Abstract
Infecciones transmitidas por los alimentos en los EE.UU. causada por especies de Vibrio han mostrado una tendencia al alza. En el género Vibrio, V. parahaemolyticus es responsable de la mayoría de las infecciones -asociado Vibrio. Por lo tanto, la diferenciación precisa entre Vibrio spp. y la detección de V. parahaemolyticus es de vital importancia para garantizar la seguridad de nuestro suministro de alimentos. Aunque las técnicas moleculares son cada vez más comunes, métodos de cultivo a dependiendo todavía de forma rutinaria hecho y que se consideran métodos estándar en determinadas circunstancias. Por lo tanto, un nuevo medio de agar cromogénico fue probado con el objetivo de proporcionar un mejor método para el aislamiento y la diferenciación de Vibrio spp clínicamente relevante. El protocolo compara el límite de sensibilidad, especificidad y de detección para la detección de V. parahaemolyticus entre el nuevo medio cromogénico y un medio convencional. Varios V. parahaemolyticus cepas (n = 22) de reSe han usado presentar diversos serotipos y de la fuente de origen. Ellos fueron identificados previamente por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC), y verificado aún más en nuestro laboratorio por TLH-PCR. En por lo menos cuatro ensayos separados, estas cepas se inocularon en el agar y tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa cromogénicos (TCBS) de agar, que es el medio recomendado para el cultivo de esta especie, seguido de incubación a 35-37 ° C durante 24 h -96. Tres V. parahaemolyticus cepas (13,6%) no crecieron de manera óptima en TCBS, no obstante, exhibieron colonias de color verde si había crecimiento. Dos cepas (9,1%) no dieron los esperados cian colonias en el agar cromogénico. V. no cepas parahaemolyticus (n = 32) también se probaron para determinar la especificidad de la agar cromogénico. Entre estas cepas, 31 no crecieron o exhibieron otras morfologías de colonias. La recuperación media de V. parahaemolyticus en el chromogenic agar fue de ~ 96,4% en relación con agar de soja tríptico suplementado con 2% de NaCl. En conclusión, el nuevo agar cromogénico es un medio eficaz para detectar V. parahaemolyticus y para diferenciarlo de otros vibrios.
Introduction
Como miembro del género Vibrio, V. parahaemolyticus es una bacteria Gram-negativas, no formadoras de esporas, curvada, en forma de barra. Se presenta una alta movilidad en ambos ambientes líquidos y semisólidos. La mayoría V. parahaemolyticus cepas no son patógenos para los seres humanos, sin embargo, los subtipos patógenos han causado epidemias y pandemias, por lo tanto, esta especie se considera que es un importante patógeno de transmisión alimentaria en muchos países 1,2. La incidencia de la infección por Vibrio en los EE.UU. ha mostrado una tendencia al alza desde el año 2000 3. Entre Vibrio spp., V. parahaemolyticus es la especie más frecuentemente reportado que causan enfermedades en los EE.UU. 4,5. Otras especies clínicamente relevantes incluyen V. Alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, etc. Un pequeño porcentaje de las enfermedades es causada por múltiples especies simultáneamente.
V. parahaemolyticus es una i naturalesnhabitant de agua marina y, por tanto, ampliamente distribuido en aguas marinas en todo el mundo, incluyendo los estuarios. La especie fue descubierta en 1950 después de un brote de intoxicación alimentaria en Japón. En los EE.UU., la especie fue aislada por primera vez en el agua de mar, sedimentos y moluscos en la región de Puget Sound 6,7. Filtradores en los hábitats marinos, como los moluscos bivalvos, pueden albergar V. parahaemolyticus como parte de su flora natural 8. Como tal, V. infecciones parahaemolyticus en humanos a menudo están relacionados con el consumo de mariscos contaminados, especialmente los mariscos crudos o poco cocidos. Una ruta menos común de entrada se produce cuando herida abierta se expone al agua del mar, lo que lleva a una infección cutánea. La mayoría V. cepas parahaemolyticus no causan enfermedad en humanos, sin embargo, ciertos subtipos que albergan los factores de virulencia como hemolisina directa termoestable (TDH) son patógenas. Los síntomas más frecuentes de transmisión alimentaria V. infección son parahaemolyticusdiarrea y dolor abdominal, seguido de náuseas, vómitos y fiebre. También se informa de dolor de cabeza y escalofríos. El período de incubación promedio es de 15 horas, pero puede ser de hasta 96 horas después del consumo de una cantidad suficiente de cepas patógenas 9. La enfermedad dura de dos a tres días. Los síntomas de la gastroenteritis causada por V. parahaemolyticus son en gran medida auto-limitante y, por tanto, un tratamiento especial no es necesario. Los casos leves de gastroenteritis pueden ser tratados eficazmente mediante rehidratación oral. Más enfermedades graves se pueden tratar con antibióticos tales como la tetraciclina o la ciprofloxacina 10. La tasa de mortalidad es de alrededor del 2% de los casos de gastroenteritis, pero puede ser tan alta como 29% para aquellos que desarrollan infección del torrente sanguíneo o septicemia. Cualquier persona que consume mariscos o tiene una herida abierta expuesta al agua de mar está en riesgo de V. infección parahaemolyticus. La forma más grave de enfermedades, septicemia que amenaza la vida, es más común en una subpoblación con co médico subyacentenditions 11, que incluyen el alcoholismo, enfermedad hepática, diabetes, enfermedad renal, enfermedad maligna, y otras condiciones que conducen a una respuesta inmune debilitado. Cabe destacar que este grupo de personas es también un riesgo mayor de contraer enfermedades graves causadas por V. vulnificus, que se puede encontrar en los hábitats naturales similares a V. parahaemolyticus.
