Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

की जांच के लिए एक अधिक संवेदनशील और विशिष्ट chromogenic अगर मध्यम का विकास Published: November 8, 2016 doi: 10.3791/54493
Automatic Translation
1, 1
1Biological Sciences Department, California Polytechnic State University

Abstract

अमेरिका विब्रियो प्रजातियों की वजह से में खाद्य जनित संक्रमण के एक वृद्धि की प्रवृत्ति दिखाई है। जीनस में विब्रियो, वी parahaemolyticus विब्रियो -associated संक्रमण के बहुमत के लिए जिम्मेदार है। इस प्रकार, विब्रियो एसपीपी के बीच सटीक भेदभाव। और वी का पता लगाने के parahaemolyticus हमारे भोजन की आपूर्ति की सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि आणविक तकनीक तेजी से आम है, संस्कृति के आधार तरीकों अभी भी नियमित रूप से किया जाता है और वे कुछ निश्चित परिस्थितियों में मानक तरीकों पर विचार कर रहे हैं। इसलिए, एक उपन्यास chromogenic अगर मध्यम अलगाव और चिकित्सकीय प्रासंगिक विब्रियो एसपीपी के भेदभाव के लिए एक बेहतर तरीका प्रदान करने के लक्ष्य के साथ परीक्षण किया गया था। प्रोटोकॉल वी का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता, विशिष्टता और सीमा का पता लगाने की तुलना नई chromogenic मध्यम और एक पारंपरिक मध्यम बीच parahaemolyticus। विभिन्न वी parahaemolyticus उपभेदों (एन = 22) फिर सेविविध सीरमप्रकारों और मूल के स्रोत पेश इस्तेमाल किया गया। वे इससे पहले, खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) और रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्र (सीडीसी) द्वारा की पहचान की गई है और आगे tlh -PCR से हमारी प्रयोगशाला में सत्यापित। कम से कम चार अलग-अलग परीक्षणों में, इन उपभेदों 24 के लिए 35-37 डिग्री सेल्सियस पर chromogenic अगर और thiosulfate-साइट्रेट-पित्त लवण-सुक्रोज (TCBS) अगर है, जो इस प्रजाति के संवर्धन के लिए सिफारिश माध्यम है, ऊष्मायन द्वारा पीछा पर टीका कर रहे थे -96 घंटा। तीन वी parahaemolyticus उपभेदों (13.6%) TCBS पर बेहतर हो जाना नहीं था, फिर भी हरे रंग की कालोनियों का प्रदर्शन किया है, तो वहाँ विकास किया गया था। दो उपभेदों (9.1%) chromogenic अगर पर उम्मीद सियान कालोनियों उपज नहीं था। गैर-वी parahaemolyticus उपभेदों (एन = 32) भी chromogenic अगर की विशिष्टता निर्धारित करने के लिए परीक्षण किया गया। इन उपभेदों के बीच, 31 के बढ़ने या अन्य कॉलोनी morphologies का प्रदर्शन नहीं किया था। वी का मतलब वसूली chromoge पर parahaemolyticusएनआईसी अगर ~ 2% सोडियम क्लोराइड के साथ पूरक tryptic सोया अगर करने के लिए 96.4% रिश्तेदार था। अंत में, नई chromogenic अगर वी पता लगाने के लिए एक प्रभावी माध्यम है parahaemolyticus और अन्य vibrios से अलग करने के लिए।

Introduction

विब्रियो जीनस, वी के एक सदस्य के रूप में parahaemolyticus एक ग्राम नकारात्मक, गैर बीजाणु बनाने, घुमावदार, छड़ के आकार का जीवाणु है। यह दोनों तरल और अर्ध ठोस वातावरण में उच्च गतिशीलता को दर्शाती है। अधिकांश वी parahaemolyticus उपभेदों मनुष्य के लिए गैर रोगजनक हैं, फिर भी रोगजनक उपप्रकार कई देशों 1,2 में महामारी और महामारियां, इसलिए इस प्रजाति एक महत्वपूर्ण खाद्य जनित रोगज़नक़ माना जाता है कारण है। अमेरिका में विब्रियो संक्रमण की घटनाओं विब्रियो एसपीपी के अलावा 2000 3 के बाद एक वृद्धि की प्रवृत्ति दिखाई है।।, वी parahaemolyticus सबसे अक्सर रिपोर्ट अमेरिका 4,5 में बीमारियों के कारण प्रजातियों है। अन्य चिकित्सकीय प्रासंगिक प्रजातियों वी शामिल alginolyticus, वी vulnificus, वी कोलरा, आदि बीमारियों की एक छोटा सा प्रतिशत एक साथ कई प्रजातियों के कारण होता है।

वी parahaemolyticus एक प्राकृतिक रहा हैसमुद्री पानी की nhabitant और इसलिए व्यापक रूप ज्वारनदमुख सहित दुनिया भर में समुद्री जल में वितरित की। प्रजातियों जापान में विषाक्त भोजन का प्रकोप निम्नलिखित 1950 में पता चला था। अमेरिका में, प्रजातियों पहले Puget ध्वनि क्षेत्र 6.7 में समुद्री जल, अवसादों, और शंख में पृथक किया गया। ऐसे दोपटा शंख के रूप में समुद्री निवास में फिल्टर भक्षण, वी कर सकते हैं बंदरगाह उनके प्राकृतिक वनस्पतियों 8 के हिस्से के रूप parahaemolyticus। इस तरह, वी के रूप में मानव में parahaemolyticus संक्रमण अक्सर दूषित समुद्री भोजन, विशेष रूप से कच्चा या अधपका शंख की खपत से जुड़ी हैं। प्रवेश की एक कम आम मार्ग तब होता है जब खुला घाव समुद्री जल के संपर्क में है, त्वचा संक्रमण के लिए अग्रणी। अधिकांश वी parahaemolyticus उपभेदों मानव रोग का कारण नहीं है, अभी तक इस तरह थर्मास्टाइबल प्रत्यक्ष hemolysin (TDH) के रूप में विषैलापन कारकों को शरण देने के लिए कुछ उपप्रकार रोगजनक हैं। खाद्य जनित वी का सबसे प्रचलित लक्षण parahaemolyticus संक्रमण हैंदस्त और पेट दर्द, द्वारा मतली, उल्टी, बुखार और पीछा किया। सिरदर्द और ठंड लगना भी रिपोर्ट कर रहे हैं। मंझला ऊष्मायन अवधि 15 घंटा है, लेकिन रोगजनक उपभेदों 9 के लिए पर्याप्त राशि की खपत के बाद 96 घंटा के लिए हो सकता है। बीमारी दो से तीन दिन से रहता है। आंत्रशोथ वी के कारण लक्षण parahaemolyticus काफी हद तक खुद को सीमित कर रहे हैं और इसलिए विशेष इलाज के लिए आवश्यक नहीं है। आंत्रशोथ के हल्के मामलों को प्रभावी ढंग से मौखिक पुनर्जलीकरण द्वारा इलाज किया जा सकता है। अधिक गंभीर बीमारियों ऐसे टेट्रासाइक्लिन या सिप्रोफ्लोक्सासिन 10 के रूप में एंटीबायोटिक दवाओं से इलाज किया जा सकता है। मृत्यु दर आंत्रशोथ के मामलों के लिए के बारे में 2% है, लेकिन जो लोग खून के संक्रमण या सेप्टीसीमिया के विकास के लिए 29% के रूप में उच्च हो सकता है। कोई भी व्यक्ति जो समुद्री भोजन की खपत या है समुद्री जल के संपर्क में खुला घाव वी के खतरे में है parahaemolyticus संक्रमण। बीमारियों, जीवन के लिए खतरा सेप्टीसीमिया के और अधिक गंभीर रूप है, अंतर्निहित चिकित्सा सह के साथ एक उप-जनसंख्या में अधिक आम हैnditions 11 है, जो शराब, यकृत रोग, मधुमेह, गुर्दे की बीमारी, दुष्टता, और अन्य शर्तों के एक कमजोर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए अग्रणी शामिल हैं। विशेष रूप से, व्यक्तियों के इस समूह वी की वजह से गंभीर बीमारियों से ग्रस्त होने के लिए एक उच्च जोखिम में भी है vulnificus, वी के समान प्राकृतिक निवास में पाया जा सकता है parahaemolyticus।

