, kusma ve ateş takip ishal ve karın ağrısı. Baş ağrısı ve titreme de bildirilmiştir. Medyan kuluçka süresi 15 saat, ama patojenik 9 yeterli miktarda tüketiminden sonra 96 saat olabilir. hastalık iki üç gün sürer. V. neden gastroenterit belirtileri parahaemolyticus büyük ölçüde kendi kendini sınırlayıcı değildir ve bu yüzden, özel bir tedavi gerekli değildir. gastroenterit Hafif vakalarda etkin bir ağızdan rehidrasyon ile tedavi edilebilir. Daha ağır hastalıklar tetrasiklin veya siprofloksasin 10 antibiyotikler ile tedavi edilebilir. Ölüm oranı gastroenterit vakaların yaklaşık% 2, ancak kan dolaşımı enfeksiyonu veya septisemi geliştirmek isteyenler için% 29 gibi yüksek olabilir. Deniz suyuna maruz kalan açık yara deniz tüketir veya sahip herhangi bir kişi V. riski altındadır parahaemolyticus enfeksiyon. hastalıklar, yaşamı tehdit eden septisemi daha şiddetli formu, altta yatan tıbbi işbirliği ile bir alt grubunda daha sık görülüralkolizm, karaciğer hastalığı, diyabet, böbrek hastalığı, malignansi ve zayıflamış bağışıklık tepkisi veren diğer sağlık durumları arasında olan şulları 11. Özellikle, bireylerin bu grup V. neden ağır hastalıklara yakalanma için daha yüksek risk altındadır da V. benzer doğal habitatların bulunabilir vulnificus, parahaemolyticus.
V. parahaemolyticus rutin seçici ve ayırıcı araç olarak tiyosülfat-sitrat safra tuzları sakaroz (TCBS) agarı kullanılarak izole edilir. Alkali pepton suda zenginleştirilmesi TCBS agarda izolasyon önce ortaya çıkabilir. TCBS ilgili olası koloniler daha sonra türe özgü genlerin varlığı hedefleme biyokimyasal testler ve / veya moleküler yöntemler bir dizi test edilir. PCR bazlı yöntemler genellikle V kimliklerini teyit etmek için kullanılan 12 tlh, termal olarak hemolisin geni yükselterek parahaemolyticus.
Ne olursa olsun chOnay yöntemlerinin Ses Bildirim, o V. izole etmek ve ayırt etmek için etkili bir ortam olması önemlidir ilk etapta diğer deniz vibrios gelen parahaemolyticus. TCBS rutin sakaroz 12 mayalanmaya kendi yeteneklerine göre Vibrio cinsi içinde türlerin ayırt etmek için kullanılır olmuştur. Pozitif fermantasyon reaksiyon pH indikatör bromtimol mavi bir renk değişikliği ile eşlik ediyor. V. parahaemolyticus koloniler yeşil renk mavi sergileyen TCBS üzerinde oldukça belirgindir. Ancak, bu orta kolaylıkla V. ayırt edemez alginolyticus'un ve V. cholerae. Sakkaroz fermente Proteus türleri V. benzeyen sarı koloniler oluşturabilir cholerae veya V'dir alginolyticus'un 13. TCBS, V. başlangıç izolasyon üzerine parahaemolyticus da Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides, ve Pseudomonas spp 14 olarak misidentified olabilir. gecikmiş sakaroz halden ile suşlarıentation V. dahil Vibrio 13 fermente diğer sakaroz ile karışabilir parahaemolyticus. TCBS diğerleri arasında Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens'in karşı değil, duyarlı olduğu tespit edilmiştir. Birkaç diğer türler potansiyel V ile karıştırılmamalıdır gri koloniler yeşil verim parahaemolyticus ya da V. vulnificus 15. Bunun bir sonucu olarak, tespit ve V izole karşı daha iyi hassasiyet ve özgüllük ile alternatif bir kültür ortamı geliştirilmesi arzu edilmektedir parahaemolyticus ve diğerlerinin yanında yakın ilişkili tür.
Çeşitli medya alternatifleri son zamanlarda geliştirilmiştir. Seçici maddelerin dahil edilmesi ek olarak, en ayırıcı enzimsel faaliyetlerin göre türlerin ayırt etmek için kromojenik substratlar içermektedir. Örneğin, indoksil-β-glukozit ve indoksil-β-galaktozid V ayırt etmek için kromojenik substratlar olarak kullanılmaktadır paragrafV. olanlardan (mavimsi-yeşil görünür) haemolyticus kolonileri nedeniyle diferansiyel yetenekleri (mor) cholerae β-glukozidaz ve β-galaktosidaz 16 üretmek. Çeşitli gruplar tarafından geliştirilen kromojenik agar Farklı formülasyonları değerlendirilmiştir ve nispeten veya TCBS 17,18,19 daha iyi performans bildirilmiştir. kromojenik ortam kullanmanın bir avantajı, çevreleyen ortamın renk ve böylece belirli bir koloni izolasyonu kolaylaştırmak az olmasıdır. Bu çalışmada, V tespit etmek ve izole etmek için yeni formüle kromojenik ortamın yeteneği değerlendirildi cholerae, V. parahaemolyticus ve V. vulnificus; V. ayırt etme yeteneği üzerine özel bir odaklanma ile Diğer türlerden parahaemolyticus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Medya ve Mikrobiyal Suşlarının Kültürleme
NOT: Tüm deneylerde kullan aseptik teknikler. Steril malzemeler kullanıyoruz. Kullanmadan önce tüm kaplar, alet ve reaktifi sterilize edin. biyolojik tehlikeye kabul edilir çünkü atmadan önce tüm atık maddeleri otoklavlayın. aşağıdaki prosedürleri için otoklav sıcaklık ve zaman kombinasyonu ≥121 ° C x ≥15 dk.