V. parahaemolyticus se aísla de forma rutinaria usando agar sales de sacarosa tiosulfato-citrato-biliares (TCBS) como un medio selectivo y diferencial. El enriquecimiento en agua de peptona alcalina puede preceder el aislamiento en agar TCBS. presuntas colonias en TCBS se prueban aún más en una serie de pruebas bioquímicas y / o ensayos moleculares dirigidas a la presencia de genes específicos de cada especie. Métodos basados en PCR se utilizan a menudo para confirmar la identidad de V. parahaemolyticus mediante la amplificación del gen de la hemolisina termolábil, tlh 12.
Independientemente de la choice de los métodos de confirmación, es importante tener un medio eficaz para aislar y diferenciar V. parahaemolyticus de otros vibrios marinos en el primer lugar. TCBS rutinariamente se ha utilizado para diferenciar las especies dentro del género Vibrio, según su capacidad para fermentar la sacarosa 12. Reacción de fermentación positiva se acompaña de un cambio de color del indicador de pH de bromotimol azul. V. colonias parahaemolyticus son bastante distintiva en TCBS, exhibiendo color de azul a verde. Sin embargo, este medio no puede diferenciar fácilmente V. alginolyticus y V. cholerae. especies de Proteus sacarosa-fermentación pueden producir colonias de color amarillo que se asemejan V. V. cholerae o Alginolyticus 13. El aislamiento inicial en TCBS, V. parahaemolyticus también se han identificado erróneamente como Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides, y Pseudomonas spp 14. Las cepas con ferm sacarosa retardadaentación puede ser confundida con otra sacarosa no fermentadores Vibrio 13, que incluye V. parahaemolyticus. TCBS se encontró que no es sensible frente a Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens, entre otros. Varias otras especies producen colonias verdes a grises que son potencialmente confundirse con V. V. parahaemolyticus o 15 vulnificus. Como resultado de ello, es deseable desarrollar medios de cultivo alternativa con mejor sensibilidad y especificidad hacia la detección y el aislamiento de V. parahaemolyticus y otras especies estrechamente relacionadas.
Varias alternativas de medios de comunicación se han desarrollado recientemente. Además de la inclusión de agentes selectivos, la mayoría incorporan sustratos cromogénicos para diferenciar especies en base a sus actividades enzimáticas diferenciales. Por ejemplo, indoxilo-β-glucósido y de indoxilo-β-galactósido se han utilizado como los sustratos cromogénicos para diferenciar V. paracahaemolyticus colonias (que aparecen de color verde azulado) de las de V. cholerae (púrpura) debido a sus capacidades diferenciales para producir β-glucosidasa y β-galactosidasa 16. Diferentes formulaciones de agar cromogénico desarrolladas por varios grupos han sido evaluados y se informó para llevar a cabo de forma comparable a o mejor que TCBS 17,18,19. Una ventaja de usar un medio cromogénico es que la coloración del medio circundante es mínimo lo que facilita el aislamiento de colonias particulares. En este estudio, se evaluó la capacidad de un medio cromogénico de nueva formulación para detectar y aislar V. cholerae, V. parahaemolyticus y V. vulnificus; con un enfoque especial en su capacidad para diferenciar V. parahaemolyticus de otras especies.
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Protocol
1. Medios y cultivo de cepas microbianas
NOTA: Use técnicas asépticas en todos los experimentos. Utilizar materiales estériles. Esterilizar todos los recipientes, herramientas y reactivos antes de su uso. Autoclave todos los materiales de desecho antes de su eliminación, ya que se consideran de riesgo biológico. temperatura del autoclave y el tiempo de combinación es ≥121 ° C x ≥15 min para todos los procedimientos siguientes.
- Para hacer ~ 1 l de agar tríptico de soja (TSA), primero agregar 1 L de agua desionizada en un matraz de 2 litros Erlenmeyer que contiene una barra de agitación magnética. Utilice un matraz que es al menos dos veces mayor que el volumen final. Añadir 30 g de polvo de caldo de soja tríptico y 20 g de agar gránulos en el matraz.
NOTA: El uso agar al 2% en lugar del 1,5% para limitar el enjambre de algunas especies de Vibrio.- Mezclar bien activando el agitador. Mientras se agita, encender la calefacción a hervir la mezcla. Retirar el matraz de la estufa tan pronto como la mezcla comience a hervir. Cubra THe matraz con un papel de aluminio. Tape el papel de aluminio para fijarlo al matraz antes de autoclave.
- Para hacer caldo de soja tríptico (TSB), omita el agar de la receta en el paso 1.1.
NOTA: Puede utilizar botellas en lugar de un matraz Erlenmeyer. - Para hacer agar de soja tríptico suplementado con cloruro de sodio 2% o NaCl (TSAS), añadir 20 g de NaCl en la mezcla antes de la agitación y el calentamiento. Para hacer caldo de soja tríptico suplementado con 2% de NaCl (OSP), omitir el agar, añadir 20 g de NaCl en la mezcla antes de la agitación y el calentamiento.
- Para hacer agar de infusión de cerebro y corazón (BHI), suspender 37 g de polvo BHI y 15 g de gránulos de agar en 1 L de agua purificada. Calentar con agitación para disolver el polvo. Autoclave. Omitir el agar para hacer caldo BHI.
- Para hacer agar TCBS, suspender 89 g del polvo TCBS en 1 L de agua purificada. Calentar con agitación y se deja hervir durante 1 minuto para disolver completamente el polvo. No esterilizar en autoclave.