वी parahaemolyticus नियमित रूप से एक चयनात्मक और अंतर माध्यम के रूप में thiosulfate-साइट्रेट-पित्त लवण-सुक्रोज (TCBS) अगर उपयोग कर अलग किया जाता है। क्षारीय peptone पानी में संवर्धन TCBS अगर पर अलगाव आरंभ कर सकते हैं। TCBS पर प्रकल्पित कालोनियों तो आगे जैव रासायनिक परीक्षण और / या आणविक assays प्रजाति विशिष्ट जीन की उपस्थिति को निशाना बनाने का एक सरणी में परीक्षण कर रहे हैं। पीसीआर आधारित तरीकों अक्सर वी की पहचान की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं thermolabile hemolysin जीन amplifying, tlh 12 से parahaemolyticus।

चर्चा के बावजूदपुष्टि तरीकों के OICE, यह अलग और वी अंतर करने के लिए एक प्रभावी माध्यम के लिए महत्वपूर्ण है पहली जगह में अन्य समुद्री vibrios से parahaemolyticus। TCBS नियमित तौर पर उनकी क्षमता सुक्रोज 12 विक्षोभ के अनुसार विब्रियो जीनस के भीतर प्रजातियों अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। सकारात्मक प्रतिक्रिया किण्वन पीएच सूचक Bromothymol नीले रंग का एक रंग बदलने के साथ है। वी parahaemolyticus कालोनियों TCBS पर काफी विशिष्ट हैं, हरे रंग के लिए नीले रंग का प्रदर्शन। हालांकि, इस माध्यम आसानी वी अंतर नहीं कर सकते alginolyticus और वी कोलरा। सुक्रोज-fermenting बदलनेवाला प्रजाति पीले कालोनियों वी जैसी उत्पादन हो सकता है कोलरा या वी alginolyticus 13। TCBS, वी पर प्रारंभिक अलगाव पर parahaemolyticus भी Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides, और स्यूडोमोनास एसपीपी 14 के रूप में गलत पहचान की जा सकती है। देरी सुक्रोज Ferm साथ उपभेदोंप्रलेखन अन्य सुक्रोज nonfermenting विब्रियो 13 है, जो वी शामिल है के साथ भ्रमित हो सकता है parahaemolyticus। TCBS कोलाई, स्यूडोमोनास putrefaciens, दूसरों के बीच के खिलाफ संवेदनशील नहीं हो पाया था। कई अन्य प्रजातियों ग्रे कालोनियों जो संभवतः वी के साथ भ्रमित कर रहे हैं करने के लिए हरी उपज parahaemolyticus या वी vulnificus 15। नतीजतन, यह वांछनीय है का पता लगाने और वी को अलग-थलग करने की ओर बेहतर संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ वैकल्पिक संस्कृति विकसित करने के लिए मीडिया parahaemolyticus और अन्य निकट से संबंधित प्रजातियों।

कई मीडिया विकल्प के हाल ही में विकसित किया गया है। चयनात्मक एजेंटों के शामिल किए जाने के अलावा, ज्यादातर ने अपने अंतर enzymatic गतिविधियों पर आधारित प्रजातियों अंतर करने के लिए chromogenic substrates शामिल। उदाहरण के लिए, indoxyl-β-glucoside और indoxyl-β-galactoside वी अंतर करने के लिए chromogenic substrates के रूप में इस्तेमाल किया गया है पैरावी के उन लोगों से haemolyticus कालोनियों (जो दिखाई नीले-हरे रंग का) कोलरा (बैंगनी) उनके अंतर क्षमताओं की वजह से β-ग्लुकोसिडेस और β-galactosidase 16 उपज है। Chromogenic अगर के विभिन्न योगों के कई समूहों द्वारा विकसित मूल्यांकन किया गया है और करने के लिए तुलनात्मक या TCBS 17,18,19 की तुलना में बेहतर प्रदर्शन करने के लिए सूचित किया गया। एक chromogenic माध्यम का उपयोग कर का एक लाभ यह है कि आसपास के माध्यम के रंग जिससे विशेष रूप से कालोनियों के अलगाव को सुविधाजनक बनाने के लिए कम से कम है। इस अध्ययन में, हम पता लगाने और वी अलग करने के लिए एक नव तैयार की chromogenic माध्यम की क्षमता का मूल्यांकन कोलरा, वी parahaemolyticus, और वी vulnificus; वी अंतर करने की क्षमता पर विशेष ध्यान देने के साथ अन्य प्रजातियों से parahaemolyticus।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. मीडिया और माइक्रोबियल उपभेदों के संवर्धन

नोट: सभी प्रयोगों में सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करें। बाँझ सामग्री का प्रयोग करें। सभी कंटेनर, उपकरण और अभिकर्मक का उपयोग करने से पहले जीवाणुरहित। क्योंकि वे biohazardous माना जाता है निपटान करने से पहले सभी अपशिष्ट पदार्थों आटोक्लेव। आटोक्लेव तापमान और निम्न कार्यविधियों में से सभी के लिए समय संयोजन है ≥121 डिग्री सेल्सियस एक्स ≥15 मिनट।

