Abstract
Livsmedelsburna infektioner i USA orsakas av Vibrio arter har visat en uppåtgående trend. I släktet Vibrio, V. parahaemolyticus är ansvarig för majoriteten av Vibrio -associated infektioner. Således, exakt differentiering mellan Vibrio spp. och detektion av V. parahaemolyticus är mycket viktigt att garantera säkerheten för vår livsmedelsförsörjning. Även molekylära tekniker blir allt vanligare, är kultur beroende metoder fortfarande rutinmässigt gjort och de anses standardmetoder under vissa omständigheter. Därför genomfördes en ny kromogent agarmedium testas med målet att ge en bättre metod för isolering och differentiering av kliniskt relevant Vibrio spp. Protokollet jämförde känslighet, specificitet och detektionsgränsen för detektion av V. parahaemolyticus mellan den nya kromogena mediet och en konventionellt medium. Various V. parahaemolyticus stammar (n = 22) återpresenterar olika serotyper och källa till ursprung användes. De tidigare identifierats av Food and Drug Administration (FDA) och Centers for Disease Control and Prevention (CDC), och ytterligare verifieras i vårt laboratorium genom tlh -PCR. I åtminstone fyra separata studier har dessa stammar ympades på kromogena agar och tiosulfat-citrat-gallsalter-sackaros (TCBS) agar, vilket är den rekommenderade mediet för odling denna art, följt av inkubation vid 35-37 ° C under 24 -96 h. Tre V. parahaemolyticus stammar (13,6%) inte växer optimalt på TCBS ändå uppvisade gröna kolonier om det fanns tillväxt. Två stammar (9,1%) inte gav de förväntade cyan kolonier på kromogena agar. Icke- V. parahaemolyticus stammar (n = 32) testades också för att bestämma specificiteten av det kromogena agar. Bland dessa stammar, gjorde 31 inte växa eller uppvisade andra kolonimorfologier. Medelförekomsten av V. parahaemolyticus på chromogenic-agar var ~ 96,4% i förhållande till tryptisk sojaagar kompletterat med 2% NaCl. Sammanfattningsvis är den nya kromogena agar ett effektivt medium för att detektera V. parahaemolyticus och att skilja den från andra vibrios.
Introduction
Som en medlem av Vibrio släktet, V. parahaemolyticus är en gramnegativ, icke-sporbildande, krökt, stavformad bakterie. Den uppvisar hög rörlighet i både flytande och halvfasta miljöer. Mest V. parahaemolyticus stammar är icke-patogen för människor, men de patogena subtyper har orsakat epidemier och pandemier, därav denna art anses vara en viktig livsmedelsburna patogener i många länder 1,2. Förekomsten av Vibrio infektion i USA har visat en uppåtgående trend sedan 2000 3. Bland Vibrio spp., V. parahaemolyticus är de mest frekvent rapporterade arter orsakar sjukdomar i USA 4,5. Andra kliniskt relevanta arter är V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, etc. En liten andel av de sjukdomar som orsakas av flera arter samtidigt.
V. parahaemolyticus är en naturlig inhabitant av havsvatten och därför stor spridning i marina vatten i hela världen, inklusive mynningar. Arten upptäcktes 1950 efter ett utbrott av matförgiftning i Japan. I USA, var arten först isolerades i havsvatten, sediment och skaldjur i Puget Sound regionen 6,7. Filtrerare i marina miljöer, såsom musslor, kan hysa V. parahaemolyticus som en del av deras naturliga flora 8. Som sådan, V. parahaemolyticus infektioner hos människa är ofta kopplade till konsumtion av förorenad fisk och skaldjur, särskilt råa eller svampiga skaldjur. En mindre vanlig upptagsväg uppstår när öppna sår utsätts för havsvatten, vilket leder till hudinfektion. Mest V. parahaemolyticus stammar inte orsakar sjukdom hos människor, men vissa subtyper hyser virulensfaktorer såsom värme direkt hemolysin (TDH) är patogena. De vanligaste symptomen på livsmedelsburna V. parahaemolyticus infektion ärdiarré och magsmärtor, följt av illamående, kräkningar och feber. Huvudvärk och frossa är också rapporterats. Median Inkubationstiden är 15 h, men kan vara upp till 96 timmar efter intag av tillräcklig mängd av patogena stammar 9. Sjukdomen varar från två till tre dagar. De gastroenterit symptom orsakade av V. parahaemolyticus är till stor del självbegränsande och därför särskild behandling är inte nödvändigt. Lindriga fall av gastroenterit kan behandlas effektivt med vätskeersättning. Mer allvarliga sjukdomar kan behandlas med antibiotika, såsom tetracyklin eller ciprofloxacin 10. Dödligheten är ca 2% för gastroenterit fall, men kan vara så hög som 29% för dem som utvecklar blodomloppet infektion eller blodförgiftning. Varje person som konsumerar skaldjur eller har öppet sår utsätts för havsvatten är i riskzonen för V. parahaemolyticus infektion. Ju mer allvarlig form av sjukdomar, livshotande blodförgiftning, är vanligare i en subpopulation med underliggande medicinska conditions 11, som innefattar alkoholism, leversjukdomar, diabetes, njursjukdom, malignitet och andra tillstånd som leder till ett försvagat immunsvar. Noterbart är denna grupp av individer också en högre risk för att drabbas av allvarliga sjukdomar som orsakas av V. vulnificus, som kan hittas i naturliga livsmiljöer som liknar V. parahaemolyticus.