- Para todos los medios de agar, enfriar el agar caliente a 45-50 ° C en un baño de agua. Organizar placas de Petri vacías en pilas de cinco a seis placas. A partir de la parte inferior de la pila, se vierte el agar fundido en cada placa de Petri para llegar hasta la mitad. Cierre la tapa de la placa de Petri después de verter. Dejar que el agar se solidifique al permitir que las placas reposar a temperatura ambiente.
- Utilice las placas de agar al día siguiente o después de 12 horas. Almacenar las placas utilizadas en un refrigerador hasta por dos semanas. Antes de usar, eliminar los platos de la nevera y se equilibre a temperatura ambiente durante al menos 15 min.
NOTA: agar de un litro hace ~ 45 placas de agar. Permitir a las placas de agar se seque lo suficiente en el día de la preparación, y se equilibran a temperatura ambiente después de almacenamiento en frío para reducir eficazmente la propagación de las colonias.
- Utilice las placas de agar al día siguiente o después de 12 horas. Almacenar las placas utilizadas en un refrigerador hasta por dos semanas. Antes de usar, eliminar los platos de la nevera y se equilibre a temperatura ambiente durante al menos 15 min.
- Obtener placas de agar chocolate y cromogénico y equilibrar a temperatura ambiente antes de cada experimento.
- Subcultura de los 54 cepas microbianas que se muestran en la Tabla 1 da cada pocosys.
- Use un asa de siembra estéril para transferir las culturas a partir de una solución madre congelada o un lote anterior a los medios no selectivos como el BHI, TSB / TSA o agar chocolate. Crecer halófilas Vibrio spp. en los OSP / TSAS.
- Para comprobar la pureza de la cultura, racha todas las cepas en un patrón que permita la observación de colonias aisladas. Por ejemplo, utilizar un patrón de rayas de tres fases para diluir una gran cantidad de bacterias a menor cantidad, con el tiempo produciendo colonias aisladas.
- Incubar las placas al revés a 35-37 ° C durante un máximo de 48 horas. Para Campylobacter spp., Incubar los tubos o placas en un frasco de tapa cerrado que contiene una bolsa de gas para producir un ambiente microaerofílico. Observe morfología de las colonias después de la incubación. Los cultivos puros deben producir colonias que exhiben morfología de la colonia similar.
NOTA: Incubar todas las placas al revés para evitar que las gotas de agua condensadas formadas en la parte inferior de la tapa caiga sobre la colOnies.
2. Las especies Determinación por PCR
- Llevar a cabo TLH-PCR para confirmar la identidad de V. cepas parahaemolyticus. Use cebadores TLH -F (5 'AAA GCG GAT TAT GCA GCA GAA CTG 3') y -R tlh (5 'TCG ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC 3') para amplificar un fragmento de 450 pb del gen de la hemolisina termolábil 20 .
- Use un asa de siembra estéril para transferir algunas colonias aisladas de cada V. parahaemolyticus cepa de TSAS a 5 ml de TSB. Incubar a 35-37 ° C durante 16-24 horas.
- culturas centrifugar a 14.000 xg durante 1 min. Eliminar el sobrenadante y lavar el precipitado dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Hervir la suspensión durante 3 min para dar lisado celular.
NOTA: V. parahaemolyticus es fácil de ser lisadas. Por lo tanto no se requiere reactivo de lisis. También es posible utilizar un poco de colonia directamente como la plantilla. - Realizar PCR en una reacción de 25 l-volumen. Preparar una mezcla de reacción que contiene una concentración final de 1 x tampón de PCR, 1.5 mM MgCl2, 100 mM de cada dNTP, 1 mM de cada cebador, 1 U de Taq polimerasa y 1 l de lisado celular. Después de la preincubación a 94 ° C durante 5 min, ejecute 35 ciclos de amplificación de 94 ° C durante 30 seg, 58 ° C durante 30 seg, y 72 ° C durante 60 seg 21.
- alícuotas de carga de amplicón 5-l en 1,5% geles de agarosa. Encienda la fuente de alimentación para iniciar la electroforesis. Visualizar la presencia o ausencia de amplicones bajo iluminación UV después de la tinción con bromuro de etidio.
3. Crecimiento en medios selectivos y diferenciales
- Dos a cuatro días antes del experimento, racha todas las cepas microbianas que se muestran en la Tabla 1 en medio no selectivo (TSAS, BHI o agar chocolate) para el aislamiento de colonias. Incubar las placas a 35-37 ° C durante 48 horas. Comprobar la pureza de los cultivos mediante la observación de morfología de las colonias después de la incubación. Los cultivos puros deben producir colonias que exhiben morfología de la colonia similar.
- Transferir algunas colonias aisladas a partir del paso 3.1 en 5 ml de caldo. Incubar los tubos a 35-37 ° C durante 16-24 horas.
Nota: El uso colonias jóvenes, que son menos de cuatro días de edad, para preparar cultivos de una noche en todos los experimentos. - Racha de un asa de siembra de cultivos de una noche en medios selectivos y diferenciales (TCBS y agar cromogénico) para el aislamiento de colonias. Incubar las placas a 35-37 ° C durante un máximo de 96 horas.
- Registrar el crecimiento global de todas las cepas mediante el examen tanto de la densidad de cultivo en el plato y el tamaño de las colonias aisladas. Registre el color de las colonias bajo la luz ambiental y / o UV. Tenga en cuenta otras características de la colonia aislada, como la elevación, el margen y la forma.