  1. बनाने के लिए ~ 1 एल tryptic सोया अगर (टीएसए), पहले 1 एल एक चुंबकीय हलचल बार युक्त एक 2-एल Erlenmeyer फ्लास्क में विआयनीकृत पानी जोड़ें। एक कुप्पी है कि कम से कम दो बार अंतिम मात्रा से बड़ा प्रयोग करें। tryptic सोया शोरबा पाउडर के 30 ग्राम और 20 ग्राम फ्लास्क में कणिकाओं अगर जोड़ें।
    नोट: 2 का प्रयोग% अगर बजाय 1.5% कुछ विब्रियो एसपीपी के झुंड को सीमित करना।
    1. दोषी पर मोड़ से अच्छी तरह मिक्स। जबकि भावप्रवण, मिश्रण फोड़ा करने के लिए गर्मी पर बारी। हीटर से कुप्पी के रूप में जल्द हटाये रूप में मिश्रण फोड़ा करने के लिए शुरू होता है। शिथिल वें कवरएक टिन पत्र के साथ ई कुप्पी। कुप्पी के लिए यह आटोक्लेव से पहले सुरक्षित करने के लिए पन्नी टेप।
    2. tryptic सोया शोरबा (टीएसबी) बनाने के लिए, 1.1 चरण में नुस्खा से अगर न आना।
      नोट: Erlenmeyer फ्लास्क के बजाय बोतल का उपयोग कर सकते हैं।
    3. tryptic सोया अगर 2% सोडियम क्लोराइड या सोडियम क्लोराइड (TSAS) के साथ पूरक बनाने के लिए, सरगर्मी और हीटिंग से पहले मिश्रण में सोडियम क्लोराइड की 20 ग्राम जोड़ें। tryptic सोया शोरबा 2% सोडियम क्लोराइड (TSBs) के साथ पूरक बनाने के लिए, अगर न आना सरगर्मी और हीटिंग से पहले मिश्रण में सोडियम क्लोराइड की 20 ग्राम जोड़ें।
  2. मस्तिष्क दिल अर्क (भी) अगर बनाने के लिए, BHI पाउडर के 37 ग्राम और शुद्ध पानी का 1 एल में 15 ग्राम अगर कणिकाओं निलंबित। लगातार आंदोलन के साथ हीट पाउडर भंग करने के लिए। आटोक्लेव। अगर BHI शोरबा बनाने के लिए छोड़ देते हैं।
  3. TCBS अगर बनाने के लिए, शुद्ध पानी का 1 एल में TCBS पाउडर के 89 ग्राम के निलंबित। 1 मिनट के लिए लगातार आंदोलन और उबाल के साथ हीट पाउडर पूरी तरह से भंग करने के लिए। आटोक्लेव मत करो।
  4. सब अगर मीडिया के लिए, 45-5 गर्म अगर शांतएक पानी के स्नान में 0 डिग्री सेल्सियस। पांच से छह प्लेटों के ढेर में खाली पेट्री प्लेटों की व्यवस्था। ढेर के नीचे से शुरू, प्रत्येक पेट्री थाली में पिघला हुआ अगर डालना बारे में आधा भरा पहुँचने के लिए। गिरने के बाद पेट्री थाली ढक्कन बंद कर दें। अगर दे प्लेटों कमरे के तापमान पर बैठने से जमना करने की अनुमति दें।
    1. अगर प्लेट अगले दिन या 12 घंटे के बाद का प्रयोग करें। अप करने के लिए दो सप्ताह के लिए एक रेफ्रिजरेटर में अप्रयुक्त प्लेटें स्टोर। उपयोग करने से पहले, फ्रिज से प्लेटों को दूर करने और कम से कम 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर उन्हें संतुलित करना।
      नोट: एक लीटर अगर ~ 45 अगर प्लेटें बनाता है। अगर प्लेट तैयार करने के दिन पर पर्याप्त रूप से सूखी, और उन्हें कमरे के तापमान को संतुलित कोल्ड स्टोरेज के बाद प्रभावी रूप से कालोनियों के प्रसार को कम करने के लिए अनुमति दें।
  5. चॉकलेट और chromogenic अगर प्लेट प्राप्त करें और प्रत्येक प्रयोग से पहले कमरे के तापमान पर उन्हें संतुलित करना।
  6. सभी 54 माइक्रोबियल तालिका 1 हर कुछ दा में दिखाया गया उपभेदों उपसंस्कृतिवाई एस।
    1. एक जमे हुए शेयर या ऐसे BHI, टीएसबी / टीएसए या चॉकलेट अगर के रूप में गैर-चयनित मीडिया के लिए पिछले एक बैच से संस्कृतियों के हस्तांतरण के लिए एक बाँझ inoculating पाश का प्रयोग करें। हलोपलिक विब्रियो एसपीपी के लिए आगे बढ़ें। TSBs / TSAS पर।
    2. संस्कृति की शुद्धता की जांच करने के लिए, लकीर एक पैटर्न है कि अलग कालोनियों के अवलोकन के लिए अनुमति होगी में सभी उपभेदों। उदाहरण के लिए, छोटी राशि के लिए बैक्टीरिया की एक बड़ी राशि को कमजोर करने के लिए, अंततः अलग कालोनियों से बेदखल एक तीन चरण streaking पैटर्न का उपयोग करें।
  7. प्लेटों अप करने के लिए 48 घंटे के लिए 35-37 डिग्री सेल्सियस पर ऊपर से नीचे सेते हैं। कैम्पिलोबैक्टर एसपीपी के लिए।, ट्यूब या प्लेटों सेते एक बंद ढक्कन एक गैस थैली युक्त जार में एक microaerophilic वातावरण का निर्माण करने के लिए। ऊष्मायन के बाद कॉलोनी आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें। शुद्ध संस्कृतियों कालोनियों कि इसी कॉलोनी आकृति विज्ञान का प्रदर्शन उपज चाहिए।
    नोट: सभी प्लेटों कर्नल पर गिरने से ढक्कन के नीचे पर गठित गाढ़ा पानी की बूंदों को रोकने के लिए ऊपर से नीचे सेतेonies।

2. प्रजाति निर्धारण पीसीआर द्वारा

  1. Tlh -PCR आचरण वी की पहचान की पुष्टि करने के लिए parahaemolyticus उपभेदों। उपयोग प्राइमरों एफ (5 'एएए GCG GAT जैसे जीसीए GAA जीसीए CTG 3') और tlh आर (5 'GCT अधिनियम टीटीसी टैग कैट TTT सीटीसी टी जी सी 3') thermolabile hemolysin जीन 20 के एक 450-बीपी टुकड़ा बढ़ाना TLH ।
    1. प्रत्येक वी के कुछ अलग कॉलोनियों के हस्तांतरण के लिए एक बाँझ inoculating पाश का प्रयोग करें TSAS से TSBs के 5 मिलीलीटर parahaemolyticus तनाव। 16-24 घंटे के लिए 35-37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. 1 मिनट के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र संस्कृतियों। तैरनेवाला निकालें और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ दो बार गोली धोने। 3 मिनट के लिए उबाल लें निलंबन सेल lysate उपज के लिए।
      नोट: वी parahaemolyticus lysed होना आसान है। इसलिए सेल अभिकर्मक की आवश्यकता नहीं है। यह भी टेम्पलेट के रूप में सीधे कॉलोनी के एक बिट का उपयोग करने के लिए संभव है।
    3. एक 25 μl प्रतिक्रिया वी में पीसीआर प्रदर्शनolume। 1x पीसीआर बफर के अंतिम एकाग्रता, 1.5 मिमी 2 MgCl, प्रत्येक dNTP के 100 सुक्ष्ममापी, प्रत्येक प्राइमर के 1 माइक्रोन, 1 यू Taq पोलीमरेज़ और सेल lysate के 1 μl युक्त एक प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें। 5 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर preincubation, 30 सेकंड, 30 सेकंड के लिए 58 डिग्री सेल्सियस, और 60 सेकंड 21 के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 35 प्रवर्धन चक्र चलाने के बाद।
    4. 1.5% agarose जैल में 5 μl amplicon का लोड aliquots। बिजली की आपूर्ति चालू करें वैद्युतकणसंचलन शुरू करने के लिए। ethidium ब्रोमाइड धुंधला के बाद यूवी रोशनी के तहत उपस्थिति या अनुपस्थिति amplicons की कल्पना।

3. पर चयनात्मक और विभेदक मीडिया ग्रोथ

  1. दो से चार दिन पहले प्रयोग, लकीर सभी माइक्रोबियल उपभेदों कॉलोनी अलगाव के लिए गैर-चयनित मध्यम (TSAS, BHI या चॉकलेट अगर) पर तालिका 1 में दिखाया गया है। 48 घंटे के लिए 35-37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं। ऊष्मायन के बाद कॉलोनी आकृति विज्ञान को देख कर संस्कृतियों की शुद्धता की जांच। शुद्ध संस्कृतियों कालोनियों कि इसी कॉलोनी आकृति विज्ञान का प्रदर्शन उपज चाहिए।
  2. शोरबा के 5 मिलीलीटर में 3.1 चरण से कुछ अलग कालोनियों स्थानांतरण। 16-24 घंटे के लिए 35-37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों सेते हैं।
    ध्यान दें: युवा कालोनियों का प्रयोग करें, जो कम से कम चार दिन पुराने हैं, सभी प्रयोगों में रात भर संस्कृतियों तैयार करने के लिए।
  3. स्ट्रीक कॉलोनी अलगाव के लिए चयनात्मक और अंतर मीडिया (TCBS और chromogenic अगर) पर रात भर संस्कृतियों का loopful। अप करने के लिए 96 घंटे के लिए 35-37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
  4. और थाली पर दोनों संस्कृति घनत्व पृथक कालोनियों के आकार का परीक्षण करके सभी नस्लों के समग्र विकास के रिकॉर्ड। परिवेश और / या पराबैंगनी प्रकाश के तहत कालोनियों का रंग रिकॉर्ड। नोट ऐसी ऊंचाई, मार्जिन और फार्म के रूप में अलग-थलग कॉलोनी की अन्य विशेषताओं।