V. parahaemolyticus rutinmässigt isoleras med hjälp av tiosulfat-citrat-gallsalter-sackaros (TCBS) agar som ett selektivt och differentiellt medium. Anrikning i alkaliskt peptonvatten kan föregå isolering på TCBS agar. Presumtiva kolonier på TCBS sedan ytterligare testas i en rad biokemiska tester och / eller molekylära analyser riktade mot närvaron av artspecifika gener. PCR-baserade metoder används ofta för att bekräfta identiteten på V. parahaemolyticus genom att förstärka den termolabila hemolysin-genen, tlh 12.
Oberoende av lmoice av bekräftelsemetoder, är det viktigt att ha ett effektivt medium för att isolera och särskilja V. parahaemolyticus från andra marina vibrioner i första hand. TCBS har rutinmässigt använts för att skilja arterna inom Vibrio släktet enligt deras förmåga att jäsa sackaros 12. Positiv jäsningsreaktion åtföljs av en färgförändring av pH-indikator Bromtymolblått. V. parahaemolyticus kolonier är ganska utmärkande på TCBS, uppvisar blå till grön färg. Dock kan detta medium inte lätt skilja V. alginolyticus och V. cholerae. Sackaros-jäsa Proteus arter kan producera gula kolonier som liknar V. cholerae eller V. alginolyticus 13. Vid första isolering på TCBS, V. parahaemolyticus kan också feltolkas som Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides, och Pseudomonas spp 14. Stammar med fördröjd sackaros fermsenta kan förväxlas med andra sackaros nonfermenting Vibrio 13, som omfattar V. parahaemolyticus. TCBS befanns vara inte känslig mot Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens, bland andra. Flera andra arter ger grönt till grått kolonier som potentiellt förväxlas med V. parahaemolyticus eller V. vulnificus 15. Som ett resultat, är det önskvärt att utveckla alternativa odlingsmedia med bättre känslighet och specificitet mot detektering och isolering av V. parahaemolyticus och andra närbesläktade arter.
Flera medier alternativ har nyligen utvecklats. Förutom införandet av selektiva medel, de flesta införliva kromogena substrat för att skilja arterna baserat på deras differentiella enzymatiska aktiviteter. Till exempel, har indoxyl-β-glukosid och indoxyl-β-galaktosid använts som de kromogena substrat för att differentiera V. parahaemolyticus kolonier (som verkar blågrönt) från de V. cholerae (lila) på grund av deras differentiella förmåga att producera β-glukosidas och β-galaktosidas 16. Olika formuleringar av kromogena agar som utvecklats av flera grupper har utvärderats och rapporterades att utföra jämförbart med eller bättre än TCBS 17,18,19. En fördel med användning av ett kromogent medium är att färgningen av det omgivande mediet är minimal vilket underlättar isoleringen av speciella kolonier. I denna studie har vi utvärderat förmågan hos ett nyligen formulerade kromogent medium för att detektera och isolera V. cholerae, V. parahaemolyticus och V. vulnificus; med särskilt fokus på dess förmåga att särskilja V. parahaemolyticus från andra arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Media och Odling av mikrobstammar
OBS: Använd aseptisk teknik i alla experiment. Använd sterila material. Sterilisera alla behållare, verktyg och reagens före användning. Autoklav alla avfall före omhändertagande eftersom de anses biologiskt farliga. Autoklav temperatur och tid kombination är ≥121 ° C x ≥15 min för alla följande procedurer.
- För att göra ~ ett-L tryptisk sojaagar (TSA), först lägga en L avjoniserat vatten i en 2-L Erlenmeyer-kolv innehållande en magnetisk omrörarstav. Använda en kolv som är åtminstone två gånger större än den slutliga volymen. Tillsätt 30 g tryptisk sojabuljong pulver och 20 g agar granuler in i kolven.
OBS: Använd 2% agar i stället för 1,5% för att begränsa myllrande vissa Vibrio spp.- Blanda noggrant genom att vrida på omröraren. Under omrörning, slå på värmen för att koka blandningen. Ta kolven ur värmaren så snart blandningen börjar koka. Löst täcka the kolv med en aluminiumfolie. Tejpa folie för att säkra den till kolven innan autoklaven.
- För att göra tryptisk sojabuljong (TSB), utelämnar agar från receptet i steg 1,1.
OBS: Får använda flaskor i stället för Erlenmeyerkolv. - Att göra tryptisk sojaagar kompletterat med 2% natriumklorid eller NaCl (TSA), tillsätt 20 g NaCl i blandningen före omröring och upphettning. Att göra tryptisk soja buljong kompletterad med 2% NaCl (TSBS), utelämna agar, tillsätt 20 g NaCl i blandningen före omröring och upphettning.
- För att göra hjärna-hjärta-infusion (BHI) agar, suspendera 37 g BHI-pulver och 15 g agar granulat i 1 liter renat vatten. Värme med frekvent omrörning för att lösa upp pulvret. Autoklav. Utelämna ägarn för att göra BHI-buljong.
- För att göra TCBS agar, suspendera 89 g av den TCBS pulver i ett L av renat vatten. Värme med täta agitation och koka i en minut för fullständig upplösning av pulvret. Autoklavera inte.
- För alla agar media, kyla varma agar till 45-50 ° C i ett vattenbad. Ordna tomma petriskålar i högar av fem till sex plattor. Från botten av stapeln, häll smält agar i varje Petri platta för att nå ungefär halvfull. Stäng platta lock Petri efter gjutning. Tillåta agar stelna genom att låta plattorna stå vid rumstemperatur.