4. Ensayo de recuperación
- Seleccionar un subconjunto representativo de V. cepas parahaemolyticus (n = 14) que abarcan diferentes serotipos y orígenes de aislamiento
- Llevar a cabo un método de recuento en placa estándar de los cultivos de una noche como se describe a continuación.
- Vórtice para mezclar bien los cultivos de la noche. Hacer una 10 veces o dilución 10 -1 mediante la transferencia de 100 l de cultivo de una noche en un tubo que contiene 900 l de PBS. Vórtice para mezclar bien.
- Utilizar una punta de pipeta para transferir 100 l del tubo de dilución 10 -1 a otro tubo que contiene 900 l de PBS. Vórtice para mezclar bien. Esto constituye dilución 10 -2. Repita el proceso de forma secuencial para obtener una dilución 10 -7.
- El uso de los 10 -4 a 10 -7 tubos de dilución, la placa de 100 l cada uno de los TCBS y TSAS placas de agar cromogénicos,.
NOTA: El factor de dilución (df) de la placa se convierte en 10 -5-10 -8, respectivamente. - Difundir las alícuotas de manera uniforme en tél agar superficie.
NOTA: Es muy bien utilizar el mismo esparcidor por cepa en el mismo medio, siempre que la alícuota más diluida se extiende primero (es decir, de 10 -8-10 -5). No utilice el mismo esparcidor para diferentes medios. - Incubar las placas a 35-37 ° C durante un máximo de 96 horas. Recuento de las colonias en las placas. Ignorar placas de apoyo colonias que son demasiado numerosos para contar (TNTC) o menor que 25. Calcular CFU / ml de acuerdo con lo siguiente:
Dónde
N = el número de células en el tubo sin diluir, expresado como UFC / ml o CFU / g
C = el número total de colonias contadas en las placas que dan 25-300 colonias
1 = el número de placa (s) donde las colonias contadas son de la más baja df
n2 = número de placa (s) donde son colonias contadas a partir de la dilución de 10 veces subsecuente
ref = factor de dilución más baja (es decir, la dilución más concentrada)
- Comparar CFU / ml entre los diferentes medios de comunicación. Utilice UFC / ml en TSAS como el 100%, se calcula el% de recuperación de V. parahaemolyticus cultiva en el agar cromogénico y TCBS.
- Llevar a cabo un método de recuento en placa estándar de los cultivos de una noche como se describe a continuación.
Ensayo 5. Competencia
- Elegir un subconjunto de cepas que muestran diferentes morfologías de colonias en el agar cromogénico y TCBS.
NOTA: De esta manera, será posible contar las colonias se originaron de V. Sólo parahaemolyticus, a pesar de la presencia de otras especies en el inóculo.- Elija una V. parahaemolyticus cepa que produce las colonias de color turquesa y cian esperados en TCBS y el agar cromogénico, respectivamente.
- Elija un no V. parahaemolyticus y Vibrio una especie no que no crecen en cualquiera de estos medios, o tienen diferentes color de la colonia.
NOTA: Por ejemplo, V. metschnikovii crece muy débilmente on TCBS y no creció en el agar cromogénico. Shigella sonnei no crece en TCBS pero produce colonias de color magenta en el agar cromogénico.
- Después de la selección de las cepas anteriores, preparar caldos de cultivo durante la noche utilizando colonias aisladas cultivadas en medios no selectivos.
- Hacer cultivos de una noche de V. parahaemolyticus y V. metschnikovii mediante la transferencia de algunas colonias aisladas de TSAS a 5 ml de TSB. Incubar a 35-37 ° C durante 16-24 horas.
- Hacer cultivos de una noche de Shigella sonnei mediante la transferencia de unas pocas colonias aisladas de agar BHI a 5 ml de caldo BHI. Incubar a 35-37 ° C durante 16-24 horas.
- Para cada cepa, lleve a cabo una serie de dilución similar a los pasos 4.2.1 y 4.2.2. Placa de diluciones apropiadas sobre TSAS o BHI para determinar CFU / ml de cultivo de una noche, utilizando la ecuación de muestra en el paso 4.2.5.
NOTA: Por lo general, 100 l de la dilución 10 -5 a la 10 -7tubos de obras para la mayoría de las culturas. Utilice los valores de UFC / ml para respaldar calcular la cantidad exacta de las células utilizadas en el siguiente paso. Los valores de UFC / ml calculados se obtienen después de la incubación, aunque los pasos siguientes se llevan a cabo en la misma fecha que la Etapa 5.3. - El uso de los cultivos de la noche y los tubos de dilución en los pasos 5.2 y 5.3, mezclar diferentes cantidades de una V. cepa parahaemolyticus y un no V. especies parahaemolyticus. Por ejemplo, la mezcla de 500 l de la tubo de dilución 10 -5 de V. parahaemolyticus con 500 l de los cultivos de una noche de V. metschnikovii.
NOTA: Esta mezcla simula alto fondo microflora. Para simular un fondo bajo microflora, mezclar 500 l cada uno del tubo de dilución 10 -5 de ambas especies. - Spread 100 l de la mezcla de cada uno de los TCBS y TSAS placas de agar cromogénicos,.
- Después de la incubación a 35-37 ° C durante un máximo de 96 horas, contar las colonias de V. parahaemolyticus y la no V. especies parahaemolyticus con base en su diferencia en el crecimiento y la morfología de las colonias en el agar cromogénico y TCBS.