4. वसूली परख

  1. वी के एक प्रतिनिधि सबसेट का चयन करें parahaemolyticus उपभेदों (एन = 14) कि विभिन्न सीरमप्रकारों और अलगाव के मूल धरना
  2. रात भर संस्कृतियों का एक मानक थाली गणना विधि आचरण के रूप में नीचे वर्णित है।
    1. भंवर रात भर संस्कृतियों में अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए। एक ट्यूब युक्त 900 μl पीबीएस में रातोंरात संस्कृति के 100 μl के हस्तांतरण से 10 गुना या 10 -1 कमजोर पड़ने बनाओ। भंवर मिश्रण करने के लिए अच्छी तरह से।
    2. जिसमें 900 μl पीबीएस एक और ट्यूब के लिए 10 -1 कमजोर पड़ने ट्यूब से 100 μl हस्तांतरण करने के लिए एक नया pipet टिप का उपयोग करें। भंवर मिश्रण करने के लिए अच्छी तरह से। यह 10 -2 कमजोर पड़ने का गठन किया। प्रक्रिया क्रमिक रूप से 10 -7 कमजोर पड़ने प्राप्त करने के लिए दोहराएँ।
    3. 10 -4 10 -7 को कमजोर पड़ने ट्यूब का उपयोग, 100 μl प्रत्येक प्लेट chromogenic, TCBS और TSAS अगर प्लेटों पर।
      नोट: कमजोर पड़ने कारक (डीएफ) थाली पर 10 -5 10 -8 क्रमश हो जाता है।
    4. टी पर समान रूप से फैला हुआ है aliquotsवह सतह अग्रवाल।
      नोट: यह एक ही माध्यम पर तनाव प्रति एक ही स्प्रेडर का उपयोग करने के लिए ठीक है, जब तक सबसे पतला विभाज्य पहले फैला हुआ है (यानी, 10 -8 से 10 -5 के लिए)। विभिन्न मीडिया के लिए एक ही स्प्रेडर का प्रयोग न करें।
    5. अप करने के लिए 96 घंटे के लिए 35-37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं। प्लेटों पर कालोनियों की गिनती। वह भी गिनती करने के लिए कई (TNTC) या 25 की गणना CFU / निम्नलिखित के अनुसार मिलीलीटर से कम नहीं हैं असर कालोनियों प्लेटों पर ध्यान न दें:
      1 समीकरण
      कहा पे
      एन = undiluted ट्यूब में कोशिकाओं की संख्या, CFU / एमएल या CFU / छ रूप में व्यक्त किया
      सी = प्लेटों पर गिना कालोनियों की कुल संख्या 25-300 कालोनियों सहन
      n 1 = प्लेट (ओं) की संख्या जहां गिना कालोनियों कम DF से कर रहे हैं
      2 n प्लेट (ओं) की संख्या जहां गिना कालोनियों बाद 10 गुना कमजोर पड़ने से कर रहे हैं =
      घएफ कम कमजोर पड़ने कारक = (यानी, और अधिक ध्यान केंद्रित कमजोर पड़ने)
  3. विभिन्न मीडिया के बीच CFU / एमएल की तुलना करें। 100% के रूप TSAS पर CFU / एमएल का प्रयोग करें, वी के% वसूली की गणना parahaemolyticus chromogenic और TCBS अगर पर हो।

5. प्रतियोगिता परख

  1. उपभेदों कि chromogenic और TCBS अगर पर विभिन्न कॉलोनी morphologies दिखा रहे हैं की एक सबसेट का चयन करें।
    नोट: इस तरह, यह कालोनियों वी से उत्पन्न गिनती करने के लिए संभव हो जाएगा केवल parahaemolyticus, inoculum में अन्य प्रजातियों की उपस्थिति के बावजूद।
    1. एक वी चुनें parahaemolyticus तनाव है कि, TCBS और chromogenic अगर पर होने की उम्मीद है फ़िरोज़ा और सियान कालोनियों पैदावार क्रमश।
    2. एक गैर वी चुनें parahaemolyticus और एक गैर विब्रियो प्रजाति है कि इन मीडिया के किसी पर जाना नहीं है, या अलग कॉलोनी रंग दिखा रहे हैं।
      नोट: उदाहरण के लिए, वी metschnikovii बहुत कमजोर बढ़ता हेn TCBS और chromogenic अगर पर विकसित नहीं किया। शिगेला sonnei TCBS पर नहीं उगते लेकिन chromogenic अगर पर मैजेंटा कालोनियों अर्जित करता है।
  2. ऊपर स्ट्रेन के चयन के बाद, गैर-चयनित मीडिया पर हो अलग कालोनियों का उपयोग कर रात भर शोरबा संस्कृतियों तैयार करते हैं।
    1. वी के रात भर संस्कृतियों बनाओ parahaemolyticus और वी TSAS से TSBs के 5 मिलीलीटर करने के लिए कुछ अलग कॉलोनियों के हस्तांतरण से metschnikovii। 16-24 घंटे के लिए 35-37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. BHI शोरबा के 5 मिलीलीटर BHI अगर से कुछ अलग कॉलोनियों के हस्तांतरण से शिगेला sonnei की रात भर संस्कृतियों बनाओ। 16-24 घंटे के लिए 35-37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. प्रत्येक तनाव के लिए, कदम 4.2.1 और 4.2.2 के लिए इसी तरह एक कमजोर पड़ने श्रृंखला प्रदर्शन करते हैं। TSAS या BHI पर प्लेट उचित dilutions रातोंरात संस्कृति के CFU / एमएल निर्धारित करने के लिए, समीकरण चरण 4.2.5 में दिखाया गया है का उपयोग कर।
    नोट: आमतौर पर, 10 -5 के लिए 10 -7 कमजोर पड़ने से 100 μlट्यूबों के सबसे संस्कृतियों के लिए काम करता है। अगले चरण में इस्तेमाल किया कोशिकाओं की सही मात्रा की गणना वापस करने के लिए CFU / एमएल मूल्यों का प्रयोग करें। गणना CFU / एमएल मूल्यों, ऊष्मायन के बाद प्राप्त कर रहे हैं, हालांकि निम्नलिखित कदम कदम 5.3 के रूप में एक ही तिथि पर प्रदर्शन कर रहे हैं।
  4. कदम 5.2 और 5.3 में रात भर संस्कृतियों और कमजोर पड़ने की नलियों का प्रयोग, एक वी के विभिन्न मात्रा के मिश्रण parahaemolyticus तनाव और एक गैर-वी parahaemolyticus प्रजातियों। उदाहरण के लिए, वी के 10 -5 कमजोर पड़ने ट्यूब के 500 μl मिश्रण वी के रात भर संस्कृतियों के 500 μl के साथ parahaemolyticus metschnikovii।
    ध्यान दें: इस मिश्रण को उच्च microflora पृष्ठभूमि simulates। एक कम microflora पृष्ठभूमि अनुकरण करने के लिए, दोनों प्रजातियों से 500 μl 10 -5 कमजोर पड़ने ट्यूब के प्रत्येक मिश्रण।
  5. मिश्रण के 100 μl प्रत्येक बिखरा chromogenic, TCBS और TSAS अगर प्लेटों पर।
  6. 35-37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के बाद 96 घंटा के लिए ऊपर, वी की कालोनियों की गिनती के लिए parahaemolyticus और गैर-वी chromogenic और TCBS अगर पर विकास और कॉलोनी आकृति विज्ञान में उनके अंतर के आधार पर parahaemolyticus प्रजातियों।
    नोट: उदाहरण के लिए, यदि गैर-वी parahaemolyticus प्रजातियों chromogenic और TCBS अगर पर नहीं उगते, सभी कालोनियों वी का हो जाएगा parahaemolyticus। गैर-वी, तो parahaemolyticus प्रजातियों दोनों मीडिया पर बढ़ता है, chromogenic अगर पर TCBS और सियान कालोनियों पर केवल फ़िरोज़ा कालोनियों वी का हो जाएगा parahaemolyticus। गैर-वी parahaemolyticus प्रजाति या वी के समान आकृति विज्ञान कॉलोनी का प्रदर्शन नहीं हो सकता है TSAS पर parahaemolyticus।
    1. गैर-वी, तो parahaemolyticus प्रजातियों वी को इसी तरह से बढ़ता है इस गैर-चयनित माध्यम पर parahaemolyticus, वी के लिए संख्या प्राप्त करने के लिए दो से कॉलोनी गिनती विभाजित केवल parahaemolyticus। चरण 5.3 से निकाली गई उम्मीद गिनती के साथ वास्तविक कॉलोनी गिनती की तुलना करें।