- Använd agarplattorna nästa dag eller efter 12 timmar. Lagra oanvända plattor i kylskåp i upp till två veckor. Före användning, ta bort plattorna från kylskåpet och jämvikt dem vid rumstemperatur under åtminstone 15 minuter.
OBS: En liter agar gör ~ 45 agarplattor. Låt agarplattor torka tillräckligt på dagen för förberedelse och jämvikt dem till rumstemperatur efter kylförvaring att effektivt minska spridningen av kolonierna.
- Använd agarplattorna nästa dag eller efter 12 timmar. Lagra oanvända plattor i kylskåp i upp till två veckor. Före användning, ta bort plattorna från kylskåpet och jämvikt dem vid rumstemperatur under åtminstone 15 minuter.
- Skaffa choklad och kromogen agarplattor och jämvikt dem vid rumstemperatur före varje experiment.
- Subkultur alla 54 mikrobstammar som visas i tabell 1 med några days.
- Använd en steril ympning slinga för att överföra kulturer från en frusen lager eller en tidigare sats till icke-selektiva media såsom BHI, TSB / TSA eller chokladagar. Väx halofiliskt Vibrio spp. på TSBS / TSA.
- Att kontrollera renheten av kulturen, strimma alla stammar i ett mönster som skulle möjliggöra observation av isolerade kolonier. Använd till exempel en trefas strimmor mönster att späda en stor mängd bakterier till mindre mängd, så småningom ger isolerade kolonier.
- Inkubera plattorna upp och ned vid 35-37 ° C i upp till 48 timmar. För Campylobacter spp., Inkubera rör eller plattor i en sluten-lock burk innehållande en gas påse för att producera en mikroaerofil miljö. Observera kolonimorfologi efter inkubation. Rena kulturer bör ge kolonier som uppvisar liknande kolonimorfologi.
OBS: Inkubera alla plattorna upp och ned för att förhindra kondenserade vattendroppar som bildas på undersidan av locket från att falla på colonies.
2. artbestämning av PCR
- Genomför tlh -PCR för att bekräfta identiteten hos V. parahaemolyticus stammar. Använd primers TLH -F (5 'AAA GCG GAT TAT GCA GAA GCA CTG 3') och tlh -R (5 'GCT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC 3') för att amplifiera ett 450-bp fragment av den termolabila hemolysin-gen 20 .
- Använd en steril ympning slinga för att överföra några isolerade kolonier av varje V. parahaemolyticus stam från TSA till 5 ml TSBS. Inkubera vid 35-37 ° C under 16-24 h.
- Centrifugera kulturer vid 14.000 xg i 1 min. Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Koka suspensionen under 3 min för att i utbyte ge cellysat.
OBS: V. parahaemolyticus är lätt att lyseras. Därför lyseringsreagenset inte behövs. Det är även möjligt att använda en bit av koloni direkt som mall. - Utför PCR i en 25-il reaktion volym. Bereda en reaktionsblandning som innehåller en slutlig koncentration av 1 x PCR-buffert, 1,5 mM MgCl2, 100 | iM av varje dNTP, 1 ^ M av varje primer, 1 U Taq polymeras och 1 | il cellysat. Efter förinkubation vid 94 ° C under 5 min, springa 35 amplifieringscykler med 94 ° C under 30 sek, 58 ° C under 30 sekunder, och 72 ° C under 60 sek 21.
- Belastnings alikvoter av 5-il amplikon i 1,5% agarosgeler. Slå på strömmen för att starta elektrofores. Visualisera närvaron eller frånvaron av amplikoner under UV-belysning efter etidiumbromidfärgning.
3. Tillväxt på selektiv och differentierad Media
- Två till fyra dagar innan experimentet strimma alla mikrobiella stammar som visas i tabell 1 på icke-selektivt medium (TSA, BHI eller chokladagar) för koloniisolering. Inkubera plattorna vid 35 till 37 ° C under 48 h. Kontrollera renheten av kulturerna genom att observera kolonimorfologi efter inkubation. Rena kulturer bör ge kolonier som uppvisar liknande kolonimorfologi.
- Överför några isolerade kolonier från steg 3,1 till 5 ml buljong. Inkubera rören vid 35-37 ° C under 16-24 h.
OBS: Använd unga kolonier, som är mindre än fyra dagar gammal, för att förbereda natten kulturer i alla experiment. - Strimma en ögla över natten kulturer på selektiv och differentierad media (TCBS och kromogen agar) för koloniisolering. Inkubera plattorna vid 35 till 37 ° C i upp till 96 timmar.
- Spela den totala tillväxten av alla stammar genom att undersöka både odlingstätheten på plattan och storleken på isolerade kolonier. Spela in färgen på kolonier under omgivnings- och / eller UV-ljus. Observera andra egenskaper hos isolerad koloni som höjden, marginal och form.
4. Återvinning analys
- Välj en representativ delmängd av V. parahaemolyticus stammar (n = 14) som omfattar olika serotyper och ursprung av isolering
- Genomföra en standardplatträkningsmetoden i övernattskulturer, såsom beskrivs nedan.
- Vortex för att blanda de nattgamla kulturer också. Gör en 10-faldig eller 10 -1 utspädning genom att överföra 100 | il av övernattskultur i ett rör innehållande 900 | j, l PBS. Vortex att blanda väl.
- Använd en ny pipettspets för att överföra 100 l från 10 -1 utspädning rör till ett annat rör innehållande 900 pl PBS. Vortex att blanda väl. Detta utgör 10 -2 utspädning. Upprepa processen sekventiellt för att erhålla 10 -7 utspädning.