NOTA: Por ejemplo, si la no V. parahaemolyticus especies no crecen en el agar cromogénico y TCBS, todas las colonias serán de V. parahaemolyticus. Si la no V. parahaemolyticus especie crece en ambos medios, sólo las colonias de color turquesa en colonias TCBS y cian en agar cromogénico serán de V. parahaemolyticus. La no V. especies parahaemolyticus pueden o no pueden exhibir la morfología de colonia similar a V. parahaemolyticus en TSAS.- Si la no V. especies parahaemolyticus crece de manera similar a V. parahaemolyticus en este medio no selectivo, divida el recuento de colonias por dos para obtener el número de V. parahaemolyticus solamente. Comparar el recuento de colonias real con la frecuencia esperada derivada del Paso 5.3.
6. EFFECTS de Oyster Los homogeneizados
- Pesar ≥50 g de carne de molusco ≥12 moluscos incluida la carne y el licor.
- Añadir la misma cantidad de PBS a la carne de la ostra y el licor. Mezclar la mezcla a alta velocidad durante 90 seg. Esto constituye el 2 -1 diluida homogeneizado de ostras.
- Añadir 100 g de 2 -1 homogeneizado ostra diluido a 400 g de PBS. Utilice una escala para medir el peso, no por volumen. Mezclar la mezcla a alta velocidad durante 1 min. Autoclave el homogeneizado de ostras.
NOTA: Este será el homogeneizado de ostras utilizado para clavar.
- Repetir el ensayo de recuperación (Paso 4) en presencia de homogeneizado de ostras.
- Después de los 500 g de ostras homogeneizado se enfría, se añaden 100 l de V. parahaemolyticus cultivos de una noche cultivados en TSB a ella. Determinar la cantidad real de V. parahaemolyticus células en el inóculo mediante la realización de los procedimientos de recuento en placa estándar descrito en el paso 4.2.
- Repscomer el ensayo de la competencia (Paso 5) en presencia de homogeneizado de ostras.
- Después de los 500 g de ostras homogeneizado se enfría, se añaden 100 l cada uno de los cultivos de una noche de V. parahaemolyticus y V. no parahaemolyticus a ella. Determinar la cantidad real de bacterias Las células en el inóculo mediante la realización de los procedimientos de recuento en placa estándar descrito en el paso 4.2
- Mezclar las células bacterianas con homogeneizado de ostras bien mediante el uso de un homogeneizador.
NOTA: Después de mezclar, el homogeneizado de ostra que contiene las células añadidas intencionadamente se llama claveteado homogeneizado de ostras. - Hacer diluciones del homogeneizado de ostras de púas para obtener 10 -1 a 10 -3 tubos de dilución de acuerdo con los procedimientos descritos en la etapa 4.2.2. Spread 100 l de cada dilución en el cromogénico TCBS y TSAS agar,. Incubar las placas a 35-37 ° C durante un máximo de 96 horas.
- Comparar el recuento de colonias en agar cromogénico real y TCBS con el exse sospecha vienen del recuento de colonias deduce de Pasos 6.2.1 y 6.3.1.
NOTA: Por ejemplo, si un tubo de V. parahaemolyticus cultivo durante la noche contiene 10 8 CFU / ml, un inóculo de 100 l significa que 10 7 células se añaden a la 500-g de homogeneizado de ostras, produciendo 5 x 10 4 células / g. Después de la dilución y de las planchas, teniendo la placa df = 10 -2 debería producir 500 colonias; mientras que el tener df = 10 -3 debería producir 50 colonias. Estos son los recuentos de colonias esperados.
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Representative Results
En este estudio, 54 cepas microbianas fueron ensamblados, que incluyó 22 cepas dentro de la V. especies parahaemolyticus, Vibrio otras 19 especies, y 13 especies de Vibrio no (Tabla 1). La mayoría V. cepas parahaemolyticus se recibieron ya sea de la FDA, CDC u otros departamentos de salud estatales. Representan diversos serotipos y fuentes de aislamiento. Estas cepas fueron identificadas previamente por los organismos reguladores. Además, confirmó la identidad de estos V. parahaemolyticus mediante la realización de un TLH-PCR 21,22.
| Especies | Nº de cepas ensayadas | Crecimiento y color de las colonias | |
| TCBS | domedio hromogenic | ||
| Aeromonas hydrophila | 2 | Sin crecimiento | 1 cepa no hay crecimiento; |
| 1 cepa de color magenta | |||
| Candida albicans | 1 | El débil crecimiento, amarillo | Sin crecimiento |
| Campylobacter jejuni | 1 | Sin crecimiento | Sin crecimiento |
| Escherichia coli | 1 | Sin crecimiento | El débil crecimiento, magenta |
| Proteus mirabilis | 1 | Sin crecimiento | Sin crecimiento |
| aeruginosa Pseudomonas | 2 | Turquesa | Amarillo |
| Staphylococcus aureus | 1 | El débil crecimiento, amarillo | Sin crecimiento |
| choleraesu Salmonellaes | 1 | Sin crecimiento | Sin crecimiento |
| boydii Shigella | 1 | Sin crecimiento | Sin crecimiento |
| Shigella flexneri | 1 | Sin crecimiento | Sin crecimiento |
| Shigella sonnei | 1 | Sin crecimiento | El débil crecimiento, magenta |
| alginolyticus Vibrio | 3 | Amarillo o turquesa | Amarillo |
| V. cholerae | 4 | Amarillo o turquesa | Magenta |
| V. damsela | 1 | Turquesa | Cobalto |
| V. fisheri | 1 | El débil crecimiento, amarillo | Sin crecimiento |
| V. fluvialis | 1 | Turquesa | Cobalto |
| V.furnissii | 1 | Amarillo | Amarillo |
| V. hollisae | 1 | Turquesa | Amarillo |
| V. metschnikovii | 1 | Sin crecimiento | Sin crecimiento |
| V. mimicus | 1 | Turquesa | Magenta |
| V. parahaemolyticus | 22 | La mayoría de las cepas de color turquesa | La mayoría de las cepas cian; algunos clara |
| V. proteolyticus | 1 | Turquesa | Cobalto |
| V. vulnificus | 4 | Turquesa o clara | Magenta |
Tabla 1. especies microbianas utilizadas en este estudio y sus características de crecimiento en el medio selectivo y diferencial. Llamada color era based en una rueda de color. Cian es similar a verde azulado; magenta es similar a la lavanda rosado, turquesa es similar a verde, amarillo abarca de oliva y marrón.