6. उड़ानोंसीप homogenates की ECTS

  1. वजन मांस और शराब सहित से ≥12 मोलस्का शंख ≥50 जी सीप मांस।
    1. सीप मांस और शराब के लिए पीबीएस के बराबर राशि जोड़ें। 90 सेकंड के लिए उच्च गति पर मिश्रण ब्लेंड। यह 2 -1 पतला सीप homogenate का गठन किया।
    2. 2 -1 पतला सीप homogenate की 100 ग्राम पीबीएस के 400 ग्राम में जोड़े। वजन, नहीं मात्रा को मापने के लिए पैमाने का प्रयोग करें। 1 मिनट के लिए उच्च गति पर मिश्रण ब्लेंड। सीप homogenate आटोक्लेव।
      नोट: इस सीप spiking के लिए इस्तेमाल किया homogenate होगा।
  2. सीप homogenate की उपस्थिति में वसूली परख (चरण 4) दोहराएँ।
    1. बाद 500 ग्राम सीप homogenate शांत होता है, वी के 100 μl जोड़ने यह करने के लिए TSBs में उगाया रात भर संस्कृतियों parahaemolyticus। वी की वास्तविक राशि का निर्धारण करते हैं स्टैंडर्ड प्लेट गिनती प्रक्रियाओं 4.2 कदम में वर्णित द्वारा आयोजित inoculum में parahaemolyticus कोशिकाओं।
  3. निरसितसीप homogenate की उपस्थिति में प्रतियोगिता परख (चरण 5) खाते हैं।
    1. बाद 500 ग्राम सीप homogenate शांत होता है, वी के रात भर संस्कृतियों में से प्रत्येक के μl 100 जोड़ने parahaemolyticus और गैर वी यह करने के लिए parahaemolyticus। जीवाणु की वास्तविक राशि का निर्धारण करते हैं स्टैंडर्ड प्लेट गिनती प्रक्रियाओं का आयोजन द्वारा inoculum में कोशिकाओं को 4.2 कदम में वर्णित
  4. अच्छी तरह से एक homogenizer का उपयोग करके सीप homogenate साथ बैक्टीरियल कोशिकाओं मिक्स।
    नोट: मिश्रण के बाद, सीप जानबूझकर जोड़ा कोशिकाओं से युक्त कहा जाता है homogenate सीप homogenate नुकीला।
  5. नुकीला सीप homogenate के dilutions प्रक्रियाओं चरण 4.2.2 में वर्णित के अनुसार 10 -1 10 -3 को कमजोर पड़ने नलियों प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित करें। chromogenic, TCBS और TSAS अगर पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के 100 μl बिखरा हुआ है। अप करने के लिए 96 घंटे के लिए 35-37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
  6. पूर्व के साथ chromogenic और TCBS अगर पर वास्तविक कॉलोनी गिनती की तुलना करेंpected कॉलोनी गिनती कदम 6.2.1 और 6.3.1 से deduced।
    नोट: उदाहरण के लिए, अगर वी की एक ट्यूब parahaemolyticus रात संस्कृति 10 8 CFU / एमएल, 100 μl के एक inoculum मतलब यह है कि 10 7 कोशिकाओं सीप homogenate के 500 ग्राम के लिए जोड़ रहे हैं, उपज 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं / ग्राम होता है। कमजोर पड़ने और चढ़ाना के बाद, थाली DF होने = 10 -2 500 कालोनियों उपज चाहिए; जबकि उस होने DF = 10 -3 50 कालोनियों उपज चाहिए। ये उम्मीद कॉलोनी की गिनती के हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस अध्ययन में, 54 माइक्रोबियल उपभेदों इकट्ठे हुए थे, जो वी के भीतर 22 उपभेदों शामिल parahaemolyticus प्रजातियों, 19 अन्य विब्रियो प्रजातियों, और 13 गैर विब्रियो प्रजातियों (1 टेबल)। अधिकांश वी parahaemolyticus उपभेदों या तो एफडीए, सीडीसी या अन्य राज्य के स्वास्थ्य विभाग से प्राप्त हुए थे। वे विविध सीरमप्रकारों और अलगाव के सूत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं। ये उपभेदों पहले नियामक एजेंसियों द्वारा की पहचान की गई। हम आगे इन वी की पहचान की पुष्टि की एक tlh -PCR 21,22 द्वारा आयोजित parahaemolyticus।

जाति उपभेदों की संख्या का परीक्षण किया विकास और कालोनियों के रंग
TCBS सीhromogenic मध्यम
Aeromonas hydrophila 2 कोई विकास नहीं 1 कोई विकास तनाव;
1 तनाव मैजेंटा रंग
कैनडीडा अल्बिकन्स 1 कमजोर विकास, पीले कोई विकास नहीं
कैंपाइलोबैक्टर जेजुनी 1 कोई विकास नहीं कोई विकास नहीं
इशरीकिया कोली 1 कोई विकास नहीं कमजोर विकास, मैजेंटा
रूप बदलने वाला मिराबिलिस 1 कोई विकास नहीं कोई विकास नहीं
Pseudomonas aeruginosa 2 फ़िरोज़ा पीला
स्टेफिलोकोकस ऑरियस 1 कमजोर विकास, पीले कोई विकास नहीं
साल्मोनेला choleraesuहै 1 कोई विकास नहीं कोई विकास नहीं
शिगेला boydii 1 कोई विकास नहीं कोई विकास नहीं
शिगेला flexneri 1 कोई विकास नहीं कोई विकास नहीं
शिगेला sonnei 1 कोई विकास नहीं कमजोर विकास, मैजेंटा
विब्रियो alginolyticus 3 पीले या फ़िरोज़ा पीला
कोलरा 4 पीले या फ़िरोज़ा मैजेंटा
वी damsela 1 फ़िरोज़ा कोबाल्ट
वी fisheri 1 कमजोर विकास, पीले कोई विकास नहीं
वी fluvialis 1 फ़िरोज़ा कोबाल्ट
वीfurnissii 1 पीला पीला
वी hollisae 1 फ़िरोज़ा पीला
वी metschnikovii 1 कोई विकास नहीं कोई विकास नहीं
वी mimicus 1 फ़िरोज़ा मैजेंटा
वी parahaemolyticus 22 अधिकांश उपभेदों फ़िरोज़ा अधिकांश उपभेदों सियान; कुछ स्पष्ट
वी proteolyticus 1 फ़िरोज़ा कोबाल्ट
वी vulnificus 4 फ़िरोज़ा या स्पष्ट मैजेंटा

तालिका 1 माइक्रोबियल इस अध्ययन में इस्तेमाल प्रजातियों और चयनात्मक और अंतर मीडिया पर उनके विकास विशेषताओं। रंग बुला बीए थाएक रंग पहिया पर sed। सियान चैती के समान है; मैजेंटा गुलाबी लैवेंडर के समान है, मरकत हरे रंग के लिए इसी तरह की है, पीले और भूरे जैतून शामिल हैं।

TCBS और chromogenic अगर - चार अलग परीक्षणों चयनात्मक और अंतर मीडिया पर इन नस्लों के विकास और कॉलोनी आकृति विज्ञान निर्धारित करने के लिए आयोजित की गई। TCBS पारंपरिक कुछ विब्रियो प्रजातियों के अलगाव, वी सहित के लिए इस्तेमाल किया माध्यम है कोलरा और वी parahaemolyticus 12। TCBS पर हो कालोनियों के रंग भिन्नता पीले, फिरोजा (हरा) या स्पष्ट (चित्रा 1) था।