- Med hjälp av 10 -4 till 10 -7 spädningsrör, plattan 100 pl vardera på kromogena, TCBS och TSA agarplattor.
OBS: Utspädningsfaktorn (DF) på plattan blir 10 -5 till 10 -8, respektive. - Sprid portioner jämnt på than agarytan.
OBS: Det är bra att använda samma spridare per belastning på samma medium, så länge som den mest utspädda portionen sprids först (dvs från 10 -8 till 10 -5). Använd inte samma spridare för olika medier. - Inkubera plattorna vid 35 till 37 ° C i upp till 96 timmar. Räkna kolonier på plattorna. Ignorera skyltar med kolonier som är för många för att räkna (TNTC) eller mindre än 25. Beräkna CFU / ml i enlighet med följande:
Var
N = antalet celler i den outspädda röret, uttryckt som CFU / ml eller CFU / g
C = det totala antalet räknade kolonier på plattor som bär 25-300 kolonier
n 1 = antalet skylt (ar), där räknade kolonier från den nedre df
n 2 = antalet skylt (ar), där räknade kolonier från den efterföljande 10-faldig utspädning
df = den nedre utspädningsfaktorn (dvs mer koncentrerad utspädning)
- Jämför CFU / ml mellan olika medier. Använd CFU / ml på TSA som 100%, beräkna återvinnings% av V. parahaemolyticus odlas på kromogena och TCBS agar.
- Genomföra en standardplatträkningsmetoden i övernattskulturer, såsom beskrivs nedan.
5. Konkurrens analys
- Välj en delmängd av stammar som uppvisar olika kolonimorfologier på kromogena och TCBS agar.
OBS: På så sätt kommer det att vara möjligt att räkna kolonier härstammar från V. endast parahaemolyticus, trots närvaron av andra arter i ympen.- Välj ett V. parahaemolyticus stam som ger de förväntade turkos och cyan kolonier på TCBS och det kromogena agar, respektive.
- Välj en icke V. parahaemolyticus och en icke Vibrio arter som inte växer på någon av dessa medier, eller uppvisar olika kolonifärg.
OBS: Till exempel, V. metschnikovii växer mycket svagt on TCBS och växte inte på det kromogena agar. Shigella sonnei växer inte på TCBS men ger magenta kolonier på kromogena agar.
- Efter urval av stammarna ovan förbereda natten buljongodlingar med hjälp av isolerade kolonier odlade på icke-selektiva medier.
- Över natten kulturer av V. parahaemolyticus och V. metschnikovii genom att överföra några isolerade kolonier från TSA till 5 ml TSBS. Inkubera vid 35-37 ° C under 16-24 h.
- Över natten kulturer av Shigella sonnei genom att överföra några isolerade kolonier från BHI agar till 5 ml BHI-buljong. Inkubera vid 35-37 ° C under 16-24 h.
- För varje stam, utför en spädningsserie som liknar steg 4.2.1 och 4.2.2. Plate lämpliga utspädningar på TSA eller BHI att bestämma CFU / ml av natten kultur, med ekvationen som visas i steg 4.2.5.
OBS: Typiskt 100 pl från 10 -5 till 10 -7 utspädningrör fungerar för de flesta kulturer. Använd CFU / ml-värden för att backa beräkna den exakta mängden av celler som används i nästa steg. De beräknade CFU / ml-värden som erhölls efter inkubering, även om de följande stegen utförs på samma datum som i steg 5,3. - Med hjälp av övernattskulturer och spädningsrör i steg 5,2 och 5,3, blanda olika mängder av ett V. parahaemolyticus stam och en icke V. parahaemolyticus arter. Till exempel mixa 500 pl av 10 -5 utspädnings rör av V. parahaemolyticus med 500 mikroliter av övernattskulturer av V. metschnikovii.
OBS: Denna blandning simulerar hög mikroflora bakgrund. För att simulera en låg mikroflora bakgrund, blanda 500 pl vardera av 10 -5 utspädning rör från båda arterna. - Sprid 100 pl av blandningen vardera på de kromogena, TCBS och TSA-agarplattor.
- Efter inkubation vid 35 till 37 ° C i upp till 96 h, räkna kolonier av V. parahaemolyticus och icke V. parahaemolyticus arter baserat på skillnaden i tillväxt och kolonimorfologi på kromogena och TCBS agar.
OBS: Till exempel, om icke V. parahaemolyticus arter inte växer på det kromogena och TCBS agar, alla kolonier kommer att vara av V. parahaemolyticus. Om icke V. parahaemolyticus arter växer på båda medierna, kommer bara de turkosa kolonier på TCBS och cyan kolonier på kromogena agar vara V. parahaemolyticus. Den icke V. parahaemolyticus arter kan eller inte kan uppvisa liknande koloni morfologi V. parahaemolyticus på TSA.- Om icke V. parahaemolyticus arter växer på samma sätt som V. parahaemolyticus på denna icke-selektivt medium, dela mikroorganismer med två för att få siffror för V. parahaemolyticus enbart. Jämför det faktiska antalet mikroorganismer med den förväntade räkningen härrör från steg 5,3.
6. Effjekt av Oyster homogenat
- Väg ≥50 g ostron kött från ≥12 blötdjur inklusive kött och sprit.
- Lägg lika stor mängd PBS till ostron kött och sprit. Blanda blandningen vid hög hastighet under 90 sek. Detta utgör 2 -1 utspädd ostron homogenatet.