Se realizaron cuatro ensayos separados para determinar el crecimiento y la morfología de colonias de estas cepas en el selectivo y diferencial media - TCBS y el agar cromogénico. TCBS es el medio convencional que se utiliza para el aislamiento de algunas especies de Vibrio, incluyendo V. cholerae y V. 12 parahaemolyticus. La variación del color de las colonias crecidas en TCBS era de color amarillo, turquesa (verde) o clara (Figura 1).
Figura 1. Morfología de colonias de Vibrio spp. en TCBS agar. V. parahaemolyticus (turquesa), V. cholerae (amarillo), y de la mañana la inoculación ixed de las dos especies (a). Las colonias de V. parahaemolyticus parece turquesa, con una circular, la totalidad, y la morfología convexa (b). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La posibilidad de un nuevo medio cromogénico para seleccionar las especies de Vibrio clínicamente relevantes de los alimentos y muestras ambientales se puso a prueba. Además, se evaluó la capacidad de este medio para distinguir simultáneamente estas especies entre sí. Colonia color observado en el agar cromogénico eran cobalto, cian, magenta, amarillo o claro (Figura 2). Como se muestra en la Tabla 1, tanto TCBS y el agar cromogénico exhiben ciertos grados de selectividad contra microorganismos no Vibrio.
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Figura 2. colonia morfología de Vibrio spp. en el agar cromogénico de nuevo desarrollo. V. parahaemolyticus (cian), V. cholerae (magenta), y una inoculación mixta de las dos especies (a). Las colonias de V. parahaemolyticus parece cian, con una circular, la totalidad, y la morfología convexa (b). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
De acuerdo con el método de recuento en placa estándar en cultivos de la noche, las colonias de V. se observaron parahaemolyticus en las placas de agar cromogénicos que reciben la más alta factor de dilución (es decir, df = 10 -8). Estos resultados son comparables a los de un medio no selectivo (CSTE). Esto sugiere que el límite de detección del medio cromogénico es similar a medios no selectivos, que es de aproximadamente 10 células o más bajo en ausencia de matriz alimentaria. La capacidad de detección para otras especies de Vibrio, como V. Alginolyticus, V. fluvialis y V. doncella era también decente en comparación con el medio no selectivo. Sin embargo, algunas cepas de V. cholerae, V. vulnificus y V. mimicus produjo de 10 a 100 veces menos CFU en el agar cromogénico. Los agentes selectivos utilizados en los medios selectivos cromogénicos u otros inevitablemente inhiben algunas células. Las células lesionadas, por ejemplo, no podrían recuperarse en medios selectivos. Sin embargo, la capacidad de detección ligeramente más pobre es un problema inexistente en la mayoría de los procedimientos de rutina que emplean una etapa de enriquecimiento. Pequeña cantidad de microorganismos en los alimentos o de muestras ambientales se multiplicaría a un alto nivel en el caldo de enriquecimiento, superando el límite de detección. El enriquecimiento en agua de peptona alcalina es often realizado para determinar la prevalencia de especies de Vibrio en muestras ambientales 12.
En presencia de homogeneizado de ostras, el agar cromogénico continuó mostrando un buen grado de recuperación. En otras palabras, una gran proporción (> 70%) de V. células parahaemolyticus eran capaces de crecer en el agar cromogénico, no afectado por la presencia de la matriz de la ostra (Figura 3a). El crecimiento y la recuperación de la V. células parahaemolyticus también no se vio afectada por la presencia de otra especie de Vibrio (Figura 3B). Este es un atributo importante debido a muestras ambientales están obligados a contener diferentes especies de Vibrio, que se encuentran en un número elevado sobre todo después de un proceso de enriquecimiento.
Figura 3. El porcentaje de recuperación de V. cepa parahaemolyticus en homogeneizado de ostras con y sin un competidor bacteriana. Recuperación (media ± DE) se calculó de acuerdo a la observada frente a la esperada UFC contar con las placas de agar. Espera contabilidad de UFC se calculó basándose en la carga bacteriana en el inóculo. Alta recuperación de V. Se observó cepa parahaemolyticus en todos los medios de comunicación sin competencia (a). Nivel similar de recuperación se observó cuando los altos niveles de V. metschnikovii células estaba presente (b). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para comparar más la agar cromogénico y TCBS, se calcularon la sensibilidad y especificidad. La Tabla 2 muestra la capacidad de estos medios de comunicación para Accurado identificar V. parahaemolyticus. La sensibilidad se relaciona con el porcentaje de verdadero positivo, lo que significa la V. parahaemolyticus cepas produjeron la morfología de las colonias esperado en los medios de comunicación. La especificidad se relaciona con el porcentaje de verdadero negativo, lo que significa no V. parahaemolyticus cepas deben exhibir pobre o ningún crecimiento, o una morfología de la colonia diferente de V. parahaemolyticus. La sensibilidad y especificidad para TCBS para identificar V. parahaemolyticus eran 86,4% y 71,8%, respectivamente. En comparación, la sensibilidad y la especificidad del medio cromogénico fueron 90,9% y 96,9%, respectivamente.