आकृति 1
चित्रा 1. कालोनी विब्रियो एसपीपी की आकृति विज्ञान। TCBS अगर। वी पर parahaemolyticus (फ़िरोज़ा), वी कोलरा (पीला), और AM दो प्रजातियों की ixed टीका (क)। वी की कालोनियों parahaemolyticus फ़िरोज़ा दिखाई देते हैं, एक परिपत्र, पूरी, और उत्तल आकृति विज्ञान (बी) के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

खाद्य और पर्यावरण नमूनों से चिकित्सकीय प्रासंगिक विब्रियो प्रजातियों के लिए चयन करने के लिए एक नया chromogenic माध्यम की क्षमता का परीक्षण किया गया था। साथ ही, इस माध्यम की क्षमता एक साथ एक दूसरे से इन प्रजातियों में भेद करने के लिए मूल्यांकन किया गया था। कालोनी रंग chromogenic अगर पर मनाया कोबाल्ट, सियान, Magenta, पीला या स्पष्ट (चित्रा 2) थे। जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है, दोनों TCBS और chromogenic अगर गैर विब्रियो सूक्ष्मजीवों के खिलाफ चयनात्मकता के कुछ डिग्री का प्रदर्शन किया।

1 "> चित्र 2
चित्रा 2. कालोनी विब्रियो एसपीपी की आकृति विज्ञान। नव विकसित chromogenic अगर पर। वी parahaemolyticus (सियान), वी कोलरा (मैजंटा), और दो प्रजातियों में से एक मिश्रित टीका (क)। वी की कालोनियों parahaemolyticus, सियान दिखाई एक परिपत्र, पूरी, और उत्तल आकृति विज्ञान (बी) के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

रात भर संस्कृतियों पर मानक थाली गणना विधि के बाद, वी की कालोनियों parahaemolyticus उच्चतम कमजोर पड़ने कारक (यानी, DF = 10 -8) प्राप्त करने chromogenic अगर प्लेटों पर मनाया गया। इन परिणामों के एक गैर-चयनित माध्यम पर उन लोगों के बराबर थे (TSAS)। यह पता चलता है कि chromogenic माध्यम की सीमा का पता लगाने गैर-चयनित मीडिया है, जो लगभग 10 कोशिकाओं या भोजन मैट्रिक्स के अभाव में कम है के समान है। ऐसे वी के रूप में अन्य विब्रियो प्रजातियों के लिए पता लगाने की क्षमता alginolyticus, वी fluvialis और वी युवती गैर-चयनित मध्यम की तुलना में भी सभ्य था। हालांकि, वी के कुछ उपभेदों कोलरा, वी vulnificus और वी mimicus 10 को chromogenic अगर पर 100 गुना कम CFU झुकेंगे। चयनात्मक chromogenic या अन्य चयनात्मक मीडिया में इस्तेमाल एजेंटों अनिवार्य रूप से कुछ कोशिकाओं को रोकती हैं। घायल कोशिकाओं, उदाहरण के लिए, चयनात्मक मीडिया में ठीक नहीं कर सकता। फिर भी, थोड़ा गरीब का पता लगाने की क्षमता सबसे अधिक नियमित प्रक्रिया है कि एक संवर्धन कदम को रोजगार में एक गैर मुद्दा है। भोजन या पर्यावरणीय नमूने में सूक्ष्मजीवों की छोटी राशि संवर्धन शोरबा में एक उच्च स्तर तक बढ़ जाएगा, पता लगाने सीमा पार कर गई। क्षारीय peptone पानी में संवर्धन ofte हैn पर्यावरणीय नमूने 12 में विब्रियो प्रजातियों के प्रसार को निर्धारित करने के लिए किया।

सीप homogenate की उपस्थिति में, chromogenic अगर वसूली का एक अच्छा डिग्री प्रदर्शित करने के लिए जारी रखा। दूसरे शब्दों में, एक बड़ा हिस्सा (> 70%) वी के parahaemolyticus कोशिकाओं, सीप मैट्रिक्स (चित्रा 3 ए) की उपस्थिति से अप्रभावित chromogenic अगर पर विकसित करने के लिए सक्षम थे। विकास और वी की वसूली parahaemolyticus कोशिकाओं को भी एक और विब्रियो प्रजातियों (चित्रा 3 बी) की उपस्थिति से प्रभावित नहीं था। यह एक महत्वपूर्ण विशेषता है, क्योंकि पर्यावरण के नमूनों विभिन्न विब्रियो प्रजातियों को शामिल करने के लिए बाध्य कर रहे हैं जो विशेष रूप से एक संवर्धन प्रक्रिया के बाद उच्च संख्या में हैं।

चित्र तीन
चित्रा 3। strong> वी का प्रतिशत वसूली साथ और एक जीवाणु प्रतियोगी बिना सीप homogenate में parahaemolyticus तनाव। रिकवरी (± एसडी मतलब है) बनाम होने की उम्मीद है CFU मनाया अगर प्लेटों पर गिनती के अनुसार गणना की गई। उम्मीद CFU गिनती inoculum में बैक्टीरियल लोड के आधार पर गणना की गई। एक वी के उच्च वसूली parahaemolyticus तनाव प्रतियोगिता के बिना सभी मीडिया पर मनाया गया (क)। वसूली के समान स्तर वी की जब उच्च स्तर मनाया गया metschnikovii कोशिकाओं वर्तमान (ख)। था कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

आगे chromogenic और TCBS अगर तुलना करने के लिए, संवेदनशीलता और विशिष्टता की गणना की गई। तालिका 2 ACCU करने के लिए इन मीडिया की क्षमता को दर्शाता हैrately वी की पहचान parahaemolyticus। संवेदनशीलता सच सकारात्मक का प्रतिशत है, जो वी का मतलब है से संबंधित है parahaemolyticus उपभेदों मीडिया पर उम्मीद कॉलोनी आकृति विज्ञान झुकेंगे। विशिष्टता सच नकारात्मक का प्रतिशत है, जो गैर-वी का मतलब है से संबंधित है parahaemolyticus उपभेदों कोई विकास नहीं, या वी तुलना में एक अलग कॉलोनी आकृति विज्ञान के लिए गरीब प्रदर्शन करना चाहिए parahaemolyticus। संवेदनशीलता और TCBS के लिए विशिष्टता वी की पहचान करने के लिए parahaemolyticus 86.4% और 71.8%, क्रमशः थे। इसकी तुलना में, संवेदनशीलता और chromogenic माध्यम की विशिष्टता 90.9% और 96.9%, क्रमशः थे।

ए)
TCBS अगर वी parahaemolyticus गैर-वी। parahaemolyticus
अच्छी वृद्धि और फ़िरोज़ा गolonies 19 9
गरीबों के विकास या गैर फ़िरोज़ा कालोनियों 3 23
ख)
chromogenic अगर वी parahaemolyticus गैर-वी। parahaemolyticus
अच्छी वृद्धि और सियान कालोनियों 20 1
गरीबों के विकास या गैर सियान कालोनियों 2 31