- Tillsätt 100 g av 2 -1 utspätt ostron homogenatet till 400 g av PBS. Använda en skala för att mäta vikt, ej volym. Blanda blandningen vid hög hastighet under 1 min. Autoklavera ostron homogenat.
OBS: Detta kommer att vara ostron homogenatet används för spiking.
- Upprepa analysen Recovery (steg 4) i närvaro av ostron homogenatet.
- Efter 500 g ostron homogenatet svalnat, tillsätt 100 pl V. parahaemolyticus övernattskulturer odlas i TSBS till den. Bestämma den faktiska mängden V. parahaemolyticus celler i ympen genom att utföra standardplatträkning procedurerna beskrivna i Steg 4.2.
- Repäta konkurrensanalysen (Steg 5) i närvaro av ostronhomogenat.
- Efter 500 g ostron homogenatet svalnat, tillsätt 100 pl vardera av övernattskulturer av V. parahaemolyticus och icke V. parahaemolyticus till den. Bestämma den faktiska mängden av bakteriell celler i inokulatet genom att utföra standardplatträkning förfaranden beskrivs i steg 4,2
- Blanda bakteriecellerna med ostron homogenatet väl med hjälp av en homogenisator.
OBS: Efter blandning ostron homogenatet innehåller avsiktligt tillsatta celler kallas spetsade ostron homogenatet. - Göra spädningar av det spikade ostron homogenatet för att erhålla 10 -1 till 10 -3 spädningsrör enligt procedurerna beskrivna i Steg 4.2.2. Sprid 100 pl av varje spädning på det kromogena, TCBS och TSA agar. Inkubera plattorna vid 35 till 37 ° C i upp till 96 timmar.
- Jämför den faktiska antalet mikroorganismer på kromogena och TCBS agar med exväntad mikroorganismer härledas från steg 6.2.1 och 6.3.1.
OBS: Om exempelvis ett rör av V. parahaemolyticus natten kultur innehåller 10 8 CFU / ml, ett inokulum av 100 | j, l innebär att 10 7-celler tillsätts till 500-g ostronhomogenat, vilket gav 5 x 10 4 celler / g. Efter utspädning och plätering, varvid plattan har df = 10 -2 bör ge 500 kolonier; medan det som har df = 10 -3 bör ge 50 kolonier. Dessa är de förväntade kolonier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie var 54 mikrobstammar monteras, som innehöll 22 stammar i V. parahaemolyticus arter, 19 andra Vibrio-arter, och 13 icke-Vibrio-arter (tabell 1). Mest V. parahaemolyticus stammar antingen mottagits från FDA, CDC eller andra statliga hälsodepartement. De representerar olika serotyper och isoleringskällor. Dessa stammar har tidigare identifierats av tillsynsmyndigheterna. Vi bekräftade identitet dessa V. vidare parahaemolyticus genom att utföra en tlh -PCR 21,22.
| Arter | Antal testade stammar | Tillväxt och färg kolonier | |
| TCBS | Chromogenic mediet | ||
| Aeromonas hydrophila | 2 | ingen tillväxt | En stam nr tillväxt; |
| En stam magentafärg | |||
| candida albicans | 1 | Svag tillväxt, gul | ingen tillväxt |
| Campylobacter jejuni | 1 | ingen tillväxt | ingen tillväxt |
| Escherichia coli | 1 | ingen tillväxt | Svag tillväxt, magenta |
| Proteus mirabilis | 1 | ingen tillväxt | ingen tillväxt |
| Pseudomonas aeruginosa | 2 | Turkos | Gul |
| Staphylococcus aureus | 1 | Svag tillväxt, gul | ingen tillväxt |
| salmonella choleraesuär | 1 | ingen tillväxt | ingen tillväxt |
| Shigella boydii | 1 | ingen tillväxt | ingen tillväxt |
| Shigella flexneri | 1 | ingen tillväxt | ingen tillväxt |
| Shigella sonnei | 1 | ingen tillväxt | Svag tillväxt, magenta |
| Vibrio alginolyticus | 3 | Gul eller turkos | Gul |
| V. cholerae | 4 | Gul eller turkos | Magenta |
| V. damsela | 1 | Turkos | Kobolt |
| V. fisheri | 1 | Svag tillväxt, gul | ingen tillväxt |
| V. fluvialis | 1 | Turkos | Kobolt |
| V.furnissii | 1 | Gul | Gul |
| V. hollisae | 1 | Turkos | Gul |
| V. metschnikovii | 1 | ingen tillväxt | ingen tillväxt |
| V. mimicus | 1 | Turkos | Magenta |
| V. parahaemolyticus | 22 | De flesta stammar turkos | De flesta stammar cyan; några tydliga |
| V. proteolyticus | 1 | Turkos | Kobolt |
| V. vulnificus | 4 | Turkos eller klar | Magenta |
Tabell 1. Microbial arter som används i denna studie och deras tillväxtegenskaper på selektiva och differentiella media. Färgsamtal var based på ett färghjul. Cyan liknar kricka; magenta liknar rosa lavendel, är turkos liknar grönt, gult omfattar oliv och brunt.
Fyra separata försök genomfördes för att bestämma tillväxten och kolonimorfologi av dessa stammar på selektiv och differentierad medier - TCBS och det kromogena agar. TCBS är den konventionellt medium som används för isolering av vissa Vibrio arter, inklusive V. cholerae och V. parahaemolyticus 12. Färgvariation kolonier odlas på TCBS var gul, turkos (grön) eller klar (Figur 1).
Figur 1. Kolonimorfologi av Vibrio spp. på TCBS agar. V. parahaemolyticus (turkos), V. cholerae (gul), och am ixed inokulering av de två arterna (a). Kolonier av V. parahaemolyticus visas turkos, med en cirkulär, hela, och konvexa morfologi (b). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Förmågan hos en ny kromogent medium för att selektera för kliniskt relevanta Vibrio arter från mat och miljöprover testades. Dessutom var förmågan hos detta medium för att samtidigt skilja dessa arter från varandra utvärderas. Kolonifärg observeras på det kromogena agar var kobolt, cyan, magenta, gul eller klar (figur 2). Såsom visas i tabell 1, både TCBS och det kromogena agar uppvisade vissa grader av selektivitet gentemot icke-Vibrio mikroorganismer.
1 ">
Figur 2. Kolonimorfologi av Vibrio spp. på den nyutvecklade kromogena agar. V. parahaemolyticus (cyan), V. cholerae (magenta), och en blandad ympning av de två arterna (a). Kolonier av V. parahaemolyticus verkar cyan, med en cirkulär, hela, och konvexa morfologi (b). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Efter Standard Plate Count metoden på natten kulturer, kolonier av V. parahaemolyticus observerades på kromogena agarplattor som fick den högsta utspädningsfaktorn (dvs df = 10 -8). Dessa resultat var jämförbara med dem på ett icke-selektivt medium (TSA). Detta tyder på att detektionsgränsen av det kromogena mediet liknar icke-selektiva medier, vilket är ungefär 10 celler eller lägre i frånvaro av livsmedelsmatrisen. Kapaciteten för andra Vibrio arter såsom V. detektering alginolyticus, V. fluvialis och V. damsel var också ganska bra jämfört med den icke-selektivt medium. Men vissa stammar av V. cholerae, V. vulnificus och V. mimicus gav 10- till 100-faldigt mindre CFU på det kromogena agar. De selektiva medel som används i kromogena eller andra selektiva medier hämmar oundvikligen vissa celler. Skadade celler, till exempel, inte kunde återhämta sig i selektivt media. Ändå är något sämre detekteringsförmåga en icke-fråga i de flesta rutinförfaranden som använder ett anrikningssteg. Liten mängd mikroorganismer i livsmedel eller miljöprov skulle föröka till en hög nivå i anrikningsbuljong, överträffar detektionsgränsen. Anrikning i alkaliskt peptonvatten är often görs för att fastställa förekomsten av Vibrio arter i miljöprover 12.
I närvaro av ostron homogenatet, det kromogena agar fortsatte att visa en hög grad av återvinning. Med andra ord, en stor andel (> 70%) av V. parahaemolyticus celler kunde växa på det kromogena agar, opåverkad av närvaron av ostron matrisen (figur 3a). Tillväxten och återvinning av V. parahaemolyticus celler påverkas inte heller av närvaron av en annan Vibrio arter (Figur 3b). Detta är en viktig egenskap, eftersom miljöprover är skyldiga att innehålla olika Vibrio arter, som är på höga siffror, särskilt efter en anrikningsförfarandet.
Figur 3. Procent återvinning av ett V. parahaemolyticus stam i ostron homogenatet med och utan en bakteriell konkurrent. Återhämtning (medelvärde ± SD) beräknades enligt den observerade vs den förväntade CFU räkna med agarplattorna. Förväntad CFU räkna beräknades baserat på den bakteriehalten i ympen. Hög återvinning av ett V. parahaemolyticus stammen observerades på alla medier utan konkurrens (a). Liknande nivå av återhämtning observerades när höga nivåer av V. metschnikovii celler var närvarande (b). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att ytterligare jämföra det kromogena och TCBS agar var sensitivitet och specificitet beräknades. Tabell 2 visar förmågan hos dessa medier att Accurat identifiera V. parahaemolyticus. Känslighet är relaterad till andelen sant positivt, vilket innebär att V. parahaemolyticus stammar gav den förväntade kolonimorfologi på mediet. Specificitet är relaterad till procentandelen sanna negativa, vilket innebär icke V. parahaemolyticus stammar bör uppvisa dålig eller ingen tillväxt, eller en annan koloni morfologi än V. parahaemolyticus. Känsligheten och specificiteten för TCBS att identifiera V. parahaemolyticus var 86,4% och 71,8%, respektive. I jämförelse, känsligheten och specificiteten av det kromogena mediet var 90,9% och 96,9%, respektive.
| en) | ||
| TCBS agar | V. parahaemolyticus | Icke-V. parahaemolyticus |
| God tillväxt och turkos colonies | 19 | 9 |
| Dålig tillväxt eller icke-turkos kolonier | 3 | 23 |
| b) | ||
| kromogent agar | V. parahaemolyticus | Icke-V. parahaemolyticus |
| God tillväxt och cyan kolonier | 20 | 1 |
| Dålig tillväxt eller icke-cyan kolonier | 2 | 31 |
Tabell 2. Känslighet och specificitet TCBS (a) och kromogen (b) agar vid detektion av V. parahaemolyticus. Identiteterna av V. parahaemolyticus tidigare bestäms av biokemiska tester och tlh- PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie fokuserar på odlingsmedia utveckling och utvärdering. Konventionellt är TCBS selektivt och differentiellt medium används för isolering och detektion av V. parahaemolyticus, V. cholerae och V. vulnificus 12. Emellertid har begränsningar rapporterats för detta medium, såsom oförmågan att differentiera V. cholerae från andra Vibrio arter. Sackaros och pH-indikator är de differentierings agenter TCBS. Således, syraproduktionen av sackaros fermentorn orsakar färgförändring hos mediet. Färgning av mediet är en nackdel med TCBS eftersom det kan skymma observation av kolonimorfologi. Den nyutvecklade kromogena mediet utnyttjar högt pH och salthalt för att undertrycka tillväxten av icke Vibrio arter som finns i många marina prover. Den nya kromogena mediet har ett slutligt pH av 8,6 ± 0,2. Per liter avjoniserat vatten, består den av 10 g pepton, 10 g havssalt blandning, 10 g oxgalla, 10 g natriumtiosulfat, 5 g jästextrakt, 5 g natriumcitrat, 2,2 g natriumkarbonat, 2 g laktos, 0,5 g natrium-pyruvat, 0,3 g av en kromogen blandning och 15 g agar. Det kromogena blandningen tillåter differentiering mellan Vibrio spp. enligt deras differential förmåga att producera vissa enzymer. Stället för att förändra färgen på TCBS agarmedium, olikt Vibrio spp. skulle uppvisa olika kolonifärg på den nya kromogena mediet. I jämförelse, innehåller ett kommersiellt tillgängligt kromogent mediet 15 g agar, 8 g pepton och jästextrakt, 51,4 g av salter, 0,3 g av en kromogen blandning och ett slutligt pH av 9,0 ± 0,2.
Robust av en analys utvärdering beror på provstorleken. Eftersom denna studie betonar på effektiviteten i den nya kromogena mediet för att isolera och upptäcka V. parahaemolyticus, är det viktigt att samla många skiftande V. parahaemolyticus stammar. Tidigare studier som jämför TCBS ochnya odlingsmedier deltar ofta miljö- eller livsmedelsprover innehållande okända typer och mängd mikroorganismer 23,24,25,26. Flera kolonier per prov isolerades men den klonala naturen av isolaten var ofta obestämd. Helst bör olika stammar testas i analysutveckling annars analysens noggrannhet skulle blåsas upp. Stam identitet kan fastställas med konventionella subtyp metoder såsom pulsad fält gelelektrofores (PFGE) eller multi-locus sekvensering. V. parahaemolyticus stammar i denna studie tidigare präglas av ribotypning och PFGE 19.
Under analysutveckling, känslighet, specificitet och detektionsgräns är bland de viktigaste faktorerna som ska undersökas. Känslighet, även känd som riktigheten eller diagnostisk känslighet, är den positiva procentuella överensstämmelsen mellan referens- och provningsmetoder. Specificitet, även känd som precision eller diagnostisk specificitet, är den negativa procent per Greement mellan referens- och provningsmetoder. I denna studie använde vi PCR-baserad metod som referensmetod eftersom resultaten verifierades mellan olika grupper. TCBS och kromogena medier var testmetoderna. För att bestämma känsligheten, är resultatet av V. parahaemolyticus stammar användes, dvs känslighet = 100% x Sant positiva / (True positiva + falskt negativ). Å andra sidan, är ett resultat av icke V. parahaemolyticus stammar användes för att bestämma specificitet; och därmed Specificitet = 100% x Sann Negativ / (True Negativ + falskt positiv). För att ge mer tillförlitliga specificitet resultat, icke V. parahaemolyticus stammar bör isoleras från en miljö där provtagning kommer att genomföras. Våra sensitivitet och specificitet Beräkningarna är baserade på dokument skrivna av regeringen 27, den akademiska 28 och vetenskapliga organisation 29 på ett ämne relaterat till metodutveckling och validering.
nt "> Baserat på våra resultat, det kromogena mediet visade bättre prestanda än TCBS vid identifiering av V. parahaemolyticus. Den totala procentuella överensstämmelsen mellan referensmetod och kromogent medium är 94,4% jämfört med 77,8% mellan referensmetod och TCBS. känsligheten och specificiteten hos det kromogena mediet är 90,9% och 96,9% respektive, som är större än de TCBS (86,4% och 71,9%, respektive). Tidigare studier som utvärderar andra kromogena medier för detektion av V. parahaemolyticus funnit att känslighet varierade 85-88%, medan specifika varierade från 94 till 95% 23,24,25. Men dessa studier inte använda samma beräkningsmetod som vår studie. Vidare ibland använde de en annan referensmetod eller de kombinerade resultat från både biokemiska analyser och kromogent mediet som en testmetod. som ett resultat, är det svårt att direkt jämföra våra resultat med dessa tidigare studier.V. parahaemolyticus, kunde det kromogena agar användes i denna studie också skilja fler Vibrio arter än TCBS på grund av införandet av en kromogen blandning i mediet formel, vilket gav flera färger. Även om det var inte i fokus för denna studie för att upptäcka V. cholerae och V. vulnificus, är det värt att notera att de magenta kolonier som uppvisas av dessa arter kan ytterligare differentieras genom fluorescens under UV. En begränsning att använda den kromogena agar för påvisande av V. cholerae och V. vulnificus är dess uppenbara låg återhämtning för dessa arter. För att kringgå detta problem måste en anrikningssteg ingå. En annan möjlig begränsning av det kromogena agar är dess kortare hållbarhetstid än TCBS. Pågående optimering av detta nya medium krävs för att upprätthålla pH-värdet under lagring.
Trots populariteten av molekylära tekniker, Kultur beroende metoder är fortfarande värdefulla eftersom de ofta är mindre kostsamma och har en bättre detektionsgränsen. Dessa odlingsmetoder kan användas som ett verktyg för screening. Omvänt kan de användas för att bekräfta identiteten och livskraften av mikroorganismer följande molekyl analyser. Att räkna bakterier via en kultur beroende metod, är Standard Plate Count erkänd som standardmetod. Ekvationen visas i steg 4.2.5 är ett mer exakt sätt att avgöra CFU / g eller CFU / ml än i genomsnitt CFU från olika utspädningsfaktorer. Det är viktigt att notera att alla spädningsmedel och media i hela förfarandet måste innehålla tillräckligt med salt för att upprätthålla lönsamheten för halofila bakterier såsom V. parahaemolyticus. Inkubationstemperatur och miljö måste vara optimal för bakterietillväxt.
Det kromogena mediet är utformad för att upptäcka Vibrio arter som är viktiga humana patogener. Därför måste ytterligare studier genomföras för att determine dess effektivitet för att upptäcka andra miljö Vibrio arter som inte är medicinskt relevant. I framtida applikationer, kan den nya kromogena agar införlivas i rutintestning av miljöprover för V. parahaemolyticus. Detta kan ske genom direkt strimmor av prover på det kromogena agar att detektera närvaron av presumtiva V. parahaemolyticus. Det kromogena agar kan också användas för att räkna upp V. parahaemolyticus efter späd. Kvantifiering kan också uppskattas genom att utföra en most probable number metod med anrikningsbuljong, följt av strimmor på det kromogena agar för bekräftelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar M. Channey, E. Chau, och K. Tomas för deras hjälp i projektet. Projekt leveranser var delvis finansierat av California Polytechnic State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Equipment | |||
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | may use other brands |
| Autoclave | Any | ||
| BHI powder | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | may use other brands |
| Blender | Any | to blend oyster meat | |
| CampyGen gas generator | Hardy Diagnostics | CN035A | to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands |
| Chocolate agar plates | Hardy Diagnostics | E14 | may use other brands |
| Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) | Any | or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014) | |
| Culture tubes | Fisher Scientific | S50712 | may use other brands |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | S348903 | may use other brands |
| Gel doc | Any | ||
| HardyChrom Vibrio agar plates | Hardy Diagnostics | G319 | This study evaluates this medium |
| Incubator | Any | ||
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-606 | 10 microliter-size was used in this study |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | may use other brands |
| Oysters | Any | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | may use other brands |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | may use other brands |
| Pipette and tips | Any | Sterilized tips | |
| Primers for tlh | IDT DNA | ||
| Scale | Any | ||
| Spreader | Fisher Scientific | 08-100-11 | Beads may be used instead |
| Stomacher blender | Stomacher | 400 | Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec. Other homogenizer can be used. |
| Sterile filter bags for blenders | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS powder | Hardy Diagnostics | 265020 | This study evaluates this medium |
| Thermocycler | Any | ||
| TSB powder | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | may use other brands |
| UV viewing cabinet | Any | Emit long-wave UV light | |
| Water bath | Any | |
|
| Name | Sources | Catalog Number | Comments |
| Bacterial species and strains | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| Escherichia coli | ATCC | ||
| Proteus mirabilis | ATCC | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| Shigella boydii | ATCC | ||
| Shigella flexneri | ATCC | ||
| Shigella sonnei | ATCC | ||
| Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) | FDA, ATCC | ||
| V. damsela | FDA | ||
| V. fisheri | Environment | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| V. furnissii | CDC | ||
| V. hollisae | FDA | ||
| V. metschnikovii | ATCC | ||
| V. mimicus | FDA | ||
| V. parahaemolyticus (serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc.) | ATCC, FDA, CDC, Environment | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| V. vulnificus | FDA |
References
- Yeung, P. S., Boor, K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).
- Yeung, P. S. M., Boor, K. J. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. Faruque, S. M. , Caister Academic Press. 153-184 (2012).
- Centers for Disease Control and Prevention. Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food - Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010. Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).
- Centers for Disease Control and Prevention. Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008. , Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591 (2008).
- Scallan, E., et al. Foodborne illness acquired in the United States - major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).
- Baross, J., Liston, J. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State. Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).
- Baross, J., Liston, J. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific. Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).
- Kueh, C. S., Chan, K. Y. Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster. J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).
- Food and Drug Administration. Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , Second Edition, (2012).
- Qadri, F., et al. Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus. J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).
- Food and Drug Administration. Quantitative risk assessment on the public health impact of Vibrio parahaemolyticus in raw oysters. , Available from: http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/ResearchAreas/RiskAssessmentSafetyAssessment/ucm050421.htm (2005).
- Food and Drug Administration. Bacteriological analytical manual online. , Available from: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070830.htm (2004).
- MacFaddin, J. F. Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, Williams & Wilkins. Baltimore, Md. (1985).
- Bottone, E. J., Robin, T. Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features. J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).
- Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms. Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).
- Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).
- Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).
- Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus. J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).
- Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).
- Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).
- Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish. J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).
- Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates. Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).
- Duan, J., Su, Y. -C. Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).
- Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus. Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).
- Canizalez-Roman, A., Flores-Villaseñor, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Leòn-Sicairos, N. Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples. Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).
- Kriem, M. R., et al. Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains. Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).
- Food Drug Administration. Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests. http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).
- Burd, E. M. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).
- World Organisation for Animal Health. Principles and methods of validation of diagnostic assays for infectious diseases. , Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/1.01.05_VALIDATION.pdf (2013).