| un) | ||
| agar TCBS | V. parahaemolyticus | V no. parahaemolyticus |
| Un buen crecimiento y turquesa colonies | 19 | 9 |
| Deficiencia en el crecimiento o no de color turquesa colonias | 3 | 23 |
| segundo) | ||
| agar cromogénico | V. parahaemolyticus | V no. parahaemolyticus |
| Buenas colonias de crecimiento y cian | 20 | 1 |
| Deficiencia en el crecimiento o no cian colonias | 2 | 31 |
Tabla 2. La sensibilidad y la especificidad de TCBS (a) y cromógeno (b) agar en la detección de V. parahaemolyticus. Las identidades de V. parahaemolyticus se determinó previamente por prueba bioquímica y PCR tlh-.
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Discussion
Este estudio se centra en el desarrollo de medios de cultivo y evaluación. Convencionalmente, el TCBS es selectivo y diferencial medio utilizado para el aislamiento y la detección de V. parahaemolyticus, V. cholerae y V. 12 vulnificus. Sin embargo, se ha informado de limitaciones para este medio, tales como la incapacidad para diferenciar V. cholerae de otras especies de Vibrio. La sacarosa y el indicador de pH son los agentes de diferenciación de TCBS. Por lo tanto, la producción de ácido por fermentador de sacarosa causa el cambio de color del medio. La coloración del medio es un inconveniente de TCBS, ya que puede oscurecer la observación de la morfología de colonia. El medio cromogénico recién desarrollado utiliza alto pH y la salinidad para suprimir el crecimiento de especies no Vibrio se encuentran en muchas muestras marinas. El nuevo medio cromogénico tiene un pH final de 8,6 ± 0,2. Por litro de agua desionizada, se compone de 10 g de peptona, 10 g de la mezcla de sales marinas, 10 g de bilis de buey, 10 g de sodiotiosulfato, 5 g de extracto de levadura, 5 g de citrato de sodio, 2,2 g de carbonato de sodio, 2 g de lactosa, 0,5 g de piruvato de sodio, 0,3 g de una mezcla cromogénico y 15 g de agar. La mezcla cromogénico permite la diferenciación entre las especies de Vibrio. según sus capacidades diferenciales para producir ciertas enzimas. En lugar de alterar el color del medio de agar TCBS, diferente Vibrio spp. exhibiría diferente color de las colonias en el nuevo medio cromogénico. En comparación, un medio cromogénico disponibles comercialmente contiene 15 g de agar, 8 g de peptona y extracto de levadura, 51,4 g de sales, 0,3 g de una mezcla cromogénico y un pH final de 9,0 ± 0,2.
La robustez de una evaluación del ensayo depende del tamaño de la muestra. Dado que este estudio hace hincapié en la eficacia del nuevo medio cromogénico para aislar y detectar V. parahaemolyticus, es importante para acumular muchos diversa V. cepas parahaemolyticus. Estudios previos que comparan y TCBSnuevos medios de cultivo a menudo implicaba muestras ambientales o de alimentos que contienen tipos y la cantidad de microorganismos desconocidos 23,24,25,26. Varias colonias por muestra se aislaron embargo, la naturaleza clonal de los aislamientos fue a menudo indeterminado. Idealmente, las diferentes cepas deben ser probados en el desarrollo del ensayo de otro modo la precisión del ensayo se infla. Identidad de la cepa se puede establecer mediante métodos de tipificación convencionales, tales como electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) o secuenciación de múltiples locus. V. cepas parahaemolyticus en este estudio se caracterizaron previamente por ribotipaje y PFGE 19.
Durante el desarrollo del ensayo, la sensibilidad, la especificidad y límite de detección son algunos de los factores clave que deben ser investigados. La sensibilidad, también conocida como la precisión o la sensibilidad de diagnóstico, es el acuerdo positivo por ciento entre los métodos de referencia y de prueba. La especificidad, también conocido como la precisión o especificidad de diagnóstico, es el porcentaje negativo una Gréement entre los métodos de referencia y de prueba. En este estudio, se utilizó el método basado en la PCR como método de referencia debido a que los resultados fueron verificados entre los diferentes grupos. TCBS y los medios cromogénicos eran los métodos de prueba. Para determinar la sensibilidad, los resultados de la V. Se utilizaron cepas parahaemolyticus; es decir, sensibilidad = 100% x verdaderos positivos / (verdaderos positivos + falsos negativos). Por otra parte, los resultados de la no V. Se utilizaron cepas parahaemolyticus para determinar la especificidad; y por lo tanto, especificidad = 100% x Verdadero Negativo / (verdaderos negativos + falsos positivos). Para proporcionar resultados de especificidad más fiable, no V. parahaemolyticus cepas deben ser aislados de un entorno donde se llevará a cabo el muestreo. Nuestros cálculos de sensibilidad y especificidad se basan en documentos escritos por el gobierno de 27 años, el mundo académico y la organización científica 28 29 sobre un tema relacionado con el desarrollo del ensayo y validación.
nt "> En base a los resultados, el medio cromogénico mostró un mejor rendimiento que TCBS en la identificación de V. parahaemolyticus. El acuerdo global por ciento entre el método de referencia y medio cromogénico es del 94,4%, en comparación con el 77,8% entre el método de referencia y TCBS. la sensibilidad y la especificidad del medio cromogénico son 90,9% y 96,9% respectivamente, que son mayores que las de TCBS (86,4% y 71,9%, respectivamente). estudios previos que evalúan otros medios cromogénicos para la detección de V. parahaemolyticus encontraron que las sensibilidades oscilaron a partir 85 a un 88%, mientras que las especificidades variaron de 94 a 95% 23,24,25. sin embargo, estos estudios no utilizan el mismo método de cálculo que nuestro estudio. Además, a veces utilizan un método de referencia diferente o se combinaron los resultados de ambos bioquímica analiza y medio cromogénico como un método de prueba. como resultado, es difícil comparar directamente los resultados de estos estudios previos.V. parahaemolyticus, el agar cromogénico utilizado en este estudio también podría diferenciar más especies de Vibrio que TCBS debido a la inclusión de una mezcla cromogénico en la fórmula medio, produciendo múltiples colores. Aunque no fue el foco de este estudio para detectar V. cholerae y V. vulnificus, vale la pena señalar que las colonias magenta exhibidos por estas especies pueden diferenciarse adicionalmente por fluorescencia bajo UV. Una limitación de utilizar el agar cromogénico para la detección de V. cholerae y V. vulnificus es su aparente baja recuperación de estas especies. Para sortear este problema, una etapa de enriquecimiento debe ser incluido. Otra posible limitación del agar cromogénico es su vida útil más corta que TCBS. Es necesaria la optimización continua de este nuevo medio para mantener el pH durante el almacenamiento.
A pesar de la popularidad de las técnicas moleculares, Métodos de cultivo a dependiendo siguen siendo valiosos ya que a menudo son menos costosos y tienen un mejor límite de detección. Estos métodos de cultivo pueden ser utilizados como una herramienta de detección. Por el contrario, pueden ser utilizados para confirmar la identidad y la viabilidad de los microorganismos siguientes análisis moleculares. Para enumerar las bacterias a través de un enfoque de cultura-función, recuento de placa estándar es reconocido como el método estándar. La ecuación muestra en el paso 4.2.5 es una forma más exacta para determinar CFU / g o CFU / ml de un promedio de las UFC de diferentes factores de dilución. Es importante tener en cuenta que todos los diluyentes y los medios de comunicación a través de los procedimientos deben contener sal suficiente para mantener la viabilidad de las bacterias halófilas tales como V. parahaemolyticus. La temperatura de incubación y el medio ambiente deben ser óptimas para el crecimiento bacteriano.
El medio cromogénico está diseñado para detectar especies de Vibrio que son importantes patógenos humanos. Por lo tanto, más estudios deben llevarse a cabo para DETERMIne su eficacia para detectar otras especies de Vibrio ambientales que no son médicamente relevante. En futuras aplicaciones, el nuevo agar cromogénico puede ser incorporado en las pruebas de rutina de muestras ambientales para V. parahaemolyticus. Esto se puede hacer por siembra directa de muestras en el agar cromogénico para detectar la presencia de un presunto V. parahaemolyticus. El agar cromogénico también se puede utilizar para enumerar V. parahaemolyticus siguientes diluciones. La cuantificación también se puede estimar mediante la realización de un método de Número Más Probable utilizando caldo de enriquecimiento, seguido de rayas en el agar cromogénico para la confirmación.
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Acknowledgments
Damos las gracias a M. Channey, E. Chau, y K. Tomas por su colaboración en el proyecto. El Proyecto de abastecimiento fueron financiados parcialmente por California Polytechnic State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Equipment | |||
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | may use other brands |
| Autoclave | Any | ||
| BHI powder | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | may use other brands |
| Blender | Any | to blend oyster meat | |
| CampyGen gas generator | Hardy Diagnostics | CN035A | to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands |
| Chocolate agar plates | Hardy Diagnostics | E14 | may use other brands |
| Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) | Any | or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014) | |
| Culture tubes | Fisher Scientific | S50712 | may use other brands |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | S348903 | may use other brands |
| Gel doc | Any | ||
| HardyChrom Vibrio agar plates | Hardy Diagnostics | G319 | This study evaluates this medium |
| Incubator | Any | ||
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-606 | 10 microliter-size was used in this study |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | may use other brands |
| Oysters | Any | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | may use other brands |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | may use other brands |
| Pipette and tips | Any | Sterilized tips | |
| Primers for tlh | IDT DNA | ||
| Scale | Any | ||
| Spreader | Fisher Scientific | 08-100-11 | Beads may be used instead |
| Stomacher blender | Stomacher | 400 | Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec. Other homogenizer can be used. |
| Sterile filter bags for blenders | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS powder | Hardy Diagnostics | 265020 | This study evaluates this medium |
| Thermocycler | Any | ||
| TSB powder | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | may use other brands |
| UV viewing cabinet | Any | Emit long-wave UV light | |
| Water bath | Any | |
|
| Name | Sources | Catalog Number | Comments |
| Bacterial species and strains | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| Escherichia coli | ATCC | ||
| Proteus mirabilis | ATCC | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| Shigella boydii | ATCC | ||
| Shigella flexneri | ATCC | ||
| Shigella sonnei | ATCC | ||
| Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) | FDA, ATCC | ||
| V. damsela | FDA | ||
| V. fisheri | Environment | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| V. furnissii | CDC | ||
| V. hollisae | FDA | ||
| V. metschnikovii | ATCC | ||
| V. mimicus | FDA | ||
| V. parahaemolyticus (serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc.) | ATCC, FDA, CDC, Environment | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| V. vulnificus | FDA |
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