तालिका 2 संवेदनशीलता और TCBS की विशिष्टता (क) और chromogenic (ख) वी का पता लगाने में अगर parahaemolyticus। वी की पहचान parahaemolyticus जैव रासायनिक परीक्षण और tlh- पीसीआर द्वारा पहले से निर्धारित किया गया है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस अध्ययन संस्कृति मीडिया के विकास और मूल्यांकन पर केंद्रित है। चयनात्मक पारंपरिक, TCBS है और मध्यम अलग और पता लगाने के लिए इस्तेमाल वी अंतर parahaemolyticus, कोलरा और वी vulnificus 12। हालांकि, इस तरह के सीमाओं में असमर्थता वी अंतर करने के लिए के रूप में इस माध्यम के लिए सूचित किया गया है, अन्य विब्रियो कोलरा प्रजातियों से। सुक्रोज और पीएच सूचक TCBS के भेदभाव एजेंट हैं। इस प्रकार, सूक्रोज किण्वक द्वारा एसिड का उत्पादन माध्यम के रंग बदलने का कारण बनता है। मध्यम के रंग TCBS की एक खामी है क्योंकि यह कॉलोनी आकृति विज्ञान के अवलोकन अस्पष्ट हो सकता है। नव विकसित chromogenic मध्यम कई समुद्री नमूनों में पाया गैर विब्रियो प्रजातियों के विकास को दबाने के लिए उच्च पीएच और लवणता का इस्तेमाल करता है। नई chromogenic मध्यम 8.6 ± 0.2 के अंतिम पीएच है। प्रति विआयनीकृत पानी की लीटर, यह peptone के 10 ग्राम, समुद्री नमक के मिश्रण की 10 ग्राम, बैल पित्त के 10 ग्राम, सोडियम के 10 ग्राम के होते हैंthiosulfate, खमीर निकालने के 5 ग्राम, सोडियम साइट्रेट के 5 ग्राम, सोडियम कार्बोनेट का 2.2 जी, लैक्टोज के 2 जी, सोडियम पाइरूवेट की 0.5 ग्राम, एक chromogenic मिश्रण की 0.3 ग्राम और अगर की 15 ग्राम। Chromogenic मिश्रण विब्रियो एसपीपी के बीच भेदभाव की अनुमति देता है। कुछ एंजाइमों का उत्पादन करने के लिए उनकी क्षमता के अनुसार अंतर है। इसके बजाय TCBS अगर मध्यम, विभिन्न विब्रियो एसपीपी के रंग में फेरबदल की। नई chromogenic माध्यम पर अलग अलग रंग कॉलोनी का प्रदर्शन होगा। इसकी तुलना में, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध chromogenic मध्यम अगर की 15 ग्राम, peptone और खमीर निकालने की 8 ग्राम, नमक के 51.4 ग्राम, एक chromogenic मिश्रण की 0.3 ग्राम और 9.0 ± 0.2 के अंतिम पीएच शामिल हैं।

एक परख मूल्यांकन की मजबूती नमूना आकार पर निर्भर करता है। अलग और वी का पता लगाने के बाद से इस अध्ययन के नए chromogenic माध्यम की प्रभावशीलता पर जोर देती है parahaemolyticus, यह कई विविध वी एकत्र करने के लिए महत्वपूर्ण है parahaemolyticus उपभेदों। पिछला TCBS की तुलना अध्ययन औरनई संस्कृति मीडिया अक्सर पर्यावरण या भोजन के नमूने अज्ञात प्रकार के और सूक्ष्मजीवों 23,24,25,26 की मात्रा युक्त शामिल किया गया। नमूना प्रति एकाधिक कालोनियों अलग थे अभी तक वियोजन का प्रतिरूप प्रकृति अक्सर अनपेक्षित था। आदर्श रूप में, विभिन्न प्रकारों परख विकास में परीक्षण किया जाना चाहिए अन्यथा परख की सटीकता फुलाया किया जाएगा। तनाव पहचान ऐसे स्पंदित क्षेत्र जेल वैद्युतकणसंचलन (PFGE) या बहु-ठिकाना अनुक्रमण के रूप में पारंपरिक तरीकों subtyping द्वारा स्थापित किया जा सकता है। वी इस अध्ययन में parahaemolyticus उपभेदों पहले ribotyping और PFGE 19 की विशेषता थे।

परख विकास के दौरान, संवेदनशीलता, विशिष्टता और सीमा का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण कारकों की जांच की जा शामिल हैं। संवेदनशीलता भी सटीकता या नैदानिक ​​संवेदनशीलता के रूप में जाना जाता है, संदर्भ और परीक्षण तरीकों के बीच सकारात्मक प्रतिशत समझौता है। विशिष्टता, यह भी सटीक या नैदानिक ​​विशिष्टता के रूप में जाना जाता है, नकारात्मक प्रतिशत एक है संदर्भ और परीक्षण तरीकों के बीच greement। इस अध्ययन में, हम संदर्भ विधि के रूप में पीसीआर आधारित विधि का इस्तेमाल किया क्योंकि परिणाम अलग समूहों के बीच सत्यापित किया गया। TCBS और chromogenic मीडिया परीक्षण तरीकों थे। संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए, वी का परिणाम parahaemolyticus उपभेदों इस्तेमाल किया गया, यानी, संवेदनशीलता = 100% x सच सकारात्मक / (सच सकारात्मक + झूठी नकारात्मक)। दूसरी ओर, गैर वी का परिणाम parahaemolyticus उपभेदों विशिष्टता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे थे; और इसलिए, विशिष्टता = 100% x सच नकारात्मक / (सच नकारात्मक + झूठी सकारात्मक)। अधिक विश्वसनीय विशिष्टता परिणाम प्रदान करने के लिए, गैर वी parahaemolyticus उपभेदों एक वातावरण में जहां नमूना आयोजित किया जाएगा से अलग किया जाना चाहिए। हमारी संवेदनशीलता और विशिष्टता गणना परख विकास और सत्यापन के लिए संबंधित विषय पर सरकार 27, शिक्षा 28 और वैज्ञानिक संगठन 29 द्वारा लिखित दस्तावेजों पर आधारित हैं।

NT "> हमारे परिणामों के आधार पर, chromogenic मध्यम वी parahaemolyticus की पहचान करने में TCBS की तुलना में बेहतर प्रदर्शन दिखाया। संदर्भ विधि और chromogenic मध्यम बीच समग्र प्रतिशत समझौते 94.4%, संदर्भ विधि और TCBS के बीच 77.8% की तुलना में है। संवेदनशीलता और chromogenic माध्यम की विशिष्टता जो TCBS (86.4% और 71.9%, क्रमशः) के उन लोगों की तुलना में अधिक कर रहे हैं क्रमशः 90.9% और 96.9% कर रहे हैं। पिछला वी parahaemolyticus का पता लगाने के लिए अन्य chromogenic मीडिया के मूल्यांकन के अध्ययन में पाया गया कि संवेदनशीलता लेकर 85 से 88% करने के लिए, जबकि specificities लेकर 94 से 95% 23,24,25 करने के लिए। हालांकि, इन अध्ययनों में एक ही गणना पद्धति हमारे अध्ययन के रूप में इस्तेमाल नहीं किया। इसके अलावा, वे कभी कभी एक अलग संदर्भ विधि का इस्तेमाल किया या वे दोनों जैव रासायनिक से परिणाम संयुक्त विश्लेषण करती है और एक परीक्षण विधि के रूप में chromogenic मध्यम। एक परिणाम के रूप में, यह सीधे इन पिछले अध्ययनों के साथ हमारे परिणामों की तुलना करना मुश्किल है।

वी का पता लगाने में बेहतर प्रदर्शन का प्रदर्शन करने के अलावा parahaemolyticus, chromogenic इस अध्ययन में इस्तेमाल अगर यह भी मध्यम सूत्र में एक chromogenic मिश्रण के शामिल किए जाने के कारण TCBS की तुलना में अधिक विब्रियो प्रजातियों को अलग कर सकता है, कई रंगों से बेदखल। हालांकि यह इस अध्ययन का ध्यान केंद्रित वी पता लगाने के लिए नहीं था कोलरा और वी vulnificus, यह ध्यान दें कि मैजेंटा कालोनियों इन प्रजातियों द्वारा प्रदर्शित आगे यूवी के तहत प्रतिदीप्ति द्वारा भेदभाव किया जा सकता है लायक है। एक सीमा वी का पता लगाने के लिए chromogenic अगर उपयोग करने के कोलरा और वी vulnificus इन प्रजातियों के लिए अपनी स्पष्ट कम वसूली है। इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए, एक संवर्धन कदम शामिल किया जाना चाहिए। chromogenic अगर की एक अन्य संभावित सीमा TCBS की तुलना में अपने छोटे कद के शेल्फ जीवन है। इस नए माध्यम के चल रहे अनुकूलन भंडारण के दौरान पीएच बनाए रखने के लिए आवश्यक है।

