Abstract
Voedselinfecties in de Verenigde Staten, veroorzaakt door Vibrio soorten hebben laten zien een stijgende trend. In het genus Vibrio, V. parahaemolyticus is verantwoordelijk voor het merendeel van Vibrio geassocieerde infecties. Aldus nauwkeurige differentiatie bij Vibrio spp. en detectie van V. parahaemolyticus is van cruciaal belang voor de veiligheid van onze voedselvoorziening te waarborgen. Hoewel moleculaire technieken worden steeds vaker worden kweek afhankelijk methoden nog routinematig en ze worden beschouwd standaardwerkwijzen onder bepaalde omstandigheden. Daarom werd een nieuwe chromogene agar medium getest met als doel het bieden van een betere werkwijze voor isolatie en differentiatie van klinisch relevante Vibrio spp. Het protocol vergeleken de sensitiviteit, specificiteit en detectielimiet voor de detectie van V. parahaemolyticus tussen de nieuwe chromogene medium en een conventioneel medium. Diverse V. parahaemolyticus stammen (n = 22) rede presentatie van diverse serotypes en de bron van oorsprong werden gebruikt. Zij werden eerder geïdentificeerd door de Food and Drug Administration (FDA) en de Centers for Disease Control and Prevention (CDC), en door TLH -PCR in ons laboratorium verder geverifieerd. In ten minste vier afzonderlijke onderzoeken werden deze stammen geënt op de chromogene agar en thiosulfaat-citraat-galzouten sucrose (TCBS) agar, is de aanbevolen medium voor het kweken van deze soort, gevolgd door incubatie bij 35-37 ° C gedurende 24 -96 uur. Drie V. parahaemolyticus stammen (13,6%) niet optimaal groeien op TCBS, toch tentoongesteld groene koloniën als er groei. Twee stammen (9,1%) niet de verwachte cyaan kolonies opleveren op het chromogene agar. Niet- V. parahaemolyticus stammen (n = 32) werden ook getest om de specificiteit van het chromogene agar te bepalen. Onder deze stammen, 31 niet groeien of tentoongesteld andere kolonie morfologie. De gemiddelde herstel van de V. parahaemolyticus op de chromogenic agar was ~ 96,4% betrokken op tryptische soja-agar gesupplementeerd met 2% NaCl. Concluderend, de nieuwe chromogene agar is een effectief medium te detecteren V. parahaemolyticus en het te onderscheiden van andere vibrio.
Introduction
Als lid van het genus Vibrio, V. parahaemolyticus is een Gram-negatieve, niet-sporen-vormende, gebogen, staafvormige bacterie. Vertoont hoge motiliteit in zowel vloeibare en halfvaste omgevingen. De meeste V. parahaemolyticus stammen zijn niet-pathogeen voor mensen, maar de pathogene subtypen veroorzaakt epidemieën en pandemieën, waardoor deze soort wordt beschouwd als een belangrijke voedselpathogeen in veel landen 1,2. De incidentie van Vibrio infectie in de VS heeft een stijgende trend sinds 2000 3. Onder Vibrio spp., V. parahaemolyticus is de meest frequent gemelde soorten veroorzaken ziekten in de VS 4,5. Andere klinisch relevante soorten zijn V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, etc. Een klein percentage van de ziekte wordt veroorzaakt door meerdere soorten tegelijk.
V. parahaemolyticus is een natuurlijke inhabitant van zeewater en dus op grote schaal verspreid in mariene wateren over de hele wereld met inbegrip van de estuaria. De soort werd ontdekt in 1950 na een uitbraak van voedselvergiftiging in Japan. In de VS werd de soort voor het eerst geïsoleerd in zeewater, sedimenten en schelpdieren in de Puget Sound regio 6,7. Filtervoeders in mariene habitats, zoals tweekleppige schelpdieren, kan haven V. parahaemolyticus als onderdeel van hun natuurlijke flora 8. Als zodanig V. parahaemolyticus infecties bij de mens zijn vaak gekoppeld aan de consumptie van besmette vis, vooral rauw of onvoldoende verhit schelpdieren. Een minder gebruikelijke route van binnenkomst optreedt wanneer open wond wordt blootgesteld aan zeewater, waardoor huidinfectie. De meeste V. parahaemolyticus spanningen veroorzaken geen ziekte bij de mens, maar toch bepaalde subtypen herbergen virulentie factoren, zoals thermostabiel direct hemolysine (TDH) zijn pathogeen. De meest voorkomende symptomen van voedselvergiftiging V. parahaemolyticus infectiediarree en buikpijn, gevolgd door misselijkheid, braken, en koorts. Hoofdpijn en koude rillingen zijn ook gemeld. De mediane incubatietijd is 15 uur, maar kan tot 96 uur na consumptie van voldoende hoeveelheid pathogene stammen 9. De ziekte duurt twee tot drie dagen. De gastro symptomen veroorzaakt door V. parahaemolyticus grotendeels zelfbeperkend en daarom speciale behandeling niet nodig. Milde gevallen van gastro-enteritis kunnen worden behandeld door orale rehydratie. Ernstigere ziekten kunnen worden behandeld met antibiotica zoals tetracycline en ciprofloxacine 10. Sterftecijfer ongeveer 2% voor gastro gevallen, maar kan oplopen tot 29% voor die septicemie of sepsis ontwikkelen. Elke persoon die vis consumeert of heeft open wond blootgesteld aan zeewater is het risico van V. parahaemolyticus infectie. De ernstigere vorm van ziekten, levensbedreigende septikemie, komt vaker voor bij een subpopulatie met onderliggende medische conditions 11, die alcoholisme, leverziekte, diabetes, nierziekte, maligniteit en andere omstandigheden die leiden tot een verzwakte immuunrespons omvatten. Met name deze groep van individuen is ook op een hoger risico voor het oplopen van ernstige ziekten veroorzaakt door V. vulnificus, die kan worden gevonden in vergelijkbaar met V. natuurlijke habitats parahaemolyticus.
V. parahaemolyticus wordt routinematig geïsoleerd met behulp van thiosulfaat-citraat-galzouten-sucrose (TCBS) agar als een selectieve en differentiële medium. Verrijking in alkalisch peptonwater kan isolatie voorafgaan op TCBS agar. Vermoedelijke kolonies op TCBS worden verder getest in een reeks van biochemische tests en / of moleculaire assays gericht op de aanwezigheid van soortspecifieke genen. PCR-gebaseerde werkwijzen worden vaak gebruikt om de identiteit van V. bevestigen parahaemolyticus door het versterken van de thermolabiele hemolysin gen, TLH 12.
Ongeacht de lOICE van bevestigingsmethoden, is het belangrijk om een effectief medium te isoleren en te differentiëren V. hebben parahaemolyticus van andere mariene vibrio's in de eerste plaats. TCBS is routinematig gebruikt om soorten differentiëren binnen de genus Vibrio naar vermogen om sucrose 12 gisten. Positieve fermentatie gepaard gaat met een kleurverandering van de pH-indicator broomthymolblauw. V. parahaemolyticus kolonies zijn vrij onderscheidend op TCBS, tentoonstellen blauw naar groen kleur. Dit kan echter niet gemakkelijk onderscheiden medium V. alginolyticus en V. cholerae. sucrose fermenteren Proteus soorten kunnen gele kolonies die lijkt V. produceren cholerae of V. alginolyticus 13. Bij de eerste isolatie op TCBS, V. parahaemolyticus kan ook worden ten onrechte aangemerkt als Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides en Pseudomonas spp 14. Stammen met vertraagde sucrose fermentatie kan worden verward met andere sucrose nonfermenting Vibrio 13, die onder meer V. parahaemolyticus. TCBS bleek ongevoelig tegen Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens, onder anderen. Verscheidene andere soorten op groen naar grijs kolonies die mogelijk worden verward met V. parahaemolyticus of V. vulnificus 15. Dientengevolge is het wenselijk om alternatieve kweekmedia ontwikkelen betere gevoeligheid en specificiteit richting detecteren en isoleren V. parahaemolyticus en andere nauw verwante soorten.
Verschillende media alternatieven zijn recent ontwikkeld. Naast het opnemen van selectiemiddelen meeste nemen chromogene substraten soorten onderscheiden op basis van hun differentiële enzymatische activiteiten. Bijvoorbeeld zijn indoxyl-β-glucoside en indoxyl-β-galactoside gebruikt als chromogene substraten V. differentiëren parahaemolyticus kolonies (die blauw-groen weergegeven) van die van V. cholerae (paars) vanwege hun differentiële vermogen om β-glucosidase en β-galactosidase 16 te produceren. Verschillende formuleringen van chromogene agar ontwikkeld door verschillende groepen onderzocht en gerapporteerd vergelijkbaar of beter dan TCBS 17,18,19 te voeren. Een voordeel van het gebruik van een chromogeen medium is dat het kleuren van het omringende medium minimaal is waardoor de isolatie van bepaalde kolonies vergemakkelijkt. In dit onderzoek onderzochten we de mogelijkheid van een nieuw geformuleerde chromogeen medium voor detecteren en isoleren V. cholerae, V. parahaemolyticus en V. vulnificus; met een speciale focus op het vermogen om onderscheid te maken V. parahaemolyticus van andere soorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Media en het kweken van bacteriestammen
LET OP: Gebruik aseptische technieken in alle experimenten. Gebruik steriele materialen. Steriliseren alle containers, instrumenten en reagentia voor gebruik. Autoclaaf alle afvalstoffen voorafgaand aan verwijdering, omdat ze biologisch gevaarlijk worden beschouwd. Autoclaaf temperatuur en tijd combinatie ≥121 ° C x ≥15 min voor elk van de volgende procedures.
- Om ~ 1-L tryptische soja-agar (TSA), eerste voeg 1 L gedeïoniseerd water in een 2-L Erlenmeyer kolf met een magnetische roerstaaf. Gebruik een kolf die ten minste twee maal groter is dan het volume. Voeg 30 g tryptische soja bouillon poeder en 20 g agar korrels in de kolf.
LET OP: Gebruik 2% agar in plaats van 1,5% tot zwermende van een aantal Vibrio spp beperken.- Meng goed door het inschakelen van de roerder. Onder roeren, zet de warmte aan het mengsel koken. Verwijder de kolf uit de kachel zodra het mengsel begint te koken. Losjes dekken the kolf met een aluminiumfolie. Tape de folie om het vast te zetten aan de kolf vóór autoclaaf.
- Om tryptische soja bouillon (TSB) te maken, laat de agar van het recept in stap 1.1.
LET OP: Het gebruik van mei flessen in plaats van Erlenmeyer. - Om tryptische soja-agar gesupplementeerd met 2% natriumchloride of NaCl (TSA), voeg 20 g NaCl in het mengsel vóór het roeren en verwarmen. Om tryptische soja bouillon aangevuld met 2% NaCl (TSBS) te maken, laat de agar, voeg 20 g NaCl in het mengsel voorafgaand aan het roeren en verwarmen.
- Om de hersenen het hart infusie (BHI) agar te maken, op te schorten 37 g BHI poeder en 15 g agar korrels in 1 liter gezuiverd water. Heat met frequente agitatie om het poeder op te lossen. Autoclaaf. Laat de agar om BHI bouillon te maken.
- Om TCBS agar te maken, op te schorten 89 g van het TCBS poeder in 1 liter gezuiverd water. Heat met frequente agitatie en kook gedurende 1 minuut om volledig op te lossen het poeder. Niet in een autoclaaf.
- Voor alle agar media, koelen van de hete agar naar 45-50 ° C in een waterbad. Schik lege Petri platen in stapels van 5-6 platen. Vanaf de bodem van de stapel, giet het gesmolten agar in elk Petri plaat halfvol bereiken. Sluit de Petri plaat deksel na het gieten. Laat de agar te stollen door te laten de platen zitten bij kamertemperatuur.
- Gebruik de agarplaten de volgende dag of na 12 uur. Bewaar ongebruikte platen in de koelkast voor maximaal twee weken. Verwijder voor gebruik platen uit de koelkast en equilibreren bij kamertemperatuur gedurende ten minste 15 min.
LET OP: One-liter agar maakt ~ 45 agarplaten. Laat de agarplaten voldoende drogen op de dag van bereiding en evenwicht ze op kamertemperatuur na koude opslag effectief de verspreiding van de kolonies.
- Gebruik de agarplaten de volgende dag of na 12 uur. Bewaar ongebruikte platen in de koelkast voor maximaal twee weken. Verwijder voor gebruik platen uit de koelkast en equilibreren bij kamertemperatuur gedurende ten minste 15 min.
- Verkrijgen chocolade en chromogene agarplaten en equilibreren bij kamertemperatuur vóór elk experiment.
- Subcultuur alle 54 microbiële stammen weergegeven in tabel 1 elk paar days.
- Gebruik een steriele entnaald om culturen te brengen van een bevroren voorraad of een vorige partij om niet-selectieve media zoals BHI, TSB / TSA of chocolade agar. Grow halophilic Vibrio spp. op TSBS / TSA.
- Om de zuiverheid van de kweek controleren, strook alle stammen in een patroon die het mogelijk maken voor waarneming van geïsoleerde kolonies. Gebruik bijvoorbeeld driefase strepen patroon een grote hoeveelheid bacteriën verdunnen tot kleinere hoeveelheid, hetgeen uiteindelijk geïsoleerde kolonies.
- Incubeer de platen omgekeerd bij 35-37 ° C gedurende maximaal 48 uur. Voor Campylobacter spp., Incubeer buizen of platen in een gesloten deksel pot met daarin een gas hoes om een Microaërofiele omgeving te produceren. Observeer kolonie morfologie na incubatie. Zuivere culturen moet kolonies die vergelijkbaar koloniemorfologie vertonen verkregen.
OPMERKING: Incubeer alle platen ondersteboven te voorkomen gecondenseerde waterdruppels gevormd aan de onderzijde van het deksel valt op de colOnies.
2. Soort Vaststelling door PCR
- Gedrag tlh -PCR om de identiteit van V. bevestigen parahaemolyticus stammen. Gebruik primers TLH -F (5 'AAA GCG GAT TAT GCA GAA GCA CTG 3') en tlh -R (5 'GCT ACT TTC CAT TAG TTT CTC TGC 3') om een 450-bp fragment van de thermolabiele hemolysine gen 20 amplificeren .
- Gebruik een steriele entnaald om een paar geïsoleerde kolonies van elk V. overdragen parahaemolyticus stam van TSA tot 5 ml TSBS. Incubeer bij 35-37 ° C gedurende 16-24 uur.
- Centrifugeer kweken bij 14.000 xg gedurende 1 min. Verwijder supernatant en was de pellet tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Kook de suspensie gedurende 3 min cellysaat verkregen.
LET OP: V. parahaemolyticus is gemakkelijk te worden gelyseerd. Daarom lysis reagens is niet vereist. Het is ook mogelijk een beetje kolonie rechtstreeks gebruikt als de template. - Voer PCR in een 25-ul reactie volume. Bereid een reactiemengsel dat een uiteindelijke concentratie van 1x PCR-buffer, 1,5 mM MgCl2, 100 uM van elk dNTP, 1 uM van elke primer, 1 U Taq-polymerase en 1 pl cellysaat. Na voorincubatie bij 94 ° C gedurende 5 min, run 35 amplificatie cycli van 94 ° C gedurende 30 sec, 58 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 60 sec 21.
- Belasting aliquots van 5 pl amplicon in 1,5% agarosegels. Schakel de stroomtoevoer naar elektroforese starten. Visualiseren de aanwezigheid of afwezigheid van amplicons onder UV-belichting na ethidiumbromide kleuring.
3. Groei op Selectief en Differential Media
- Twee tot vier dagen voor het experiment, streep bacteriële stammen weergegeven in Tabel 1 op niet-selectief medium (TSA, of chocolade BHI agar) voor colony isoleren. Incubeer de platen bij 35-37 ° C gedurende 48 uur. Controleer de zuiverheid van de kweken door het observeren kolonie morfologie na incubatie. Zuivere culturen moet kolonies die vergelijkbaar koloniemorfologie vertonen verkregen.
- Transfer enkele geïsoleerde kolonies van Stap 3,1 tot 5 ml bouillon. Incubeer buizen bij 35-37 ° C gedurende 16-24 uur.
OPMERKING: Gebruik de jonge kolonies, die minder dan vier dagen oud zijn, om 's nachts culturen bereiden in alle experimenten. - Streak een lus vol van 's nachts culturen op selectieve en differentiële media (TCBS en chromogene agar) voor kolonie isolement. Incubeer de platen bij 35-37 ° C gedurende maximaal 96 uur.
- Noteer de globale groei van alle stammen van onderzoeken zowel de kweekdichtheid op de plaat en de afmeting van geïsoleerde kolonies. Noteer de kleur van kolonies onder omgevings- en / of UV-licht. Let op andere kenmerken van geïsoleerde kolonie zoals de verheffing, marge en vorm.
4. Recovery Assay
- Selecteer een representatieve deelverzameling V. parahaemolyticus stammen (n = 14) die verschillende serotypen en de oorsprong van isolatie omvatten
- Voer een Standaardkiemgetal werkwijze volgens de overnachtcultures zoals hieronder beschreven.
- Vortex aan de 's nachts culturen meng goed. Voeg een 10-voudig of 10 -1 verdunning door overdracht 100 pl van de kweek gedurende de nacht in een buis met 900 ui PBS. Vortex goed te mengen.
- Gebruik een nieuwe pipet tip om 100 ul te brengen van de 10 -1 verdunning buis naar een andere buis met 900 ul PBS. Vortex goed te mengen. Dit vormt 10 -2 verdunning. Herhaal de werkwijze sequentieel 10 -7 verdunning te verkrijgen.
- Met de 10 -4 tot 10 -7 verdunningsbuizen, plaat 100 ul elk op het chromogene, TCBS en TSA agarplaten.
LET OP: De verdunningsfactor (DF) op de plaat wordt 10 -5 tot 10 -8, respectievelijk. - Verdeel de porties gelijkmatig over thij agar oppervlak.
Opmerking: Het is goed om hetzelfde spreider per stam op hetzelfde medium, zolang het meest verdunde monster eerst verspreid (dwz van 10 tot -8 10 -5). Doe hetzelfde strooier voor verschillende media niet gebruiken. - Incubeer de platen bij 35-37 ° C gedurende maximaal 96 uur. Rekenen kolonies op de platen. Negeren platen waarop kolonies die te talrijk om te tellen (tntc) of minder dan 25. Bereken CFU / ml volgens de volgende zijn:
Waar
N = het aantal cellen in de onverdunde buis, uitgedrukt in CFU / ml of CFU / g
C = het totale aantal getelde kolonies op platen die 25-300 kolonies dragen
n 1 = het nummer van de plaat (en) waar geteld kolonies zijn afkomstig uit de lagere df
n2 = het aantal platen (en) waar kolonies geteld vanaf de volgende 10-voudige verdunning
df = de onderste verdunningsfactor (dat wil zeggen, meer geconcentreerd verdunning)
- Vergelijk CFU / ml tussen verschillende media. Gebruik CFU / ml op TSA als 100%, het berekenen van de% terugwinning van V. parahaemolyticus geteeld op de chromogene en TCBS agar.
- Voer een Standaardkiemgetal werkwijze volgens de overnachtcultures zoals hieronder beschreven.
5. Mededinging Assay
- Kies een subset van stammen die verschillende kolonie morfologie op de chromogene en TCBS agar vertonen.
LET OP: Op deze manier zal het mogelijk zijn om te tellen kolonies ontstaan uit V. Alleen parahaemolyticus, ondanks de aanwezigheid van andere soorten in het inoculum.- Kies een V. parahaemolyticus stam die de verwachte turquoise en cyaan kolonies op TCBS en de chromogene agar oplevert, respectievelijk.
- Kies een niet-V. parahaemolyticus en Vibrio niet die niet groeien op een van deze media, of verschillende koloniekleur.
LET OP: Bijvoorbeeld, V. metschnikovii groeit zeer zwak on TCBS en niet groeien op het chromogene agar. Shigella sonnei groeit niet op TCBS maar levert magenta kolonies op de chromogene agar.
- Na de selectie van de stammen bovenstaande, voor te bereiden 's nachts bouillon culturen met behulp van geïsoleerde kolonies gegroeid op niet-selectieve media.
- Maak 's nachts culturen van V. parahaemolyticus en V. metschnikovii door de overdracht van enkele geïsoleerde kolonies van TSA tot 5 ml TSBS. Incubeer bij 35-37 ° C gedurende 16-24 uur.
- Maak 's nachts culturen van Shigella sonnei door de overdracht van enkele geïsoleerde kolonies van BHI agar tot 5 ml BHI bouillon. Incubeer bij 35-37 ° C gedurende 16-24 uur.
- Voor elke stam, het uitvoeren van een verdunningsreeks vergelijkbaar met Steps 4.2.1 en 4.2.2. Plaat geschikte verdunningen op BHI TSA of CFU / ml van de overnacht kweek vast te stellen volgens de vergelijking uit stap 4.2.5.
OPMERKING: Typisch 100 gl van 10 tot 10 -5 -7 verdunningbuizen werkt voor de meeste culturen. Gebruik de CFU / ml waarden om een back-het berekenen van de precieze hoeveelheid cellen die worden gebruikt in de volgende stap. De berekende CFU / ml waarden verkregen na incubatie, hoewel de volgende stappen uitgevoerd op dezelfde datum als Stap 5,3. - Met behulp van de 's nachts culturen en verdunning buizen in de stappen 5.2 en 5.3, combinaties van verschillende hoeveelheden van een V. parahaemolyticus stam en een niet-V. parahaemolyticus soorten. Bijvoorbeeld, meng 500 pi van de 10 -5 verdunning tube V. parahaemolyticus met 500 ul van de 's nachts culturen van V. metschnikovii.
NB: Dit mengsel simuleert hoge microflora achtergrond. Om een lage microflora achtergrond simuleren, meng 500 pi elk van de 10 -5 verwatering tube van beide soorten. - Spread 100 pi van het mengsel elk op het chromogene, TCBS en TSA agarplaten.
- Na incubatie bij 35-37 ° C gedurende maximaal 96 uur, tellen kolonies V. parahaemolyticus en de niet V. parahaemolyticus species op basis van hun verschil in groei en koloniemorfologie de chromogene en TCBS agar.
OPMERKING: Indien bijvoorbeeld de niet V. parahaemolyticus soort groeit niet aan de chromogene en TCBS agar, alle kolonies zullen van V. zijn parahaemolyticus. Als de niet V. parahaemolyticus soort groeit op beide media, wordt alleen de turquoise kolonies op TCBS en cyaan kolonies op chromogene agar van V. zijn parahaemolyticus. De niet V. parahaemolyticus soorten al dan niet vertonen vergelijkbare kolonie morfologie V. parahaemolyticus op TSA.- Als de niet V. parahaemolyticus soort groeit eveneens V. parahaemolyticus op deze niet-selectief medium, verdeel het kiemgetal door twee nummers voor het verkrijgen van V. parahaemolyticus alleen. Vergelijk de werkelijke kiemgetal met de verwachte telling afgeleid van stap 5.3.
6. Effects van Oyster Homogenaten
- Weeg ≥50 g oester vlees van ≥12 weekdieren inclusief vlees en drank.
- Voeg gelijke hoeveelheid van PBS om de oester vlees en drank. Mengen van het mengsel bij hoge snelheid gedurende 90 seconden. Dit vormt 2 -1 verdund oester homogenaat.
- Voeg 100 g 2 -1 verdund oester homogenaat tot 400 g PBS. Gebruik een schaal om het gewicht, niet volume te meten. Mengen van het mengsel bij hoge snelheid gedurende 1 minuut. Autoclaaf de oester homogenaat.
LET OP: Dit zal de oester homogenaat gebruikt voor spiking zijn.
- Herhaal de Recovery test (Stap 4) in de aanwezigheid van oester homogenaat.
- Na de 500 g oester homogenaat afkoelt, voeg 100 ul van V. parahaemolyticus overnacht culturen gekweekt in TSBS aan. Bepaal het werkelijke bedrag van V. parahaemolyticus cellen in de entstof door het uitvoeren van de Standard Plate Count procedures in Stap 4.2.
- Repeet de competitie assay (Stap 5) in aanwezigheid van oester homogenaat.
- Na de 500 g oester homogenaat afkoelt, voeg 100 ul van elk van 's nachts culturen van V. parahaemolyticus en niet- V. parahaemolyticus aan. Bepaal het werkelijke bedrag van de bacteriële cellen in de entstof door het uitvoeren van de Standard Plate Count procedures beschreven in stap 4.2
- Meng de bacteriële cellen met oester homogenaat goed met behulp van een homogenisator.
LET OP: Na het mengen van de oester homogenaat met het opzettelijk toegevoegde cellen heet spiked oester homogenaat. - Maak verdunningen van het verrijkte oester homogenaat 10 -1 tot 10 -3 verdunningsbuizen verkrijgen volgens de in stap 4.2.2 beschreven procedures. Spread 100 pi van elke verdunning op de chromogene, TCBS en TSA agar. Incubeer de platen bij 35-37 ° C gedurende maximaal 96 uur.
- Vergelijk de werkelijke kiemgetal op chromogene en TCBS agar met de exwachte kiemgetal afgeleid uit stappen 6.2.1 en 6.3.1.
OPMERKING: Indien bijvoorbeeld een buis van V. parahaemolyticus nachtkweek bevat 10 8 CFU / ml, een inoculum van 100 gl betekent dat 10 7 cellen worden toegevoegd aan de 500-g oester homogenaat, waarbij 5 x 10 4 cellen / g. Na verdunning en plating, de plaat met df = 10 -2 moet 500 kolonies opleveren; terwijl dat het hebben van df = 10 -3 moet 50 kolonies opleveren. Dit zijn de verwachte kolonietellingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze studie werden 54 microbiële stammen samengesteld die 22 -stammen in de V. parahaemolyticus species, 19 andere Vibrio en 13 niet Vibrio soorten (Tabel 1). De meeste V. parahaemolyticus stammen werden ofwel ontvangen van de FDA, CDC of andere openbare gezondheidszorg afdelingen. Zij vertegenwoordigen verschillende serotypes en isolatie bronnen. Deze stammen werden eerder geïdentificeerd door de regelgevende instanties. We bevestigden verder de identiteit van die V. parahaemolyticus door het uitvoeren van een tlh -PCR 21,22.
| species | Aantal geteste stammen | Groei en de kleur van kolonies | |
| TCBS | Chromogenic medium | ||
| Aeromonas hydrophila | 2 | Geen groei | 1 stam geen groei; |
| 1 stam magenta kleur | |||
| Candida albicans | 1 | Zwakke groei, geel | Geen groei |
| Campylobacter jejuni | 1 | Geen groei | Geen groei |
| Escherichia coli | 1 | Geen groei | Zwakke groei, magenta |
| Proteus mirabilis | 1 | Geen groei | Geen groei |
| Pseudomonas aeruginosa | 2 | Turkoois | Geel |
| Staphylococcus aureus | 1 | Zwakke groei, geel | Geen groei |
| Salmonella choleraesuis | 1 | Geen groei | Geen groei |
| Shigella boydii | 1 | Geen groei | Geen groei |
| Shigella flexneri | 1 | Geen groei | Geen groei |
| Shigella sonnei | 1 | Geen groei | Zwakke groei, magenta |
| Vibrio alginolyticus | 3 | Geel of turquoise | Geel |
| V. cholerae | 4 | Geel of turquoise | Magenta |
| V. damsela | 1 | Turkoois | Kobalt |
| V. fisheri | 1 | Zwakke groei, geel | Geen groei |
| V. fluvialis | 1 | Turkoois | Kobalt |
| V.furnissii | 1 | Geel | Geel |
| V. hollisae | 1 | Turkoois | Geel |
| V. metschnikovii | 1 | Geen groei | Geen groei |
| V. mimicus | 1 | Turkoois | Magenta |
| V. parahaemolyticus | 22 | De meeste stammen turquoise | De meeste stammen cyaan; enkele duidelijke |
| V. proteolyticus | 1 | Turkoois | Kobalt |
| V. vulnificus | 4 | Turquoise of helder | Magenta |
Tabel 1. Microbiële species die in deze studie en hun groei kenmerken selectieve en differentiële media. Kleur bellen was based op een kleurenwiel. Cyaan lijkt op blauwgroen; magenta lijkt op roze lavendel, turquoise is vergelijkbaar met groene, gele en bruine olijf omvat.
Vier afzonderlijke proeven werden uitgevoerd om de groei en morfologie van de kolonies van deze stammen te bepalen op selectieve en differentiële media - TCBS en het chromogene agar. TCBS is het gebruikelijke medium voor de isolatie van bepaalde Vibrio soorten, waaronder V. V. cholerae en parahaemolyticus 12. Kleurvariatie kolonies gegroeid op TCBS was geel, turkoois (groen) of helder (figuur 1).
Figuur 1. Morfologie van de kolonies van Vibrio spp. op TCBS agar. V. parahaemolyticus (turkoois), V. cholerae (geel), en AM EMENGDE inoculatie van de twee species (a). Kolonies van V. parahaemolyticus verschijnen turkoois, met een ronde, hele, en convexe morfologie (b). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het vermogen van een nieuw chromogeen medium om te kiezen voor klinisch relevante Vibrio soorten van voeding en milieu monsters werd getest. Bovendien, het vermogen van het medium om gelijktijdig onderscheiden deze soorten van elkaar geëvalueerd. Koloniekleur waargenomen op de chromogene agar waren kobalt, cyaan, magenta, geel of helder (figuur 2). Zoals getoond in Tabel 1, zowel TCBS en het chromogene agar vertoonden bepaalde mate van selectiviteit tegen niet Vibrio microorganismen.
1 ">
Figuur 2. Morfologie van de kolonies van Vibrio spp. de nieuw ontwikkelde chromogene agar. V. parahaemolyticus (cyaan), V. cholerae (magenta) en een gemengde inoculatie van de twee species (a). Kolonies van V. parahaemolyticus verschijnen cyaan, met een ronde, hele, en convexe morfologie (b). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Naar aanleiding van de Standard Plate Count methode op 's nachts culturen, kolonies van V. parahaemolyticus werden waargenomen op de chromogene agar platen ontvangen van de hoogste verdunning factor (ie, df = 10 -8). Deze resultaten waren vergelijkbaar met die op een niet-selectief medium (TSA). Dit suggereert dat de detectiegrens van de chromogene medium lijkt op niet-selectieve media, die ongeveer 10 cellen of lager in de afwezigheid van voedselmatrix. De detectiecapaciteit van andere Vibrio, zoals V. alginolyticus, V. en V. fluvialis jonkvrouw was ook redelijk in vergelijking met het niet-selectieve medium. Sommige stammen van V. cholerae, V. vulnificus en V. mimicus gaf 10- tot 100-voudig minder CFU op de chromogene agar. De selectieve middelen die worden gebruikt in de chromogene of andere selectieve media onvermijdelijk remmen sommige cellen. Beschadigde cellen, bijvoorbeeld kan niet herstellen in selectieve media. Toch is het iets minder goede detectie vermogen is een non-issue in de meeste routine procedures die een verrijking stap in dienst. Kleine hoeveelheid micro-organismen in het levensmiddel of milieumonster zou vermenigvuldigen tot een hoog niveau in de verrijkingsbouillon, meer dan de detectiegrens. Verrijking in alkalisch peptonwater is often gedaan om de prevalentie van Vibrio determineren in monsters 12 milieu.
In aanwezigheid van oesters homogenaat, het chromogene agar steeds een goede mate van herstel zien. Met andere woorden, een groot deel (> 70%) van V. parahaemolyticus cellen konden groeien op de chromogene agar, beïnvloed door de aanwezigheid van oesters matrix (figuur 3a). De groei en het herstel van V. parahaemolyticus cellen werd niet beïnvloed door de aanwezigheid van andere Vibrio soorten (Figuur 3b). Dit is een belangrijke eigenschap omdat milieumonsters zijn gebonden aan verschillende Vibrio soorten bevatten, die zijn bij hoge aantallen vooral na een verrijking procedure.
Figuur 3. Percentage herstel van een V. parahaemolyticus stam in oester homogenaat met en zonder een bacteriële concurrent. Recovery (gemiddelde ± SD) werd berekend volgens de waargenomen vs de verwachte CFU rekenen op de agarplaten. Verwachte aantal CFU werd berekend gebaseerd op het aantal bacteriën in het inoculum. Hoge herstel van een V. parahaemolyticus stam werd waargenomen op alle media zonder concurrentie (a). Vergelijkbaar niveau van herstel werd waargenomen wanneer hoge niveaus van V. metschnikovii cellen was aanwezig (b). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om verder vergelijken chromogene en TCBS agar, werden de gevoeligheid en specificiteit berekend. Tabel 2 toont het vermogen van deze media voor Accuderlijk te identificeren V. parahaemolyticus. Gevoeligheid is gerelateerd aan het percentage ware positief, hetgeen betekent V. parahaemolyticus stammen leverden de verwachte kolonie morfologie op de media. Specificiteit is gerelateerd aan het percentage ware negatieve, die niet betekent V. parahaemolyticus stammen moeten arme vertonen geen groei, of een andere kolonie morfologie dan V. parahaemolyticus. De sensitiviteit en specificiteit voor TCBS V. identificeren parahaemolyticus waren 86,4% en 71,8%, respectievelijk. Ter vergelijking, de gevoeligheid en specificiteit van het chromogene medium waren 90,9% en 96,9%, respectievelijk.
| een) | ||
| TCBS agar | V. parahaemolyticus | Non-V. parahaemolyticus |
| Een goede groei en turquoise colonies | 19 | 9 |
| Slechte groei of niet-turquoise kolonies | 3 | 23 |
| b) | ||
| chromogene agar | V. parahaemolyticus | Non-V. parahaemolyticus |
| Goede groei en cyaan kolonies | 20 | 1 |
| Slechte groei of niet-cyaan kolonies | 2 | 31 |
Tabel 2. Gevoeligheid en specificiteit van TCBS (a) en chromogene (b) agar bij de detectie van V. parahaemolyticus. De identiteit van V. parahaemolyticus waren eerder bepaald door biochemische test- en tlh- PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit onderzoek richt zich op de ontwikkeling en evaluatie van de cultuur media. Conventioneel TCBS is het selectief en differentieel medium voor de isolatie en het detecteren V. parahaemolyticus, V. cholerae en V. vulnificus 12. Echter zijn beperkingen gerapporteerd voor dit medium, zoals het onvermogen om onderscheid V. cholerae uit andere Vibrio. Sucrose en pH-indicator zijn de differentiatie agenten van TCBS. Aldus zuurproductie sucrose fermentor veroorzaakt kleurverandering van het medium. De kleuring van het medium is een nadeel van TCBS omdat waarneming van koloniemorfologie kan maskeren. De nieuw ontwikkelde chromogeen medium gebruikt hoge pH en zoutgehalte op de groei van niet Vibrio in veel mariene monsters onderdrukken. De nieuwe chromogeen medium heeft een uiteindelijke pH van 8,6 ± 0,2. Per liter gedeïoniseerd water, het bestaat uit 10 g pepton, 10 g zeezout mengsel, 10 g os gal, 10 g natrium-thiosulfaat, 5 g gistextract, 5 g natriumcitraat, 2,2 g natriumcarbonaat, 2 g lactose, 0,5 g natriumpyruvaat, 0,3 g chromogene mix en 15 g agar. De chromogene mix maakt de differentiatie bij Vibrio spp. op basis van hun differentiële vermogen om bepaalde enzymen. In plaats van het veranderen van de kleur van de TCBS agarmedium, verschillende Vibrio spp. anders zou kolonie kleur op het nieuwe chromogene medium vertonen. Ter vergelijking, een commercieel verkrijgbare chromogeen medium bevat 15 g agar, 8 g pepton en gistextract, 51,4 g zout, 0,3 g chromogene mix en een uiteindelijke pH van 9,0 ± 0,2.
Robuustheid assay evaluatie afhankelijk van de monstergrootte. Aangezien deze studie wijst op de doeltreffendheid van de nieuwe chromogene medium te isoleren en detecteren V. parahaemolyticus is belangrijk voor veel verschillende V. vergaren parahaemolyticus stammen. Eerdere studies vergelijken TCBS ennieuwe cultuur media betrokken zijn vaak monsters van het milieu of om levensmiddelen die onbekende soort en hoeveelheid van de micro-organismen 23,24,25,26. Meerdere kolonies per monster werden geïsoleerd maar de klonale aard van de isolaten was vaak onbepaald. Idealiter verschillende stammen worden getest in assay ontwikkeling anders de nauwkeurigheid van de bepaling zou worden opgeblazen. Stam identiteit kan worden vastgesteld met gebruikelijke werkwijzen zoals subtypering pulsed-field gelelektroforese (PFGE) of multi-locus sequencing. V. parahaemolyticus stammen in deze studie zijn eerder gekarakteriseerd door ribotypering en PFGE 19.
Tijdens de testontwikkeling, gevoeligheid, specificiteit en detectiegrens behoren tot de belangrijkste factoren te worden onderzocht. Gevoeligheid, ook wel bekend als nauwkeurigheid of diagnostische gevoeligheid, is de positieve procent overeenkomst tussen de referentie en testmethoden. Specificiteit, ook bekend als precisie of diagnostische specificiteit, is het negatief procent per OVEREENKOMST tussen de referentie en testmethoden. In deze studie hebben we gebruik PCR-methode als referentiemethode omdat de resultaten werden geverifieerd tussen verschillende groepen. TCBS en het chromogene media waren de testmethoden. Om de gevoeligheid te bepalen resultaat van de V. parahaemolyticus stammen werden gebruikt, dat wil zeggen, gevoeligheid = 100% x True Positief / (True Positive + False Negative). Anderzijds resultaat van niet- V. parahaemolyticus stammen werden gebruikt om de specificiteit te bepalen; en dus specificiteit = 100% x True Negatief / (True Negatief + False Positive). Betrouwbaardere specificiteit resultaten op te leveren, niet V. parahaemolyticus stammen moeten worden geïsoleerd van een omgeving waar de bemonstering zal worden uitgevoerd. Onze gevoeligheid en specificiteit berekeningen zijn gebaseerd op documenten die door de overheid 27, de academische wereld 28 en 29 wetenschappelijke organisatie op een onderwerp met betrekking tot assay ontwikkeling en validatie.
nt "> Op basis van onze resultaten, het chromogene medium toonde betere prestaties dan TCBS bij de identificatie van V. parahaemolyticus. Het totale percentage overeenkomst tussen de referentie-methode en chromogeen medium is 94,4%, vergeleken met 77,8% tussen de referentiemethode en TCBS. de gevoeligheid en specificiteit van het chromogene medium zijn 90,9% en 96,9% respectievelijk, die groter zijn dan die van TCBS (86,4% en 71,9%, respectievelijk) zijn. Vorige studies die andere chromogeen medium voor de detectie van V. parahaemolyticus gevonden dat gevoeligheden varieerde 85-88% terwijl specificiteit varieerde 94-95% 23,24,25. echter, deze studies niet dezelfde berekeningsmethode als onze studie. Verder zijn ze soms een andere referentiemethode of zij gecombineerde resultaten van beide biochemische analyses en chromogeen medium als een testmethode. Daardoor is het moeilijk om direct onze resultaten te vergelijken met die eerdere studies.V. parahaemolyticus, kan de chromogene agar die in deze studie ook onderscheid meer Vibrio dan TCBS door de opname van een chromogeen mengsel middellange formule, waarbij meerdere kleuren. Hoewel het niet de focus van deze studie om V. op te sporen V. cholerae en vulnificus, het is het waard om op te merken dat de magenta kolonies tentoongesteld door deze soorten verder met behulp van fluorescentie kan worden gedifferentieerd onder UV. Een beperking van het chromogene agar gebruikt voor de detectie van V. V. cholerae en vulnificus is zijn schijnbare lage herstel voor deze soorten. Om dit probleem te omzeilen, moet een verrijking stap worden opgenomen. Een andere mogelijke beperking van het chromogene agar is de kortere houdbaarheid dan TCBS. Lopende optimalisatie van dit nieuwe medium is vereist om pH te handhaven tijdens opslag.
Ondanks de populariteit van moleculaire technieken, Cultuur-afhankelijk-methode is waardevol omdat ze vaak minder duur en hebben een betere detectiegrens. Deze kweken werkwijzen kunnen worden gebruikt als screeningsmethode. Omgekeerd kunnen ze worden gebruikt om de identiteit en de levensvatbaarheid van micro- organismen volgende moleculaire analyses bevestigen. Om bacteriën te inventariseren via een cultuur afhankelijk benadering wordt Standard Plate Count erkend als de standaard methode. De uit stap 4.2.5 vergelijking is een meer nauwkeurige manier om CFU / g of CFU / ml dan gemiddelde CFU's van verschillende verdunningsfactoren bepalen. Het is belangrijk op te merken dat alle verdunningsmiddelen en media gehele procedures voldoende zout moet bevatten om de levensvatbaarheid van halophilic bacteriën zoals V. handhaven parahaemolyticus. Incubatietemperatuur en milieu moet optimaal zijn voor de bacteriële groei.
De chromogeen medium is ontworpen Vibrio soorten die belangrijke menselijke pathogenen te detecteren. Daarom moeten verdere studies worden uitgevoerd om BEPALIne de effectiviteit van andere milieu-Vibrio soorten die medisch niet relevant zijn op te sporen. In de toekomst toepassingen kan de nieuwe chromogene agar in routine testen van milieu-monsters voor V. worden opgenomen parahaemolyticus. Dit kan via directe strepen van monsters op de chromogene agar detecteren op de aanwezigheid van vermoedelijke V. parahaemolyticus. De chromogene agar kan ook worden gebruikt om sommen V. parahaemolyticus volgende verdunningen. Kwantificering kan ook worden geschat door het uitvoeren van een meest waarschijnlijke aantal methode met behulp van ophopingsbouillon, gevolgd door strepen op de chromogene agar ter bevestiging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken M. Channey, E. Chau, en K. Tomas voor hun hulp aan het project. Project leveringen werden gedeeltelijk gefinancierd door de California Polytechnic State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Equipment | |||
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | may use other brands |
| Autoclave | Any | ||
| BHI powder | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | may use other brands |
| Blender | Any | to blend oyster meat | |
| CampyGen gas generator | Hardy Diagnostics | CN035A | to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands |
| Chocolate agar plates | Hardy Diagnostics | E14 | may use other brands |
| Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) | Any | or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014) | |
| Culture tubes | Fisher Scientific | S50712 | may use other brands |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | S348903 | may use other brands |
| Gel doc | Any | ||
| HardyChrom Vibrio agar plates | Hardy Diagnostics | G319 | This study evaluates this medium |
| Incubator | Any | ||
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-606 | 10 microliter-size was used in this study |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | may use other brands |
| Oysters | Any | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | may use other brands |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | may use other brands |
| Pipette and tips | Any | Sterilized tips | |
| Primers for tlh | IDT DNA | ||
| Scale | Any | ||
| Spreader | Fisher Scientific | 08-100-11 | Beads may be used instead |
| Stomacher blender | Stomacher | 400 | Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec. Other homogenizer can be used. |
| Sterile filter bags for blenders | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS powder | Hardy Diagnostics | 265020 | This study evaluates this medium |
| Thermocycler | Any | ||
| TSB powder | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | may use other brands |
| UV viewing cabinet | Any | Emit long-wave UV light | |
| Water bath | Any | |
|
| Name | Sources | Catalog Number | Comments |
| Bacterial species and strains | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| Escherichia coli | ATCC | ||
| Proteus mirabilis | ATCC | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| Shigella boydii | ATCC | ||
| Shigella flexneri | ATCC | ||
| Shigella sonnei | ATCC | ||
| Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) | FDA, ATCC | ||
| V. damsela | FDA | ||
| V. fisheri | Environment | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| V. furnissii | CDC | ||
| V. hollisae | FDA | ||
| V. metschnikovii | ATCC | ||
| V. mimicus | FDA | ||
| V. parahaemolyticus (serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc.) | ATCC, FDA, CDC, Environment | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| V. vulnificus | FDA |
References
- Yeung, P. S., Boor, K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).
- Yeung, P. S. M., Boor, K. J. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. Faruque, S. M. , Caister Academic Press. 153-184 (2012).
- Centers for Disease Control and Prevention. Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food - Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010. Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).
- Centers for Disease Control and Prevention. Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008. , Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591 (2008).
- Scallan, E., et al. Foodborne illness acquired in the United States - major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).
- Baross, J., Liston, J. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State. Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).
- Baross, J., Liston, J. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific. Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).
- Kueh, C. S., Chan, K. Y. Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster. J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).
- Food and Drug Administration. Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , Second Edition, (2012).
- Qadri, F., et al. Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus. J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).
- Food and Drug Administration. Quantitative risk assessment on the public health impact of Vibrio parahaemolyticus in raw oysters. , Available from: http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/ResearchAreas/RiskAssessmentSafetyAssessment/ucm050421.htm (2005).
- Food and Drug Administration. Bacteriological analytical manual online. , Available from: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070830.htm (2004).
- MacFaddin, J. F. Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, Williams & Wilkins. Baltimore, Md. (1985).
- Bottone, E. J., Robin, T. Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features. J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).
- Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms. Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).
- Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).
- Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).
- Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus. J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).
- Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).
- Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).
- Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish. J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).
- Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates. Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).
- Duan, J., Su, Y. -C. Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).
- Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus. Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).
- Canizalez-Roman, A., Flores-Villaseñor, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Leòn-Sicairos, N. Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples. Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).
- Kriem, M. R., et al. Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains. Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).
- Food Drug Administration. Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests. http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).
- Burd, E. M. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).
- World Organisation for Animal Health. Principles and methods of validation of diagnostic assays for infectious diseases. , Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/1.01.05_VALIDATION.pdf (2013).