- ~ 1-L triptik soya agar (TSA) yapmak için, önce bir manyetik karıştırma çubuğu içeren 2 L'lik bir Erlenmeyer şişesi içinde deiyonize su 1 L ilave edin. nihai hacim daha az iki kat daha büyük olan bir şişeyi kullanarak. triptik soya suyu tozu 30 g ve şişeye granüller agar 20 g ekleyin.
NOT:% 2 ağar yerine% 1.5 bazı Vibrio spp swarming sınırlamak için.- karıştırıcı açarak iyice karıştırın. Karıştırılırken, karışımın kaynamasına ısı açın. Karışım kaynamaya başlar kısa sürede ısıtıcı şişeyi çıkarın. Gevşek inci kapakBir kalay folyo ile e şişesi. otoklav önce balona sabitlemek için folyoyu bantlayın.
- triptik soya suyu (TSB) yapmak için, adım 1.1 tarifi agar atlayabilirsiniz.
NOT: yerine Erlenmeyer şişesinde şişe kullanabilir miyim. - % 2 sodyum klorür ya da NaCI (TSA'lar) ile desteklenmiş triptik soya agar yapmak için, önce, karıştırma ve ısıtma karışımın NaCl 20 g ekleyin. % 2 NaCI (TSBs) ile desteklenmiş triptik soya suyu yapmak için, agar ihmal önceden karıştırma ve ısıtma karışımın NaCl 20 g ekleyin.
- , Beyin kalp infüzyon (BHI) agarı hale BHI tozu 37 g saf su, 1 L 15 gr agar granüller askıya almak için. sık ajitasyon ile ısı tozu çözmek için. Otoklav. BHI suyu yapmak için agar atlayın.
- , TCBS agar hale saf su, 1 L TCBS tozu 89 g askıya almak için. 1 dakika boyunca sık sık ajitasyon ve kaynatın ile ısı tamamen tozu çözmek için. otoklavlamayın.
- Tüm ağar ortamlar için, 45-5 sıcak agar serinBir su banyosu içinde 0 ° C ile. beş-altı plakalar yığınlarının boş Petri plakaları düzenleyin. yığının altından başlayarak, yaklaşık yarım dolu ulaşmak için her Petri plakasına erimiş agar dökün. döküldükten sonra Petri plaka kapağını kapatın. agar plakaları oda sıcaklığında oturup izin vererek katılaşmaya izin verin.
- Agar plakaları ertesi gün ya da 12 saat sonra kullanın. iki haftaya kadar buzdolabında kullanılmayan tabak saklayın. Kullanımdan önce, buzdolabı plakaları kaldırmak ve en az 15 dakika boyunca oda ısısında dengeye.
NOT: Bir litre agar ~ 45 agar plakaları yapar. Agar plakaları hazırlama gününde, yeterli miktarda kurumasına ve etkili bir şekilde koloni yayılmasını azaltmak için, soğuk depolamadan sonra, oda sıcaklığına kadar bunları dengelenmeye gelmeye bırakın.
- Agar plakaları ertesi gün ya da 12 saat sonra kullanın. iki haftaya kadar buzdolabında kullanılmayan tabak saklayın. Kullanımdan önce, buzdolabı plakaları kaldırmak ve en az 15 dakika boyunca oda ısısında dengeye.
- Çikolata ve kromojenik agar elde edilir ve her bir deney öncesi oda ısısında dengeye.
- Tablo 1'de her birkaç da gösterilen 54 mikrobiyal suşları altkültürüys.
- donmuş bir hisse senedi veya böyle BHI, TSB / TSA veya çikolata agar olarak seçici olmayan medya bir önceki partiden kültürleri aktarmak için steril bir aşılama döngü kullanın. Halofilik Vibrio spp büyütün. TSBs / TSA'larm üzerinde.
- kültür saflığını kontrol etmek için, çizgi izole kolonilerin gözlem için izin verecek bir desen tüm suşlar. Örneğin, en sonunda izole koloniler veren, daha az miktarda bakteri büyük miktarda seyreltik üç fazlı bir çizilme kalıbı kullanın.
- kadar 48 saat süreyle 35-37 ° C'de plakalar baş aşağı inkübe edin. Campylobacter spp., Tüpler veya plakalar inkübe Bir gaz keseyi içeren bir kapalı kapak kavanoza bir mikroaerofilik bir ortam oluşturmak için. kuluçkadan sonra koloni morfolojisi gözlemleyin. Saf kültürler benzer koloni morfolojisi sergileyen koloniler boyun eğmek zorundadır.
NOT: col üzerine düşen kapağın alt kısmında oluşan yoğunlaşmış su damlacıkları önlemek için tüm plakaları baş aşağı inkübeonies.
PCR ile 2. Türler Belirlenmesi
- V. kimliğini doğrulamak için tlh -PCR Davranış parahaemolyticus suşları. Kullanım primerleri -F (5 'AAA GCG GAT TAT GCA GAA GCA CTG 3') ve tlh-R (5 'GTT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC 3') termal olarak hemolisin geni 20 bir 450-bp fragmanı amplifiye etmek için tlh .
- Her V. birkaç izole koloniler aktarmak için steril bir aşılama döngü kullanın TSA'lar ile ilgili TSBs 5 ml parahaemolyticus soyu. 16-24 saat boyunca 35-37 ° C'de inkübe edin.
- Santrifüj kültürleri 1 dakika için 14,000 x g'de. Süpernatantı ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile iki kez pelet yıkayın. Hücre lizatı elde etmek için 3 dakika boyunca bir süspansiyon kaynatılır.
NOT: V. parahaemolyticus lize edilmesi kolaydır. Bu nedenle, liziz reaktifi gerekli değildir. Şablon olarak doğrudan koloni biraz kullanmak da mümkündür. - 25-ul reaksiyon v PCR gerçekleştirinolume. 1x PCR tampon maddesi bir son konsantrasyon, 1.5 mM MgCl2, her dNTP, 100 uM, her bir primerden 1 uM, 1 U Taq polimeraz ve hücre lizatı 1 ul ihtiva eden bir reaksiyon karışımı hazırlandı. 30 saniye, 30 saniye için 58 ° C, 60 saniye 21 ° C 72 94 ° C'de 35 amplifikasyon döngüleri çalıştırmak 5 dakika boyunca 94 ° C'de ön-kuluçka sonrası.
- % 1.5 agaroz jelleri içinde 5-il amplikon yük alikotları. elektroforez başlatmak için güç kaynağı açın. etidyum bromid boyama işlemi sonrası UV ışıması altında amplikonların varlığını ya da yokluğunu görselleştirme.
Seçici ve Diferansiyel Medya 3. Büyüme
- Iki ila dört gün önce deney, çizgi koloni izolasyonu için seçici olmayan ortam (TSA'lar BHI veya çikolata agar) Tablo 1 'de gösterilen tüm mikrobiyal soylar. 48 saat boyunca 35-37 ° C'de inkübe edin. kuluçkadan sonra koloni morfolojisi gözlemleyerek kültürleri saflığını kontrol. Saf kültürler benzer koloni morfolojisi sergileyen koloniler boyun eğmek zorundadır.
- suyu 5 ml Aşama 3.1 birkaç izole koloniler aktarın. 16-24 saat boyunca 35-37 ° C'de inkübe edin.
NOT: en az dört gün geçmiş kullanın genç koloniler, tüm deneylerde gecede kültürleri hazırlamak. - Streak koloni izolasyonu için seçici ve diferansiyel medya (TCBS ve kromojenik agar) gecede kültürlerin bir öze. 96 adete kadar saat 35-37 ° C'de inkübe edin.
- plaka üzerinde kültür yoğunluğu ve izole kolonilerin boyutunu hem de inceleyerek tüm suşlar genel büyüme kaydetmesi. çevre sıcaklığı ve / veya UV ışığı altında Kolonilerin rengi kaydedin. Böyle yükseklik, kenar boşluğu ve form olarak izole koloninin diğer özelliklerini unutmayın.
4. Kurtarma Testi
- V. temsili bir alt kümesini seçin parahaemolyticus suşları farklı serotipler ve izolasyon kaynağını kapsamaktadır (n = 14)
- aşağıda tarif edildiği gibi bir gecede kültürlerin bir standart Plaka Sayısı yöntemini yürütün.
- Vortex iyice gecede kültürleri karıştırın. 900 ul PBS içeren bir tüp içine gecelik kültüründen 100 ul aktarılarak 10 kat veya 10 -1 seyreltme sağlayın. Vortex iyice karıştırın.
- 900 ul PBS içeren başka tüpe 10 -1 seyreltme tüpünden 100 ul aktarmak için yeni bir pipet ucu kullanın. Vortex iyice karıştırın. Bu 10 -2 seyreltme oluşturmaktadır. 10 -7 seyreltme elde etmek için işlem sırayla tekrarlayın.
- 10 -4 -7 10 seyreltme tüpleri kullanarak, kromojenik, TCBS ve TSA'larm agar plakaları üzerinde 100 ul her plaka.
NOT: plaka üzerinde seyreltme faktörü (df) 10 -5 sırasıyla -8 ila 10 olur. - t eşit hacimde yaymakO yüzeye ağar.
NOT: Bu en seyreltilmiş kısım ilk yayılır sürece, aynı ortamda suş başına aynı serpme kullanmak gayet (yani, 10 -8 -5 10 ila). Farklı ortamlar için aynı dağıtıcısı kullanmayın. - 96 adete kadar saat 35-37 ° C'de inkübe edin. plakalar üzerinde koloniler sayın. çok saymak çok sayıda (TNTC) ya da / ml aşağıdakilere göre 25. hesaplayın CFU az olan koloniler taşıyan plakaları görmezden:
Nerede
N, seyreltilmemiş bir tüp içinde hücre sayısı = / g CFU / ml veya CFU olarak bahsedildi
C 25-300 koloni taşıyan plakalar üzerinde sayılan koloni sayısını =
n, 1 sayılan koloniler düşük df olan plaka (lar) sayısı =
n, 2 sayılan koloniler daha sonra 10-kat seyreltme vardır plaka (lar) sayısı =
df alt seyreltme faktörü = (yani, daha konsantre seyreltme)
- Farklı medya arasında CFU / ml karşılaştırın. % 100 olarak TSA'larda CFU / ml kullanın V.% kurtarma hesaplamak parahaemolyticus Kromojenik ve TCBS-Agar kültür.
- aşağıda tarif edildiği gibi bir gecede kültürlerin bir standart Plaka Sayısı yöntemini yürütün.
5. Rekabet Tahlili
- kromojenik ve TCBS agarda farklı koloni morfolojileri sergileyen soyların bir alt kümesini seçin.
NOT: şekilde, koloniler V. kökenli saymak mümkün olacaktır aşı maddesi için başka türlerin mevcudiyetine rağmen, sadece parahaemolyticus.- Bir V Seç sırasıyla, TCBS ve kromojenik agarda beklenen turkuaz ve mavi koloniler verir parahaemolyticus süzün.
- Olmayan bir V seçin parahaemolyticus bu ortamın da büyür veya farklı koloni rengi sergilemeyen olmayan bir Vibrio türü.
Not: Örneğin, V. metschnikovii o çok zayıf büyürn TCBS ve. kromojenik agarda büyümek değildi Shigella sonnei TCBS üzerinde büyüyecek ama kromojenik agarda kırmızı kolonileri verir vermez.
- Yukarıdaki suşların seçildikten sonra, seçici olmayan ortamda gelişen izole koloniler kullanarak bir gecede suyu kültürleri hazırlamak.
- V. gecelik kültürleri yapmak parahaemolyticus ve V. TSA'lar ile ilgili TSBs 5 ml birkaç izole koloniler aktararak metschnikovii. 16-24 saat boyunca 35-37 ° C'de inkübe edin.
- BHI suyu 5 ml BHI agar birkaç izole koloniler aktarılarak Shigella sonnei gecelik kültürleri yapmak. 16-24 saat boyunca 35-37 ° C'de inkübe edin.
- her bir suş için Adımlar 4.2.1 ve 4.2.2 benzer bir seyreltme serisi yerine getirir. TSA'larm veya BHI Plaka uygun dilüsyonları Adım 4.2.5 gösterilen denklem kullanılarak, gecede kültür CFU / ml belirlemek için.
NOT: Genellikle, 10 -5 10 -7 seyreltme 100 ultüpler çoğu kültürler için çalışıyor. bir sonraki aşamada kullanılan hücreler tam miktarını hesaplamak geri CFU / ml değerleri kullanın. Aşağıdaki adımlar, Aşama 5.3 ile aynı tarihte gerçekleştirilir, ancak hesaplanan mi CFU / değerler, kuluçkadan sonra elde edilir. - Adım 5.2 ve 5.3 içinde gece boyunca kültürler ve seyreltme tüpleri kullanılarak, bir V farklı miktarlarda karıştırmak parahaemolyticus zorlanma ve olmayan bir V. parahaemolyticus türleri. Örneğin, V. 10 -5 seyreltme tüpünden 500 ul karışımı V. gece boyunca kültürler 500 ul parahaemolyticus metschnikovii.
NOT: Bu karışım yüksek mikroflora arka plan taklit eder. Düşük mikroflora arka plan simüle iki türün 500 ul 10 -5 seyreltme tüpün her karıştırmak için. - kromojenik, TCBS ve TSA'larm agar plakaları üzerinde karışımın 100 ul her yayıldı.
- 35-37 ° C'de inkübasyondan sonra 96 saat kadar V. kolonileri saymayın için parahaemolyticus ve olmayan V. kromojenik ve TCBS agarda büyüme ve koloni morfolojisi onların farkına dayalı parahaemolyticus türler.
NOT: Örneğin, eğer olmayan V. parahaemolyticus türler tüm kolonileri V. olacak, kromojenik ve TCBS agarda büyümek değil parahaemolyticus. Olmayan V. ise parahaemolyticus türler hem medya yetişir, kromojenik agarda TCBS ve camgöbeği koloniler sadece turkuaz kolonileri V. olacak parahaemolyticus. Olmayan V. parahaemolyticus türler ya da V. benzer koloni morfolojisi sergilemek olmayabilir TSA'larm üzerinde parahaemolyticus.- Olmayan V. ise parahaemolyticus türleri V'a Benzer büyür Bu seçici olmayan ortamda parahaemolyticus, V. numaralarını elde etmek için iki ile koloni sayısı bölmek Sadece parahaemolyticus. Adım 5.3 türetilen beklenen sayısı ile gerçek koloni sayısını karşılaştırın.
6. Effİstiridye homojenatlarma ECTS
- et ve içki de dahil olmak üzere ≥12 mollusk kabuklu ≥50 g istiridye et tartılır.
- istiridye et ve içki PBS eşit miktarda ekleyin. 90 sn için yüksek hızda karışımı karıştırın. Bu 2 -1 seyreltilmiş istiridye Homojenat oluşturmaktadır.
- PBS 400 g 2 -1 seyreltildi istiridye homojenat 100 g ekleyin. kilo değil, hacim ölçmek için bir ölçek kullanın. 1 dakika için yüksek hızda karışımı karıştırın. istiridye Homojenat Otoklav.
NOT: Bu spiking için kullanılan istiridye Homojenat olacaktır.
- istiridye homojenat mevcudiyetinde kurtarma deneyi (Aşama 4) tekrar edin.
- 500 gr istiridye Homojenat soğuduktan sonra, V. 100 ul ekleyin buna TSBs yetiştirilen gecelik kültürler parahaemolyticus. V. gerçek miktarını belirlemek Adım 4.2 açıklanan Standart Plaka Sayısı prosedürleri yaparak inokulum olarak parahaemolyticus hücreleri.
- temsilciistiridye homojenat varlığında rekabet analizi (Aşama 5) yer.
- 500 gr istiridye Homojenat soğuduktan sonra, V. gecede kültürlerin her ul 100 eklemek parahaemolyticus ve olmayan V. buna parahaemolyticus. Bakteriyel gerçek miktarını belirlemek Standart Plaka Sayısı prosedürleri yaparak inokulum hücreler Adım 4.2 tarif
- iyi bir homojenleştirici kullanarak istiridye homojenat ile bakteri hücreleri karıştırın.
NOT: karıştırıldıktan sonra, denir kasıtlı eklenen hücreleri içeren istiridye homojenat istiridye Homojenat çivili. - Çivili istiridye Homojenat seyreltileri Aşama 4.2.2'de açıklanan prosedürlere göre 10 -1 -3 10 seyreltme tüpleri elde edilmesini mümkün kılar. Kromojenik, TCBS ve TSA'lar agara her seyreltme oranından 100 ul yayıldı. 96 adete kadar saat 35-37 ° C'de inkübe edin.
- eski ile kromojenik ve TCBS agarda gerçek koloni sayısını karşılaştırınbeklenmeyen koloni sayımı 6.2.1 ve 6.3.1 Adımlar çıkarılabilir.
Not: Örneğin, V bir tüp parahaemolyticus Gece boyunca kültür 10 8 CFU / mL, 100 ul'lik bir aşı 10 7 hücreleri 5 x 10 4 hücre / g, istiridye homojenat 500 g ilave edilir demektir içerir. Seyreltme ve sonra kaplama, plaka df sahip = 10 -2 500 koloniler vermelidir; Bu sahip df ise = 10 -3 50 koloniler boyun eğmek zorundadır. Bunlar beklenen koloni sayımı vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada, 54 mikrobiyal soylar V olan 22 suşu olan monte edilmiştir parahaemolyticus türleri, diğer 19 Vibrio türü, 13 dışı Vibrio türü (Tablo 1). Çoğu V. parahaemolyticus suşları ya FDA, CDC ya da diğer devlet sağlık birimlerinden gelen bulundu. Onlar farklı serotipleri ve izolasyon kaynaklarını temsil etmektedir. Bu suşlar, daha önce düzenleyici kurumlar tarafından tespit edilmiştir. Biz ayrıca bu V. kimliklerini teyit Bir TLH -PCR 21,22 yaparak parahaemolyticus.
| tür | Suşların sayılı test | Büyüme ve Kolonilerin rengi | |
| TCBS | Chromogenic orta | ||
| Aeromonas hydrophila | 2 | Büyüme yok | 1 Hiçbir büyümeyi süzün; |
| 1 suşu eflatun rengi | |||
| Candida albicans | 1 | Zayıf büyüme, sarı | Büyüme yok |
| Campylobacter jejuni | 1 | Büyüme yok | Büyüme yok |
| Escherichia coli | 1 | Büyüme yok | Zayıf büyüme, eflatun |
| Proteus mirabilis | 1 | Büyüme yok | Büyüme yok |
| Pseudomonas aeruginosa | 2 | Turkuaz | Sarı |
| Staphylococcus aureus | 1 | Zayıf büyüme, sarı | Büyüme yok |
| Salmonella choleraesuolduğunu | 1 | Büyüme yok | Büyüme yok |
| Shigella boydii | 1 | Büyüme yok | Büyüme yok |
| Shigella flexneri | 1 | Büyüme yok | Büyüme yok |
| Shigella sonnei | 1 | Büyüme yok | Zayıf büyüme, eflatun |
| Vibrio alginolyticus'un | 3 | Sarı ya da turkuaz | Sarı |
| V. cholerae | 4 | Sarı ya da turkuaz | eflatun |
| V. damsela | 1 | Turkuaz | Kobalt |
| V. flsheri | 1 | Zayıf büyüme, sarı | Büyüme yok |
| V. fluvialis | 1 | Turkuaz | Kobalt |
| V.furnissii | 1 | Sarı | Sarı |
| V. hollisae | 1 | Turkuaz | Sarı |
| V. metschnikovii | 1 | Büyüme yok | Büyüme yok |
| V. mimicus | 1 | Turkuaz | eflatun |
| V. parahaemolyticus | 22 | Çoğu suş turkuaz | Çoğu suş camgöbeği; açik az |
| V. proteolyticus | 1 | Turkuaz | Kobalt |
| V. vulnificus | 4 | Turkuaz ya da net | eflatun |
Tablo 1. Mikrobiyal Bu çalışmada kullanılan türler ve seçici ve diferansiyel medyada onların büyüme özellikleri. Renk çağıran ba olduBir renk tekerleği üzerinde sed. Mavi Teal benzer; eflatun pembemsi lavanta benzer, turkuaz yeşil benzer, sarı zeytin ve kahverengi kapsar.
TCBS ve kromojenik agar - Dört ayrı çalışmalar seçici ve diferansiyel medyada bu suşların büyüme ve koloni morfolojisinin belirlenmesi için yapılmıştır. TCBS V dahil olmak üzere bazı Vibrio türlerinin izolasyonu için kullanılan geleneksel orta cholerae ve V. parahaemolyticus 12. TCBS yetiştirilen kolonilerin renk değişimi, turkuaz (yeşil) ya da açık (Şekil 1) sarıydı.
Vibrio spp Şekil 1. Koloni morfolojisi. TCBS ağar. V'de parahaemolyticus (turkuaz), V. cholerae (sarı) ve am iki türün ixed aşılama (a) dır. V. Kolonileri parahaemolyticus dairesel, entire ve dışbükey morfolojisi (b) ile turkuvaz görünür. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Gıda ve çevresel örneklerden klinik olarak ilgili Vibrio türleri için seçmek için yeni bir kromojenik orta kabiliyeti test edildi. Buna ek olarak, aynı zamanda, birbirinden bu türlerin ayırmak için bu orta kabiliyeti değerlendirildi. Kromojenik agar gözlenen koloni renk kobalt, camgöbeği, macenta, sarı ya da açık (Şekil 2). Tablo 1 'de gösterildiği gibi, TCBS ve kromojenik agar hem dışı Vibrio mikroorganizmalara karşı seçicilik, belirli derecelerini göstermiştir.
1 ">
Vibrio spp Şekil 2. Koloni morfolojisi. Yeni geliştirilen kromojenik agar üzerinde. V. parahaemolyticus (mavi), V. cholerae (kırmızı) ve iki türün bir karma aşı: (a). V. Kolonileri parahaemolyticus dairesel, entire ve dışbükey morfolojisi (b) ile mavi görünür. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
V. gecede kültürleri Standart Plaka Sayısı yöntemi takiben, koloniler parahaemolyticus (yani, df = 10 -8) en yüksek dilüsyon faktörü alıcı kromojenik agar plakaları üzerine gözlenmiştir. Bu sonuçlar, bir seçici olmayan ortam üzerinde kıyaslanabilir (TSA'lar). Bu kromojenik ortamın saptama limiti yaklaşık gıda matris yokluğunda 10 hücre veya daha düşük seçici olmayan ortam, benzer olduğunu göstermektedir. Örneğin V. diğer Vibrio türler için algılama kapasitesi alginolyticus'un, V. fluvialis ve V. genç kız seçici olmayan ortama göre de iyi oldu. V. Bununla birlikte, bazı suşları cholerae, V. vulnificus ve V. mimicus 10- kromojenik agar üzerinde daha az CFU 100 kat vermiştir. kromojenik veya diğer seçilmiş medya kullanılan selektif ajanlar kaçınılmaz olarak bazı hücrelerini inhibe. Yaralı hücreler, örneğin, seçici ortam içinde geri olabilir. Bununla birlikte, biraz daha düşük algılama yeteneği bir zenginleştirme adımı istihdam çoğu rutin işlemler olmayan bir konudur. Gıda ya da çevresel numune mikroorganizmaların az miktarda tespit limiti aşan, zenginleştirme suyu yüksek bir seviyeye katlayacak. Alkali pepton suda zenginleştirilmesi ofte olduğunun çevresel numunelerde 12 Vibrio türlerinin sıklığını belirlemek için yapılır.
istiridye homojenat varlığında, kromojenik agar iyileşme iyi derecede sergilendi. Diğer bir deyişle, büyük bir bölümü (>% 70) V. parahaemolyticus hücreleri istiridye matrisi (Şekil 3a) varlığında etkilenmez, kromojenik agar üzerinde büyümeye başardık. Büyüme ve V. kazanımı parahaemolyticus hücreler de bir Vibrio türleri (Şekil 3b) mevcudiyetinde etkilenmemiştir. Çevresel örnekler, farklı Vibrio türü içeren bağlanmıştır, bu önemli bir özellik olan özellikle zenginleştirme işleminden sonra yüksek sayılar altındadır.
Şekil 3. Bir V. strong> Yüzde kurtarma ve bakteriyel rakip olmadan istiridye homojenatında parahaemolyticus süzün. Kurtarma (ortalama ± SD) agar plaklarına saymak beklenen CFU vs gözlenen göre hesaplanmıştır. Beklenen CFU sayısı inokulum bakteriyel yükü ile hesaplanmıştır. Bir V değerinde yüksek bir geri kazanım parahaemolyticus suşu rekabet olmadan tüm medya üzerinde gözlenmiştir (a). Kurtarma Benzer seviyesi V. yüksek seviyede gözlenmiştir metschnikovii hücreler (b). mevcuttu bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ayrıca kromojenik ve TCBS agar karşılaştırmak için duyarlılık ve özgüllük hesaplandı. Tablo 2 Accu bu medya kabiliyetini gösterirsi anlamlarını V. tespit parahaemolyticus. Hassasiyet V anlamına gerçek pozitif yüzdesi ile ilgilidir parahaemolyticus suşları medyada beklenen koloni morfolojisi vermiştir. Özelliği olmayan V anlamına gelmektedir, gerçek negatif yüzdesi ile ilgilidir parahaemolyticus soylar büyüme ya da V farklı koloni morfolojisi zayıf sergilemelidir parahaemolyticus. TCBS için duyarlılık ve özgüllüğü V tanımlamak için parahaemolyticus sırasıyla% 86.4 ve% 71.8 idi. Buna karşılık, kromojenik ortamın duyarlılığı ve özgüllüğü% 90.9 ve% 96.9 idi.
| a) | ||
| TCBS ağar | V. parahaemolyticus | Sigara V. parahaemolyticus |
| İyi büyüme ve turkuaz colonies | 19 | 9 |
| Zayıf büyüme veya non-turkuaz koloniler | 3 | 23 |
| b) | ||
| kromojenik ağar | V. parahaemolyticus | Sigara V. parahaemolyticus |
| İyi büyüme ve mavi koloniler | 20 | 1 |
| Zayıf büyüme veya non-mavi koloniler | 2 | 31 |
V. saptanması Tablo 2. duyarlılık ve TCBS özgüllüğü (a) ve kromojenik (b) ağar parahaemolyticus. V. kimlikleri parahaemolyticus biyokimyasal test ve tlh- PCR ile daha önce saptanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma kültür ortamı geliştirilmesi ve değerlendirilmesi üzerinde duruluyor. Geleneksel olarak, TCBS olan seçici ve orta V izole ve tespit etmek için kullanılan diferansiyel parahaemolyticus, V. cholerae ve V. vulnificus 12. Ancak, kısıtlamalar gibi V. ayrım yapamama olarak, bu ortam için rapor edilmiştir Diğer Vibrio cholerae türlerden. Sakaroz ve pH göstergesi TCBS farklılaşması maddelerdir. Böylece, sukroz fermentasyon cihazı tarafından asit üretimi ortamının renk değişikliğine neden olur. bu koloni morfolojisi gözlem gizleyebilir, çünkü orta boyama TCBS bir dezavantajı. Yeni geliştirilen kromojenik ortamı birçok deniz örneklerde bulunan dışı Vibrio türlerinin gelişimini baskılamak için yüksek pH ve tuzluluk kullanmaktadır. Yeni kromojenik ortamı 8.6 ± 0.2 bir son pH değerine sahiptir. iyonu giderilmiş su litresi başına, bu pepton 10 g, deniz tuz karışımından 10 g, öküz safra 10 g sodyum, 10 g oluşmaktadırMaya ekstresi, 5 g, sodyum sitrat, 5 g sodyum karbonat, 2.2 g, laktoz, 2 g sodyum piruvat 0.5 g, kromojenik bir karışımı, 0.3 g agar 15 g tiyosülfat. Kromojenik karışımı Vibrio türleri arasında farklılaşma sağlar. ayırıcı yeteneklerine göre belli enzimler üretmek. Bunun yerine TCBS agar ortamında farklı Vibrio spp rengini değiştiren. Yeni kromojenik ortamda farklı koloni rengi sergiler olacaktır. Buna karşın, ticari olarak temin edilebilir kromojenik ortamı agar 15 g, pepton ve maya ekstresi 8 g, tuzların 51.4 g, 0.3 kromojenik bir karışımı g ve 9.0 ± 0.2 bir son pH içerir.
bir deney değerlendirmenin sağlamlığı örneklem büyüklüğüne bağlıdır. Bu çalışmada yeni kromojenik ortamda etkinliğine vurgu beri yalıtmak ve V algılamak için parahaemolyticus, birçok farklı V. biriktirmek için önemlidir parahaemolyticus suşları. TCBS karşılaştıran Önceki çalışmalar veYeni kültür ortamları genellikle bilinmeyen türleri ve mikroorganizmaların 23,24,25,26 miktarını içeren çevresel veya gıda örnekleri çıkıyor. numune başına birden fazla koloniler izole edildi ancak izolatların klonal doğası genellikle belirsiz oldu. İdeal olarak, farklı suşları tahlil geliştirme test edilmelidir, aksi takdirde testin doğruluğu şişer. Gerilme kimliği gibi pulsed-field jel elektroforezi (PFGE) veya çoklu lokus sıralama gibi geleneksel alttiplendirmesi yöntemlerle tespit edilebilir. V. Bu çalışmada parahaemolyticus suşları daha önce Ribotyping ve PFGE 19 ile karakterize edilmiştir.
Tahlil gelişimi sırasında, duyarlılık, seçicilik ve saptama limiti araştırılması için önemli faktörler arasında yer almaktadır. Ayrıca doğruluğu veya tanı duyarlılığı olarak da bilinen Hassasiyet, referans ve test yöntemleri arasında pozitif yüzde anlaşmadır. Ayrıca hassas veya teşhis özgüllüğü olarak bilinen Özgünlük, negatif yüzde ise referans ve test yöntemleri arasında Greement. Sonuçlar farklı gruplar arasında doğrulandı, çünkü bu çalışmada, biz referans yöntem olarak PCR bazlı yöntem kullanılır. TCBS ve kromojenik medya test yöntemleri vardı. Hassasiyetini belirlemek için, V. sonucu parahaemolyticus suşları kullanıldı; yani Hassasiyet =% 100 x True Pozitif / (Gerçek Pozitif + Negatif False). Öte yandan, dışı V. sonucu parahaemolyticus suşları özgüllüğünü belirlemek için kullanıldı; ve dolayısıyla, Özgünlük =% 100 x True Negatif / (Doğru Negatif + Yanlış Pozitif). Daha güvenilir özgüllük sonuçlar sağlamak için, sivil V. parahaemolyticus suşları örnekleme yapılacaktır bir ortamdan izole edilmelidir. Bizim duyarlılık ve özgüllük hesapları tahlil geliştirme ve doğrulama ile ilgili bir konuda hükümete 27, akademi 28 ve bilimsel organizasyon 29 tarafından yazılı belgeler dayanmaktadır.
nt "> bizim sonuçlara dayanarak, kromojenik ortam V. parahaemolyticus belirlenmesinde TCBS daha iyi performans gösterdi. referans yöntem ve kromojenik ortamda arasındaki genel yüzde anlaşması referans yöntem ve TCBS arasında% 77.8 oranla,% 94.4 olduğunu. kromojenik orta duyarlılık ve özgüllüğü TCBS (% 86,4 ve% 71.9, sırasıyla) göre daha yüksek olduğu, sırasıyla% 90.9 ve% 96.9 bulunmaktadır. V. parahaemolyticus tespiti için diğer kromojenik medya değerlendiren Önceki çalışmalar hassasiyetleri değiştiğini gördüler 85% 94 23,24,25 95. Ancak, bu çalışmalar bizim çalışmamızda olduğu gibi aynı hesaplama yöntemini kullanmak vermedi gelen özgüllükleri değişmekteydi ise% 88. Ayrıca, bazen farklı bir referans yöntem kullanılır ya da biyokimyasal hem sonuçlarını kombine analiz eder ve bir test yöntemi olarak kromojenik araç. bunun bir sonucu olarak, doğrudan bu çalışmalarda ile karşılaştırılması zordur.V saptanmasında daha iyi bir performans sergileyen ek olarak "jove_content"> parahaemolyticus, bu çalışmada kullanılan kromojenik agar, birden çok renk elde nedeniyle orta formül bir kromojenik karışımı dahil edilmesi TCBS daha Vibrio türü ayırt olabilir. O V. algılamak için bu çalışmanın odak noktası olmamasına rağmen cholerae ve V. vulnificus, türlerin tarafından sergilenen kırmızı koloniler daha UV altında floresan ayırt edilebilir unutmayın değer. Bir sınırlama V. tespiti için kromojenik agar kullanmak cholerae ve V. vulnificus bu türler için onun belirgin düşük kurtarma olduğunu. Bu sorunu aşmak için, bir zenginleştirme aşaması dahil edilmelidir. Kromojenik agar olası bir başka sınırlama TCBS daha da kısa raf ömrü olduğunu. bu yeni ortamın devam eden optimizasyon depolama sırasında pH sağlamak için gereklidir.
moleküler tekniklerin popülerliğine rağmengenellikle daha az maliyetli ve daha iyi bir algılama sınırı olarak, kültür-bağlı yöntemleri hala değerlidir. Bu kültürleme metotları bir tarama aracı olarak kullanılabilir. Bunun aksine, bu moleküler analizler aşağıdaki mikroorganizmalara kimliği ve canlılığı teyit etmek için kullanılabilir. bir kültür-bağlı bir yaklaşım aracılığıyla bakteri saymak, Standart Plaka Sayısı standart yöntem olarak kabul edilmektedir. Adım 4.2.5 gösterilen denklem CFU / g veya farklı seyreltme faktörler CFU ortalama daha CFU / ml belirlemek için daha doğru bir yoldur. Prosedürler boyunca tüm sulandırıcılar ve medya gibi V. olarak halofilik bakterilerin canlılığını korumak için yeterli tuz içermesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir parahaemolyticus. Kuluçka sıcaklık ve çevre bakteri üremesi için en uygun olmalıdır.
Kromojenik ortam önemli insan patojenlerdir Vibrio türlerinin tespit etmek için tasarlanmıştır. Bu nedenle, daha ileri çalışmalara Belirlenme yapılmalıdırne etkinliği tıbben uygun olmayan diğer çevre Vibrio türleri tespit etmek için. Gelecekteki uygulamalarda, yeni kromojenik ağar V için çevresel örneklerin rutin testler dahil edilebilir parahaemolyticus. Bu varsayımsal V. varlığını tespit etmek için kromojenik agarı üzerinde numunelerin doğrudan çizgiler ile yapılabilir parahaemolyticus. Kromojenik agar da V numaralandırmak için kullanılabilir dilüsyonlarda aşağıdaki parahaemolyticus. Niceleme da onay için kromojenik agar üzerinde çizgiler ardından zenginleştirme suyu kullanarak bir En Muhtemel Sayı yöntemi gerçekleştirmek tahmin edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz proje üzerinde kendi yardım için M. Channey, E. Chau, ve K. Tomas teşekkür ederiz. Proje malzemeleri kısmen California Polytechnic State Üniversitesi tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Equipment | |||
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | may use other brands |
| Autoclave | Any | ||
| BHI powder | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | may use other brands |
| Blender | Any | to blend oyster meat | |
| CampyGen gas generator | Hardy Diagnostics | CN035A | to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands |
| Chocolate agar plates | Hardy Diagnostics | E14 | may use other brands |
| Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) | Any | or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014) | |
| Culture tubes | Fisher Scientific | S50712 | may use other brands |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | S348903 | may use other brands |
| Gel doc | Any | ||
| HardyChrom Vibrio agar plates | Hardy Diagnostics | G319 | This study evaluates this medium |
| Incubator | Any | ||
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-606 | 10 microliter-size was used in this study |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | may use other brands |
| Oysters | Any | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | may use other brands |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | may use other brands |
| Pipette and tips | Any | Sterilized tips | |
| Primers for tlh | IDT DNA | ||
| Scale | Any | ||
| Spreader | Fisher Scientific | 08-100-11 | Beads may be used instead |
| Stomacher blender | Stomacher | 400 | Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec. Other homogenizer can be used. |
| Sterile filter bags for blenders | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS powder | Hardy Diagnostics | 265020 | This study evaluates this medium |
| Thermocycler | Any | ||
| TSB powder | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | may use other brands |
| UV viewing cabinet | Any | Emit long-wave UV light | |
| Water bath | Any | |
|
| Name | Sources | Catalog Number | Comments |
| Bacterial species and strains | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| Escherichia coli | ATCC | ||
| Proteus mirabilis | ATCC | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| Shigella boydii | ATCC | ||
| Shigella flexneri | ATCC | ||
| Shigella sonnei | ATCC | ||
| Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) | FDA, ATCC | ||
| V. damsela | FDA | ||
| V. fisheri | Environment | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| V. furnissii | CDC | ||
| V. hollisae | FDA | ||
| V. metschnikovii | ATCC | ||
| V. mimicus | FDA | ||
| V. parahaemolyticus (serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc.) | ATCC, FDA, CDC, Environment | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| V. vulnificus | FDA |
References
- Yeung, P. S., Boor, K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).
- Yeung, P. S. M., Boor, K. J. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. Faruque, S. M. , Caister Academic Press. 153-184 (2012).
- Centers for Disease Control and Prevention. Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food - Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010. Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).
- Centers for Disease Control and Prevention. Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008. , Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591 (2008).
- Scallan, E., et al. Foodborne illness acquired in the United States - major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).
- Baross, J., Liston, J. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State. Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).
- Baross, J., Liston, J. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific. Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).
- Kueh, C. S., Chan, K. Y. Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster. J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).
- Food and Drug Administration. Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , Second Edition, (2012).
- Qadri, F., et al. Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus. J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).
- Food and Drug Administration. Quantitative risk assessment on the public health impact of Vibrio parahaemolyticus in raw oysters. , Available from: http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/ResearchAreas/RiskAssessmentSafetyAssessment/ucm050421.htm (2005).
- Food and Drug Administration. Bacteriological analytical manual online. , Available from: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070830.htm (2004).
- MacFaddin, J. F. Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, Williams & Wilkins. Baltimore, Md. (1985).
- Bottone, E. J., Robin, T. Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features. J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).
- Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms. Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).
- Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).
- Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).
- Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus. J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).
- Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).
- Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).
- Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish. J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).
- Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates. Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).
- Duan, J., Su, Y. -C. Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).
- Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus. Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).
- Canizalez-Roman, A., Flores-Villaseñor, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Leòn-Sicairos, N. Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples. Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).
- Kriem, M. R., et al. Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains. Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).
- Food Drug Administration. Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests. http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).
- Burd, E. M. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).
- World Organisation for Animal Health. Principles and methods of validation of diagnostic assays for infectious diseases. , Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/1.01.05_VALIDATION.pdf (2013).