आणविक तकनीक की लोकप्रियता के बावजूद, संस्कृति-निर्भर करता है तरीकों के रूप में वे अक्सर कम महंगे हैं और एक बेहतर पता लगाने सीमा अभी भी मूल्यवान हैं। ये संवर्धन तरीकों के लिए एक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके विपरीत, वे पहचान और आणविक विश्लेषण निम्नलिखित सूक्ष्मजीवों की व्यवहार्यता पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक संस्कृति के आधार दृष्टिकोण के माध्यम से बैक्टीरिया की गणना करने में, स्टैंडर्ड प्लेट गिनती मानक पद्धति के रूप में मान्यता प्राप्त है। समीकरण चरण 4.2.5 में दिखाया गया CFU / छ या अलग कमजोर पड़ने कारकों से CFUs औसत से CFU / एमएल निर्धारित करने के लिए एक अधिक सटीक तरीका है। यह ध्यान रखें कि सभी diluents और मीडिया प्रक्रियाओं भर में इस तरह के रूप में वी हलोपलिक बैक्टीरिया की व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए पर्याप्त नमक शामिल होना चाहिए महत्वपूर्ण है parahaemolyticus। ऊष्मायन तापमान और पर्यावरण बैक्टीरिया विकास के लिए इष्टतम होना चाहिए।

Chromogenic मध्यम विब्रियो प्रजाति है कि महत्वपूर्ण मानव रोगजनक हैं पता लगाने के लिए बनाया गया है। इसलिए, आगे की पढ़ाई determi करने के लिए आयोजित किया जाना चाहिएne उसकी प्रभावशीलता अन्य पर्यावरणीय विब्रियो प्रजाति है कि चिकित्सकीय प्रासंगिक नहीं हैं पता लगाने के लिए। भविष्य अनुप्रयोगों में, नई chromogenic अगर वी के लिए पर्यावरण के नमूनों का नियमित परीक्षण में शामिल किया जा सकता है parahaemolyticus। इस नमूने के प्रत्यक्ष streaking द्वारा chromogenic अगर पर किया जा सकता है प्रकल्पित वी की उपस्थिति के लिए पता लगाने के लिए parahaemolyticus। Chromogenic एगर को वी गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता parahaemolyticus dilutions के बाद। मात्रा का ठहराव भी संवर्धन शोरबा, पुष्टि करने के लिए chromogenic अगर पर streaking से पीछा का उपयोग कर एक सबसे संभावित संख्या विधि से बाहर ले जाने से अनुमान लगाया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

हम इस परियोजना पर उनकी सहायता के लिए एम Channey, ई चौधरी, और लालकृष्ण टॉमस धन्यवाद। परियोजना आपूर्ति आंशिक रूप से कैलिफोर्निया पॉलिटेक्निक द्वारा वित्त पोषित कर रहे थे स्टेट यूनिवर्सिटी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Equipment
Agar Fisher Scientific DF0140-15-4 may use other brands
Autoclave Any
BHI powder Fisher Scientific DF0418-17-7 may use other brands
Blender Any to blend oyster meat
CampyGen gas generator Hardy Diagnostics CN035A to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands
Chocolate agar plates Hardy Diagnostics E14 may use other brands
Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) Any or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014)
Culture tubes Fisher Scientific S50712 may use other brands
Eppendorf tubes Fisher Scientific S348903 may use other brands
Gel doc Any
HardyChrom Vibrio agar plates Hardy Diagnostics G319 This study evaluates this medium
Incubator Any
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-606 10 microliter-size was used in this study
NaCl Fisher Scientific BP358-212 may use other brands
Oysters Any
PBS Fisher Scientific R23701 may use other brands
Petri dish Fisher Scientific FB0875713 may use other brands
Pipette and tips Any Sterilized tips
Primers for tlh IDT DNA
Scale Any
Spreader Fisher Scientific 08-100-11 Beads may be used instead
Stomacher blender Stomacher 400 Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec.  Other homogenizer can be used.
Sterile filter bags for blenders Fisher Scientific 01-812-5
TCBS powder Hardy Diagnostics 265020 This study evaluates this medium
Thermocycler Any
TSB powder Fisher Scientific DF0370-07-5 may use other brands
UV viewing cabinet Any Emit long-wave UV light
Water bath Any  
 
 
Name Sources Catalog Number Comments
Bacterial species and strains
Aeromonas hydrophila ATCC
Candida albicans ATCC
Campylobacter jejuni ATCC
Escherichia coli ATCC
Proteus mirabilis ATCC
Pseudomonas aeruginosa ATCC
Staphylococcus aureus ATCC
Salmonella Choleraesuis ATCC
Shigella boydii ATCC
Shigella flexneri ATCC
Shigella sonnei ATCC
Vibrio alginolyticus ATCC
V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) FDA, ATCC
V. damsela FDA
V. fisheri Environment
V. fluvialis CDC
V. furnissii CDC
V. hollisae FDA
V. metschnikovii ATCC
V. mimicus FDA
V. parahaemolyticus (serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc.) ATCC, FDA, CDC, Environment
V. proteolyticus FDA
V. vulnificus FDA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yeung, P. S., Boor, K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).
  2. Yeung, P. S. M., Boor, K. J. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. Faruque, S. M. , Caister Academic Press. 153-184 (2012).
  3. Centers for Disease Control and Prevention. Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food - Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010. Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).
  4. Centers for Disease Control and Prevention. Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008. , Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591 (2008).
  5. Scallan, E., et al. Foodborne illness acquired in the United States - major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).
  6. Baross, J., Liston, J. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State. Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).
  7. Baross, J., Liston, J. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific. Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).
  8. Kueh, C. S., Chan, K. Y. Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster. J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).
  9. Food and Drug Administration. Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , Second Edition, (2012).
  10. Qadri, F., et al. Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus. J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).
  11. Food and Drug Administration. Quantitative risk assessment on the public health impact of Vibrio parahaemolyticus in raw oysters. , Available from: http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/ResearchAreas/RiskAssessmentSafetyAssessment/ucm050421.htm (2005).
  12. Food and Drug Administration. Bacteriological analytical manual online. , Available from: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070830.htm (2004).
  13. MacFaddin, J. F. Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, Williams & Wilkins. Baltimore, Md. (1985).
  14. Bottone, E. J., Robin, T. Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features. J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).
  15. Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms. Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).
  16. Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).
  17. Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).
  18. Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus. J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).
  19. Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).
  20. Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).
  21. Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish. J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).
  22. Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates. Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).
  23. Duan, J., Su, Y. -C. Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).
  24. Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus. Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).
  25. Canizalez-Roman, A., Flores-Villaseñor, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Leòn-Sicairos, N. Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples. Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).
  26. Kriem, M. R., et al. Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains. Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).
  27. Food Drug Administration. Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests. http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).
  28. Burd, E. M. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).
  29. World Organisation for Animal Health. Principles and methods of validation of diagnostic assays for infectious diseases. , Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/1.01.05_VALIDATION.pdf (2013).

Tags

संक्रमण अंक 117, Chromogenic मीडिया परख विकास TCBS चयनात्मक और अंतर मीडिया का पता लगाने अलगाव संवेदनशीलता विशिष्टता स्टैंडर्ड प्लेट गिनती
की जांच के लिए एक अधिक संवेदनशील और विशिष्ट chromogenic अगर मध्यम का विकास<em&gt; विब्रियो parahaemolyticus</em&gt; और अन्य<em&gt; विब्रियो</em&gt; प्रजाति
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yeung, M., Thorsen, T. Development… More

Yeung, M., Thorsen, T. Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species. J. Vis. Exp. (117), e54493, doi:10.3791/54493 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter