Abstract
Инфекций пищевого происхождения в США , вызванного вида Vibrio показали тенденцию к росту. В роду Vibrio, В. parahaemolyticus отвечает за большинство Vibrio -associated инфекций. Таким образом, четкое разграничение между Vibrio SPP. и обнаружение V. parahaemolyticus является критически важным для обеспечения безопасности наших продуктов питания. Хотя молекулярные методы являются более распространенными, культура, в зависимости от метода до сих пор обычно делается, и они считаются стандартными методами при определенных обстоятельствах. Следовательно, роман хромогенный агар был испытан с целью обеспечения лучшего способа выделения и дифференциации клинически значимых Vibrio SPP. Протокол по сравнению чувствительность, специфичность и предел обнаружения для обнаружения V. parahaemolyticus между новым хромогенного среды и обычной среды. Различные В. штаммы parahaemolyticus (п = 22) повторноиспользовались разнообразные представления серотипов и источник происхождения. Они ранее были идентифицированы с помощью пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC), и далее проверяется в нашей лаборатории TLH -PCR. По меньшей мере, четыре отдельных испытаний, эти штаммы высевали на чашках с хромогенных и тиосульфат-цитрат-солей желчных кислот с сахарозой (TCBS) агар, который является рекомендуемым среда для культивирования этого вида, с последующей инкубацией при 35-37 & deg; С в течение 24 -96 ч. Три В. parahaemolyticus штаммов (13,6%) не росли оптимально на TCBS, тем не менее , выставлены зеленые колонии , если был отмечен рост. Два штамма (9,1%) не дали ожидаемых голубых колоний на хромогенного агара. Non- В. parahaemolyticus штаммы (n = 32) были также испытаны для определения специфичности хромогенного агара. Среди этих штаммов, 31 не росли или выставлены другие колонии морфологию. Среднее восстановление V. parahaemolyticus на chromogeНИК агар ~ 96,4% по сравнению с трипсином соевом агаре с добавлением 2% NaCl. В заключение отметим , что новый хромогенный агар является эффективным средством для обнаружения V. parahaemolyticus и дифференцировать его от других вибрионов.
Introduction
В качестве члена рода Vibrio, V. parahaemolyticus является грам-отрицательных, не спорообразующих, изогнутые, палочковидные бактерии. Он демонстрирует высокую подвижность в жидких и полутвердых сред. Большинство V. штаммы parahaemolyticus не являются патогенными для человека, но патогенные подтипы вызвали эпидемии и пандемии, следовательно , этот вид считается важным патогеном пищевого происхождения во многих странах 1,2. Частота Vibrio инфекции в США показал тенденцию к росту с 2000 года 3. Среди Vibrio SPP., V. parahaemolyticus является наиболее часто сообщалось видов , вызывающих заболевания в США 4,5. Другие клинически значимые виды включают V. alginolyticus, В. vulnificus, В. вибрион и т.д. Небольшой процент болезней вызывается несколькими видами одновременно.
В. parahaemolyticus является естественным яnhabitant морской воды и, следовательно, широко распространены в морских водах по всему миру, включая эстуарии. Вид был открыт в 1950 году после вспышки пищевого отравления в Японии. В США этот вид был впервые выделен в морской воде, донных отложений, а также ракообразные в регионе Пьюджет - Саунд 6,7. Фильтраторов в морских средах обитания, таких как двустворчатые моллюски, могут питать В. parahaemolyticus как часть своей природной флоры 8. Как таковой, В. parahaemolyticus инфекции у человека часто связаны с потреблением загрязненных морепродуктов, особенно сырые или моллюска. Менее распространенный маршрут входа происходит, когда открытая рана подвергается воздействию морской воды, что приводит к инфекции кожи. Большинство V. штаммы parahaemolyticus не вызывают болезни человека, однако некоторые подтипы укрывательство факторы вирулентности , такие как термостабильной прямой гемолизина (TDH) являются патогенными. Наиболее распространенные симптомы пищевого происхождения V. parahaemolyticus инфекциейпонос и боли в животе, затем тошнота, рвота и лихорадка. Головная боль и озноб также сообщается. Средний инкубационный период составляет 15 ч, но может быть до 96 часов после потребления достаточного количества патогенных штаммов 9. Болезнь длится от двух до трех дней. Симптомы гастроэнтерита , вызванные V. parahaemolyticus в значительной степени самоограничения и поэтому специальная обработка не требуется. Легкие случаи гастроэнтерита можно эффективно лечить с помощью оральной регидратации. Более тяжелые болезни можно лечить с помощью антибиотиков , таких как тетрациклин или ципрофлоксацина 10. Смертность составляет около 2% за исключением случаев гастроэнтерита, но может достигать 29% для тех, кто разрабатывает инфекции кровотока или сепсис. Любой человек , который потребляет морепродукты или имеет открытую рану воздействию морской воды находится под угрозой V. parahaemolyticus инфекция. Чем более тяжелая форма болезни, угрожающей жизни сепсиса, чаще встречается у субпопуляции с основного медицинского сотрудничестваnditions 11, которые включают в себя алкоголизм, заболевания печени, сахарный диабет, заболевания почек, злокачественные опухоли, а также другие условия , приводящие к ослаблению иммунного ответа. Примечательно, что эта группа лиц также подвергаются более высокому риску заражения для тяжелых заболеваний , вызванных V. vulnificus, которые могут быть найдены в естественной среде обитания , похожими на V. parahaemolyticus.
В. parahaemolyticus регулярно выделяли с использованием тиосульфата-цитрата солей желчных кислот с сахарозой (TCBS) агар в качестве селективного и дифференциальной среды. Обогащение в щелочной пептонной воде может предшествовать изоляции на TCBS агар. ФИКСИРОВАННЫЕ колонии на TCBS затем дополнительно протестированы в массиве биохимических тестов и / или молекулярных анализов, ориентированных на присутствие генов видоспецифичных. Основанные на ПЦР методы часто используются для подтверждения личности V. parahaemolyticus путем амплификации гена термолабильный гемолизина, TLH 12.
Независимо от того, чOICE методов подтверждения, важно иметь эффективную среду для выделения и дифференцироваться В. parahaemolyticus от других морских вибрионов в первую очередь. TCBS обычно была использована для дифференциации видов в пределах рода Vibrio в соответствии со своими способностями к ферментируют сахарозу 12. Положительная реакция брожения сопровождается изменением цвета индикатора рН Бромтимоловый синего. V. parahaemolyticus колонии довольно отличительные от TCBS, показывая синего до зеленого цвета. Тем не менее, эта среда не может легко отличить В. alginolyticus и В. вибрион. Сахароза сбраживающие видов Proteus может производить желтые колонии , напоминающие В. вибрион или V. alginolyticus 13. На первоначальном выделении на TCBS, V. parahaemolyticus также может быть ошибочно , как Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides и Pseudomonas SPP 14. Штаммы с задержкой FERM сахарозыентация могут быть спутаны с другими сахарозы неферментирующие Vibrio 13, которые включают в себя В. parahaemolyticus. TCBS оказался не чувствителен к кишечной палочки, Pseudomonas putrefaciens, среди других. Несколько других видов дают зеленого до серых колоний , которые потенциально путают с V. parahaemolyticus или V. vulnificus 15. В результате, желательно разработать альтернативный культуральных сред с лучшей чувствительностью и специфичностью по отношению к обнаружению и изоляции V. parahaemolyticus и других близких видов.
Несколько альтернативных СМИ были недавно разработаны. В дополнение к включению селективных агентов, наиболее включать хромогенных субстратов для дифференциации видов на основе их дифференциальных ферментной активности. Например, индоксил-β-глюкозид и индоксил-β-галактозид, использовались в качестве хромогенных субстратов для дифференциации V. пунктhaemolyticus колонии (которые появляются голубовато-зеленые) от тех , V. вибрион (фиолетовый) из - за их различной способностью производить бета-глюкозидазы и бета-галактозидазы 16. Различные составы хромогенного агара , разработанные несколько групп были оценены и были сообщены для выполнения сравнительно или лучше , чем TCBS 17,18,19. Преимущество использования хромогенного среды является то, что окраска окружающей среды минимальна, таким образом, облегчая выделение отдельных колоний. В данном исследовании мы оценивали способность вновь сформулированной хромогенного среды для обнаружения и изолирования V. вибрион, В. parahaemolyticus и В. vulnificus; с особым акцентом на его способности различать В. parahaemolyticus от других видов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Средства массовой информации и Культивирование штаммов микроорганизмов
Примечание: Используйте асептических методов во всех экспериментах. Использование стерильных материалов. Стерилизовать все контейнеры, инструменты и реагент перед использованием. Автоклав все материалы отходов перед их утилизацией, поскольку они считаются заразны. Автоклавы температура и время комбинация ≥121 ° С х ≥15 мин для всех следующих процедур.
- Для того, чтобы ~ 1-L трипсиновый соевый агар (ТСА), сначала добавляют 1 л деионизированной воды в 2-литровую колбу Эрленмейера, содержащую магнитную мешалку. Используйте колбу, которая по меньшей мере в два раза больше, чем конечный объем. Добавьте 30 г порошка трипсинизированном соевого бульона и 20 г агара гранул в колбу.
Примечание: Используйте 2% агара вместо 1,5% , чтобы ограничить роения некоторого Vibrio SPP.- Тщательно перемешать путем включения мешалки. При перемешивании, включите тепла до кипения смеси. Выньте колбу от нагревателя, как только смесь начинает кипеть. Неплотно покрытия йе колбу с оловянной фольгой. Лента фольгу, чтобы закрепить его в колбу перед тем автоклаве.
- Для того, чтобы триптические соевый бульон (TSB), опустить агар из рецепта в шаге 1.1.
Примечание: Может использовать бутылки вместо колбы Эрленмейера. - Для того, чтобы трипсинизированном соевый агар с добавлением 2% хлорида натрия или NaCl (ВСТ), добавляют 20 г NaCl в смеси до перемешивании и нагревании. Для того, чтобы трипсинового соевого бульона с добавлением 2% -ного NaCl (ВВО), опустить агар, добавляют 20 г NaCl в смеси до перемешивании и нагревании.
- Для того, чтобы сердце мозга для инфузии (BHI) агара, приостановить 37 г порошка BHI и 15 г гранул агара в 1 л очищенной воды. Нагреть при частом помешивании до растворения порошка. Автоклавы. Опустим агар сделать BHI бульон.
- Для того, чтобы сделать TCBS агар, приостановить 89 г порошка TCBS в 1 л очищенной воды. Нагреть при частом помешивании и кипятить в течение 1 мин до полного растворения порошка. Не автоклав.
- Для всех агаровых средах, охладить горячий агар 45-50 ° С в водяной бане. Устройте пустые чашки Петри в стопках пяти до шести пластин. Начиная с нижней части стопки, заливают расплавленный агар в каждую чашку Петри, чтобы достичь примерно наполовину. Закройте крышку пластины Петри после заливки. Дайте агара затвердевать, позволяя пластины сидеть при комнатной температуре.
- Используйте агаром на следующий день или после 12 часов. Храните неиспользованные пластины в холодильнике до двух недель. Перед использованием снимите пластины из холодильника и уравновешивают их при комнатной температуре в течение не менее 15 мин.
Примечание: Один-литровый агар составляет 45 ~ агар пластины. Дайте агаром, чтобы высушить в достаточной степени на день подготовки, и уравновешивают их до комнатной температуры после холодного хранения, чтобы эффективно уменьшить распространение колоний.
- Используйте агаром на следующий день или после 12 часов. Храните неиспользованные пластины в холодильнике до двух недель. Перед использованием снимите пластины из холодильника и уравновешивают их при комнатной температуре в течение не менее 15 мин.
- Получить шоколад и хромогенный агаром и уравновешивают их при комнатной температуре перед каждым экспериментом.
- Пересевают все 54 штаммов микробов , показанные в таблице 1 каждые несколько даYS.
- Используйте стерильную петлю инокул для передачи культуры из замороженного запаса или предыдущей партии на неселективных средах, таких как BHI, TSB / TSA или шоколадный агар. Grow галофильного Vibrio SPP. на ВВО / ВСТ.
- Для проверки чистоты культуры, полоса все штаммы в виде узора, который позволил бы для наблюдения изолированных колоний. Например, можно использовать шаблон полосатость трехфазную разбавить большое количество бактерий в меньшем количестве, в конечном счете, получают изолированные колонии.
- Инкубируйте пластины вверх-вниз при 35-37 ° С в течение до 48 часов. Для Campylobacter SPP., Инкубировать трубки или пластины в банку закрытой крышкой, содержащей газовый мешок для получения микроаэрофильный среды. Обратите внимание морфологии колоний после инкубации. Чистые культуры должны давать колонии, которые демонстрируют подобную морфологии колоний.
Примечание: Инкубируйте все пластины вверх-вниз, чтобы предотвратить конденсированные капельки воды, образующейся на нижней стороне крышки от падения на Colonies.
2. Виды Определение с помощью ПЦР
- Проведение TLH -PCR , чтобы подтвердить личность В. parahaemolyticus штаммы. С помощью праймеров TLH -F (5 'AAA GCG GAT ТАТ GCA GCA GAA CTG 3') и TLH -R (5 'GCT ACT TTC TAG САТ ТТТ СТС ТГК 3') для амплификации 450 п.н. фрагмент гена термолабильный гемолизина 20 ,
- Используйте стерильную петлю инокул передать несколько изолированных колоний каждого V. штамм parahaemolyticus от ВСТ до 5 мл ЦБС. Выдержите при 35-37 ° С в течение 16-24 ч.
- Центрифуга культуры при 14000 мкг в течение 1 мин. Удалить супернатант и промыть осадок дважды фосфатно-солевым буфером (PBS). Кипение суспензии в течение 3 мин с получением клеточного лизата.
Примечание: V. parahaemolyticus легко быть лизированы. Поэтому лизис реагент не требуется. Кроме того, можно использовать немного колонии непосредственно в качестве шаблона. - Выполните ПЦР в 25-мкл реакции Volume. Готовят реакционную смесь , содержащую конечную концентрацию 1х ПЦР - буфера, 1,5 мМ MgCl 2, 100 мкМ каждого дНТФ, 1 мкМ каждого праймера, 1 ед Taq - полимераза , и 1 мкл клеточного лизата. После предварительной инкубации при 94 ° С в течение 5 мин, бег 35 циклов амплификации 94 ° С в течение 30 сек, 58 ° C в течение 30 сек и при 72 ° С в течение 60 с 21.
- Нагрузка аликвоты 5-мкл ампликонов в 1,5% агарозном геле. Включите питание, чтобы начать электрофорез. Визуализируйте наличие или отсутствие ампликонов под действием УФ-освещении после окрашивания бромистым этидием.
3. Рост на селективной и дифференциальной медиа
- От двух до четырех дней до начала эксперимента, полоса все микробные штаммы , представленные в таблице 1 , на неселективный среде (ВСТ, BHI или шоколадный агар) для выделения колоний. Инкубируют планшеты при 35-37 ° С в течение 48 часов. Проверьте чистоту культур путем наблюдения морфологии колоний после инкубации, Чистые культуры должны давать колонии, которые демонстрируют подобную морфологии колоний.
- Передача нескольких изолированных колоний из шага 3.1 в 5 мл бульона. Инкубируйте пробирки при температуре 35-37 ° С в течение 16-24 ч.
Примечание: Используйте молодые колонии, которые менее чем за четыре дня назад, чтобы подготовить в течение ночи культуры во всех экспериментах. - Серия Петлю овернайт культур на селективной и дифференциальной средах (TCBS и хромогенного агара) для изоляции колонии. Инкубируйте пластины при 35-37 ° С в течение до 96 часов.
- Запишите общий рост всех штаммов, исследуя как плотность культуры на пластине и размер изолированных колоний. Записывают цвет колоний при температуре окружающей и / или УФ-излучения. Обратите внимание, другие характеристики изолированной колонии, такие как возвышение, края и формы.
4. Восстановление анализа
- Выберите репрезентативную подмножество V. штаммы parahaemolyticus (п = 14) , которые охватывают различные серотипы и происхождение изоляции
- Проведение стандартного метода Plate Count из ночных культур, как описано ниже.
- Vortex смешивать в течение ночи культуры хорошо. Выполнить 10 раз или 10 -1 разведение путем переноса 100 мкл ночной культуры в пробирку , содержащую 900 мкл PBS. Vortex хорошо перемешать.
- Используйте новый наконечник пипетки для передачи по 100 мкл из 10 -1 разбавления трубы в другую пробирку , содержащую 900 мкл PBS. Vortex хорошо перемешать. Это составляет 10 -2 разбавления. Повторите этот процесс последовательно , чтобы получить 10 -7 разведения.
- Используя 10 -4 до 10 -7 разведения пробирки, пластина 100 мкл каждого на хромогенных, TCBS и ВСТ чашки с агаром.
Примечание: Коэффициент разбавления (DF) на пластинке будет 10 -5 до 10 -8, соответственно. - Распределите аликвоты равномерно по тон поверхность агара.
Примечание: Это прекрасно , чтобы использовать один и тот же шпатель на штамм на той же среде, до тех пор , как наиболее разбавленный аликвоты распространяется в первую очередь (то есть, от 10 -8 до 10 -5). Не используйте один и тот же шпатель для различных сред. - Инкубируйте пластины при 35-37 ° С в течение до 96 часов. Граф колоний на пластинах. Игнорируйте пластины, несущие колонии, которые слишком много, чтобы считать (tntc) или меньше 25. Вычислить КОЕ / мл в соответствии со следующим:
где
N = число клеток в неразбавленном трубки, выраженное в КОЕ / мл или КОЕ / г
C = общее количество колоний , подсчитанных на пластинах , которые несут 25-300 колонии
N 1 = количество пластины (ов) , где подсчитаны колонии из нижней ДФ
N 2 = количество пластины (ов) , где подсчитаны колонии с последующим 10-кратного разведения
dF = коэффициент разбавления ниже (т.е. более концентрированным разведение)
- Сравнение КОЕ / мл среди различных средств массовой информации. Используйте КОЕ / мл на ВСТ как 100%, вычислите восстановление V.% parahaemolyticus вырос на хромогенного и TCBS агар.
- Проведение стандартного метода Plate Count из ночных культур, как описано ниже.
5. Конкурс Анализ
- Выберите подмножество штаммов, которые показывают различные морфологии колонии на хромогенных и TCBS агар.
Примечание: Таким образом, можно будет считать колоний возникла из V. parahaemolyticus только, несмотря на наличие других видов в посевного материала .- Выберите V. штамм parahaemolyticus , что дает ожидаемые бирюзовые и голубые цвета колоний на TCBS и хромогенного агара, соответственно.
- Выберите не- V. parahaemolyticus и еще не- видов Vibrio , которые не растут на любой из этих сред, или проявляют различные цвета колонии.
Примечание: Например, В. metschnikovii растет очень слабо оN TCBS и не растут на хромогенного агара. шигеллы Зонне не растут на TCBS но дает фуксина колонии на хромогенного агара.
- После выбора указанных выше штаммов, готовят в течение ночи культуры бульона с использованием выделенных колоний, выросших на неселективных средах.
- Сделать ночные культуры В. parahaemolyticus и В. metschnikovii путем переноса нескольких изолированных колоний от ВСТ до 5 мл ЦБС. Выдержите при 35-37 ° С в течение 16-24 ч.
- Сделать ночные культуры Shigella Зонне путем переноса нескольких изолированных колоний от BHI агаром до 5 мл BHI бульона. Выдержите при 35-37 ° С в течение 16-24 ч.
- Для каждого штамма, выполнить ряд разбавления аналогичны шагам 4.2.1 и 4.2.2. Пластинчатые соответствующие разбавлени в отношении ВСТ или BHI для определения КОЕ / мл ночной культуры, используя уравнение, показанное на шаге 4.2.5.
Примечание: Как правило, 100 мкл от 10 -5 до 10 -7 разбавленияПробирки работает для большинства культур. Используйте значения КОЕ / мл для резервного вычислить точное количество клеток, используемых в следующей стадии. Рассчитанные значения КОЕ / мл получают после инкубации, хотя следующие шаги выполняются в тот же день, как на стадии 5.3. - Использование ночных культур и разведения труб с шагом 5.2 и 5.3, смешивать различные количеств V. штамм parahaemolyticus и не- В. видов parahaemolyticus. Например, смешать 500 мкл 10 -5 разбавления трубки V. parahaemolyticus 500 мкл ночных культур V. metschnikovii.
Примечание: Эта смесь имитирует высокий фон микрофлору. Для имитации низкого фона микрофлору, смешать 500 мкл каждого из 10 -5 разбавления трубки от обоих видов. - Спред 100 мкл смеси каждый на хромогенных, TCBS и ВСТ чашки с агаром.
- После инкубации при 35-37 ° С в течение до 96 часов, подсчет колоний V. parahaemolyticus и не- В. виды parahaemolyticus на основе разницы в их роста и морфологии колоний на хромогенных и TCBS агар.
Примечание: Например, если не- В. виды parahaemolyticus не растут на хромогенного и TCBS агар, все колонии будут иметь V. parahaemolyticus. Если не- V. видов parahaemolyticus растет на обеих средах, только бирюзовые колонии на TCBS и бирюзового колоний на хромогенного агара будет иметь V. parahaemolyticus. Непостоянство В. виды parahaemolyticus могут или не могут проявлять подобную морфологии колонии V. parahaemolyticus на ВСТ.- Если не- V. видов parahaemolyticus растет подобно V. parahaemolyticus на этой неселективного среде, делят количество колоний на два , чтобы получить номера для V. parahaemolyticus только. Сравните фактическое количество колоний с ожидаемым подсчета полученного на стадии 5.3.
6. EffЕКТС устричных гомогенатах
- Взвесьте ≥50 г устриц мясо от ≥12 моллюсков моллюсков в том числе мяса и спиртных напитков.
- Добавить равное количество PBS к мясу устриц и ликеров. Смешайте смесь на высокой скорости в течение 90 сек. Это составляет 2 -1 разбавленный устрицы гомогената.
- Добавьте 100 г 2 -1 разбавленного устрицы гомогената до 400 г PBS. Используйте шкалу для измерения веса, а не объем. Смешать смесь при высокой скорости в течение 1 мин. Автоклава устрицы гомогената.
Примечание: Это будет устрицы гомогенат используется для брать на острие.
- Повторите анализ восстановления (этап 4) в присутствии устрицы гомогената.
- После того , как 500 г устриц гомогенат остывает, добавьте 100 мкл V. parahaemolyticus ночных культур , выращенных в ЦБС к нему. Определить фактическую величину V. parahaemolyticus клетки в прививочного путем проведения стандартных процедур подсчета табличке , описанной в пункте 4.2.
- репссъесть Конкурентный анализ (шаг 5) в присутствии устрицы гомогената.
- После того , как 500 г устриц гомогенат остывает, добавьте 100 мкл каждого из ночных культур V. parahaemolyticus и не- В. parahaemolyticus к нему. Определить фактическое количество бактериальных Клетки в прививочного материала путем проведения стандартных процедур счетной пластинке описано в шаге 4.2
- Смешайте бактериальные клетки с устриц гомогената хорошо с использованием гомогенизатора.
Примечание: После смешивания, устрица гомогенат, содержащий специально добавленных клеток, называется шипами устричные гомогената. - Сделать разведений зубчатым устрицы гомогената , чтобы получить 10 -1 до 10 -3 разведений трубки в соответствии с процедурами , описанными в пункте 4.2.2. Спред по 100 мкл каждого разведения на хромогенного, TCBS и TSAs агар. Инкубируйте пластины при 35-37 ° С в течение до 96 часов.
- Сравните фактическое количество колоний на хромогенных и TCBS агар с эксожидаемому количество колоний выведено из шагов 6.2.1 и 6.3.1.
Примечание: Например, если труба из V. parahaemolyticus Ночную культуру содержит 10 8 КОЕ / мл, инокулят 100 мкл означает , что 10 7 клеток добавляют к 500-г устричных гомогената, получая 5 х 10 4 клеток / г. После разбавления и покрытия, пластины , имеющие DF = 10 -2 должен давать 500 колоний; в то время , что, ФР = 10 -3 должно дать 50 колоний. Таковы ожидаемые подсчет колоний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом исследовании 54 штаммы микроорганизмов были собраны, которые включали 22 штаммов в V. виды parahaemolyticus, 19 других видов вибрион, а также 13 видов не- вибриона (таблица 1). Большинство V. штаммы parahaemolyticus либо были получены от FDA, CDC или других государственных департаментов здравоохранения. Они представляют собой различные серотипы и источники изоляции. Эти штаммы были ранее определены регулирующими органами. Кроме того , мы подтвердили тождества этих V. parahaemolyticus путем проведения TLH -PCR 21,22.
| вид | Количество штаммов | Рост и цвет колоний | |
| TCBS | Сhromogenic среда | ||
| Aeromonas hydrophila | 2 | Нет роста | 1 не напрягать никакого роста; |
| 1 штамм лилового цвета | |||
| грибковые микроорганизмы албиканс | 1 | Слабый рост, желтый | Нет роста |
| Campylobacter jejuni | 1 | Нет роста | Нет роста |
| кишечная палочка | 1 | Нет роста | Слабый рост, пурпурного |
| Proteus Mirabilis | 1 | Нет роста | Нет роста |
| синегнойной | 2 | Бирюзовый | желтый |
| золотистый стафилококк | 1 | Слабый рост, желтый | Нет роста |
| Salmonella choleraesuявляется | 1 | Нет роста | Нет роста |
| Shigella boydii | 1 | Нет роста | Нет роста |
| шигеллы Флекснера | 1 | Нет роста | Нет роста |
| шигеллы Зонне | 1 | Нет роста | Слабый рост, пурпурного |
| Vibrio alginolyticus | 3 | Желтый или бирюзовый | желтый |
| В. вибрион | 4 | Желтый или бирюзовый | фуксин |
| В. damsela | 1 | Бирюзовый | кобальт |
| В. fisheri | 1 | Слабый рост, желтый | Нет роста |
| V. fluvialis | 1 | Бирюзовый | кобальт |
| V.furnissii | 1 | желтый | желтый |
| В. hollisae | 1 | Бирюзовый | желтый |
| В. metschnikovii | 1 | Нет роста | Нет роста |
| V. mimicus | 1 | Бирюзовый | фуксин |
| В. parahaemolyticus | 22 | Большинство штаммов бирюзовый | Большинство штаммов Бирюзовые; мало кто ясно |
| В. proteolyticus | 1 | Бирюзовый | кобальт |
| В. vulnificus | 4 | Бирюзовый или ясно | фуксин |
Таблица 1. Микробиологические виды , используемые в данном исследовании , и их характеристики роста на селективном и дифференциальном средах. Цвет вызывающий был баСЭД на цветном колесе. Cyan похож на чирок; пурпурного похож на розоватого лаванды, бирюзовый похож на зеленый, желтый охватывает оливкового и коричневого.
Четыре отдельных испытаний были проведены для определения роста и колоний Морфология этих штаммов на селективном и дифференциальном медиа - TCBS и хромогенного агара. TCBS является обычная среда используется для выделения некоторых видов Vibrio, в том числе В. вибрион и В. parahaemolyticus 12. Цветовые вариации колоний , выращенных на TCBS был желтый, бирюзовый (зеленый) или ясно (рисунок 1).
Рисунок 1. Колония морфология Vibrio SPP. на TCBS агар. V. parahaemolyticus (бирюзовый), В. вибрион (желтый), и утра ixed прививка двух видов (а). Колонии V. parahaemolyticus появляются бирюзовый, с круглым, целых и выпуклой морфологии (б). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Тестировалась Способность нового хромогенного среды для выбора для клинически значимых видов Vibrio от пищевых продуктов и проб окружающей среды. Кроме того, оценивали способность этой среды одновременно различать эти виды друг от друга. Колония цвет наблюдается на хромогенного агара кобальт, голубой, пурпурный, желтый или прозрачный (рисунок 2). Как показано в таблице 1, как TCBS и хромогенный агар выставлены определенные степени селективности в отношении микроорганизмов , не являющихся вибриона.
1 ">
Рисунок 2. Colony морфология Vibrio SPP. на недавно разработанной хромогенного агара. V. parahaemolyticus (Cyan), В. вибрион (пурпурного) и смешанный прививка из двух видов (а). Колонии V. parahaemolyticus появляются голубые, с круглым, целых и выпуклой морфологии (б). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Следуя стандартной метод Plate Count на ночных культур, колонии V. parahaemolyticus наблюдались на хромогенных агаровых пластинах , получающих самый высокий коэффициент разбавления (т.е. DF = 10 -8). Эти результаты были сопоставимы с таковыми на неселективной среде (ВСТ). Это говорит о том, что предел обнаружения хромогенного среды подобна неселективных средах, что примерно на 10 ячеек или ниже, при отсутствии пищевой матрицы. Способность обнаружения для других видов Vibrio , таких как В. alginolyticus, В. fluvialis и В. Девица была также приличная по сравнению с неселективной средой. Тем не менее, некоторые штаммы V. вибрион, В. vulnificus и В. mimicus дали от 10 до 100 раз меньше КОЕ на хромогенного агара. Селективные агенты, используемые в хромогенных или других селективных средах неизбежно подавляют некоторые клетки. Поврежденными клетками, например, не может восстановить в селективной среде. Тем не менее, несколько хуже способность обнаружения не является проблемой в большинстве стандартных процедур, которые используют стадию обогащения. Небольшое количество микроорганизмов в пищевом продукте или окружающей среды образца будет умножать на высокий уровень в бульоне обогащения, превосходящие предел обнаружения. Обогащение в щелочной пептонной воде ofteп сделано для определения распространенности видов Vibrio в пробах окружающей среды 12.
При наличии устрицы гомогената, хромогенного агара продолжал показывать хорошую степень восстановления. Другими словами, большая часть (> 70%) из V. parahaemolyticus клетки были способны расти на хромогенного агара, не зависит от наличия устрица матрицы (рисунок 3а). Рост и восстановление V. parahaemolyticus клетки также не зависит от присутствия другого вида Vibrio (рис 3b). Это очень важный признак , так как отбор проб окружающей среды обязаны содержать различные виды Vibrio, которая находятся в большом количестве, особенно после процедуры по обогащению урана.
Рисунок 3. Процент восстановления в V. штамм parahaemolyticus в устричном гомогената с и без бактериального конкурента. Восстановление (среднее ± стандартное отклонение) рассчитывали в соответствии с наблюдаемым против ожидаемого КОЕ рассчитывать на агара. Ожидаемый КОЕ подсчет был рассчитан на основе бактериальной нагрузки в прививочного материала. Высокое восстановление в V. parahaemolyticus штамма наблюдалась на всех средах без конкуренции (а). Подобный уровень восстановления наблюдался , когда высокие уровни V. metschnikovii клетки присутствовал (б). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Для дальнейшего сравнения пигментной и TCBS агар, вычислялись чувствительность и специфичность. В таблице 2 показана способность этих средств массовой информации для Accuдельно определить V. parahaemolyticus. Чувствительность относится к проценту истинным положительным, что означает V. штаммы parahaemolyticus получали ожидаемый морфологии колоний на носителе. Специфичность связана с процентом истинного отрицательным, что означает не- В. штаммы parahaemolyticus должны проявлять бедных отсутствие роста или иной морфологии колоний , чем В. parahaemolyticus. Чувствительность и специфичность TCBS для идентификации V. parahaemolyticus были 86,4% и 71,8%, соответственно. Для сравнения, чувствительность и специфичность хромогенного среды были 90,9% и 96,9%, соответственно.
| а) | ||
| TCBS агар | В. parahaemolyticus | Non-V. parahaemolyticus |
| Хороший рост и бирюзовый сolonies | 19 | 9 |
| Слабый рост или не бирюзовые колонии | 3 | 23 |
| б) | ||
| Хромогенная агар | В. parahaemolyticus | Non-V. parahaemolyticus |
| Хороший рост и голубые колонии | 20 | 1 |
| Слабый рост или не голубые колонии | 2 | 31 |
Таблица 2. Чувствительность и специфичность TCBS (а) и хромогенного (б) агара в обнаружении V. parahaemolyticus. Идентичность V. parahaemolyticus были определены ранее биохимического теста и tlh- ПЦР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данном исследовании основное внимание уделяется разработке и оценке культуры средств массовой информации. Обычно TCBS является селективное и дифференциальная среда , используемая для выделения и обнаружения V. parahaemolyticus, В. вибрион и В. vulnificus 12. Тем не менее, ограничения были зарегистрированы в этой среде, такой как неспособность дифференцироваться В. вибрион от других видов Vibrio. Сахароза и показатель рН являются дифференцировка агентами TCBS. Таким образом, производство кислоты путем ферментер сахарозы приводит к изменению цвета среды. Окраска среды является недостатком TCBS, поскольку он может скрывать наблюдение морфологии колоний. Недавно разработанный хромогенная среда использует высокое значение рН и солености воды , чтобы подавить рост не- видов Vibrio , обнаруженных во многих морских образцов. Новая хромогенный среда имеет конечный рН 8,6 ± 0,2. На литр деионизированной воды, она состоит из 10 г пептона, 10 г морской соли смеси, 10 г бычьей желчи, 10 г натриятиосульфат, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г цитрата натрия, 2,2 г карбоната натрия, 2 г лактозы, 0,5 г пирувата натрия, 0,3 г смеси хромогенных и 15 г агара. Хромогенная смесь позволяет дифференцировать между Vibrio SPP. в соответствии с их различной способностью производить определенные ферменты. Вместо того , чтобы изменять цвет агаровой среды TCBS, различные Vibrio SPP. будет демонстрировать различный цвет колонии на новой хромогенного среде. Для сравнения, коммерчески доступный хромогенный среда содержит 15 г агара, 8 г пептона и экстракта дрожжей, 51,4 г соли, 0,3 г хромогенного смеси и конечного рН 9,0 ± 0,2.
Надежность оценки анализа зависит от размера образца. Поскольку это исследование делает акцент на эффективности нового хромогенного среды для выделения и обнаружения V. parahaemolyticus, важно , чтобы накопить много разнообразных V. parahaemolyticus штаммы. Предыдущие исследования, сравнивающие и TCBSНовая культура средств массовой информации часто участвуют образцы окружающей среды или пищевые продукты , содержащие неизвестные типы и количество микроорганизмов 23,24,25,26. Несколько колоний на образце были выделены еще Клональная характер изолятов часто не определены. В идеале, различные штаммы должны быть испытаны в разработке анализа в противном случае точность анализа будет завышенным. Штамм идентичность может быть установлена с помощью традиционных методов , таких подтипов как гель - электрофорез в пульсирующем поле (PFGE) или полилокусной секвенирования. В. parahaemolyticus штаммы в данном исследовании ранее характеризовались риботипирование и PFGE 19.
В процессе разработки анализа, чувствительность, специфичность и предел обнаружения являются одними из ключевых факторов, которые будут исследованы. Чувствительность, также известный как точность или диагностической чувствительности, является положительным процент соглашение между эталонными и методы испытаний. Специфичность, также известный как точность или диагностической специфичности, является отрицательным процента в пылевом между опорным и методы испытаний. В этом исследовании мы использовали метод на основе ПЦР в качестве эталонного метода, потому что результаты были проверены среди различных групп. TCBS и хромогенные средства массовой информации были методы испытаний. Для определения чувствительности, результаты от V. были использованы штаммы parahaemolyticus, то есть чувствительность = 100% х Истинная Положительная / (True Позитивное + Ложноотрицательный). С другой стороны, результаты из непредставленных V. штаммы parahaemolyticus были использованы для определения специфичности; и, следовательно, Специфичность = 100% х Истинный Негативный / (True Negative + Ложные Положительный). Для того, чтобы обеспечить более надежные результаты специфичности, не- В. штаммы parahaemolyticus должны быть изолированы от окружающей среды , где будет проводиться отбор проб. Наши расчеты чувствительности и специфичности основаны на документах , написанных правительством 27, 28 академических и научных организаций 29 по теме , связанной с развитием анализа и проверки.
нт "> На основании полученных результатов, хромогенного среда показала лучшую производительность , чем TCBS в идентификации В. parahaemolyticus. Общий процент соглашения между методом эталонного и хромогенного среды ТАКОЕ 94,4%, по сравнению с 77,8% между методом эталонного и TCBS. чувствительность и специфичность хромогенного среды являются 90,9% и 96,9% соответственно, что больше , чем у TCBS (86,4% и 71,9%, соответственно). Предыдущие исследования , изучающие другие хромогенные средства массовой информации для обнаружения В. parahaemolyticus обнаружили , что чувствительность в диапазоне от 85 до 88% , тогда как специфичность колебалась от 94 до 95% 23,24,25. Однако эти исследования не использовали один и тот же метод расчета , как нашего исследования. Кроме того, они иногда использовали другой эталонный метод или они объединили результаты биохимических анализирует и хромогенный среду в качестве метода один тест. в результате, трудно непосредственно сравнивать наши результаты с этими предыдущих исследований.V. parahaemolyticus, хромогенного агар , используемый в этом исследовании , может также дифференцировать больше видов Vibrio чем TCBS вследствие включения хромогенного смеси в средней формуле, получая несколько цветов. Хотя это не было в центре внимания данного исследования для выявления V. вибрион и В. vulnificus, стоит отметить , что пурпурные колонии , проявляемые этих видов могут быть дополнительно дифференцированы по флуоресценции в УФ. Ограничением для использования пигментной агар для обнаружения V. вибрион и В. vulnificus является очевидным низкое восстановление этих видов. Чтобы обойти эту проблему, необходимо включить стадию обогащения. Другим возможным ограничением хромогенного агара является его короче срок хранения, чем TCBS. Постоянная оптимизация этой новой среды требуется для поддержания рН во время хранения.
Несмотря на популярность молекулярных методов, Культура, в зависимости от методов все еще ценны, поскольку они часто являются менее дорогостоящими и имеют лучший предел обнаружения. Эти культуральные методы могут быть использованы в качестве скринингового инструмента. С другой стороны, они могут быть использованы для подтверждения идентичности и жизнеспособности микроорганизмов следующих молекулярного анализа. Чтобы перечислить бактерии с помощью подхода культуры-зависимости, Standard Plate Count признан в качестве стандартного метода. Уравнение показано на шаге 4.2.5 является более точным способом определения КОЕ / г или КОЕ / мл, чем в среднем КОЕ от различных факторов разбавления. Важно отметить , что все разбавителей и средств массовой информации во всех процедурах должен содержать достаточное количество соли для поддержания жизнеспособности галофильными бактерий , таких , как В. parahaemolyticus. Температура инкубации и окружающая среда должна быть оптимальной для роста бактерий.
Хромогенная среда предназначена для обнаружения видов Vibrio , которые являются важными патогенами человека. Поэтому дальнейшие исследования должны быть проведены для установпе его эффективность для обнаружения других видов экологических Vibrio, которые не с медицинской точки зрения актуальной. В будущих приложениях, новый хромогенный агар может быть включена в стандартное испытание проб окружающей среды на V. parahaemolyticus. Это может быть сделано путем прямого исчерчивать образцов на хромогенный агар для обнаружения наличия презумптивного V. parahaemolyticus. Хромогенная агар также может быть использован для перечисления V. parahaemolyticus следующие разведений. Количественное также может быть оценена путем осуществления способа Наиболее вероятное число с помощью обогащения бульона, а затем полосатость на хромогенного агара для подтверждения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим М. Channey, Э. Чау, К. Томас за их помощь по проекту. Поставленный по проекту были частично финансировалась Политехнический университет штата Калифорния.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Equipment | |||
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | may use other brands |
| Autoclave | Any | ||
| BHI powder | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | may use other brands |
| Blender | Any | to blend oyster meat | |
| CampyGen gas generator | Hardy Diagnostics | CN035A | to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands |
| Chocolate agar plates | Hardy Diagnostics | E14 | may use other brands |
| Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) | Any | or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014) | |
| Culture tubes | Fisher Scientific | S50712 | may use other brands |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | S348903 | may use other brands |
| Gel doc | Any | ||
| HardyChrom Vibrio agar plates | Hardy Diagnostics | G319 | This study evaluates this medium |
| Incubator | Any | ||
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-606 | 10 microliter-size was used in this study |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | may use other brands |
| Oysters | Any | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | may use other brands |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | may use other brands |
| Pipette and tips | Any | Sterilized tips | |
| Primers for tlh | IDT DNA | ||
| Scale | Any | ||
| Spreader | Fisher Scientific | 08-100-11 | Beads may be used instead |
| Stomacher blender | Stomacher | 400 | Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec. Other homogenizer can be used. |
| Sterile filter bags for blenders | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS powder | Hardy Diagnostics | 265020 | This study evaluates this medium |
| Thermocycler | Any | ||
| TSB powder | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | may use other brands |
| UV viewing cabinet | Any | Emit long-wave UV light | |
| Water bath | Any | |
|
| Name | Sources | Catalog Number | Comments |
| Bacterial species and strains | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| Escherichia coli | ATCC | ||
| Proteus mirabilis | ATCC | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| Shigella boydii | ATCC | ||
| Shigella flexneri | ATCC | ||
| Shigella sonnei | ATCC | ||
| Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) | FDA, ATCC | ||
| V. damsela | FDA | ||
| V. fisheri | Environment | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| V. furnissii | CDC | ||
| V. hollisae | FDA | ||
| V. metschnikovii | ATCC | ||
| V. mimicus | FDA | ||
| V. parahaemolyticus (serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc.) | ATCC, FDA, CDC, Environment | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| V. vulnificus | FDA |
References
- Yeung, P. S., Boor, K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).
- Yeung, P. S. M., Boor, K. J. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. Faruque, S. M. , Caister Academic Press. 153-184 (2012).
- Centers for Disease Control and Prevention. Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food - Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010. Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).
- Centers for Disease Control and Prevention. Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008. , Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591 (2008).
- Scallan, E., et al. Foodborne illness acquired in the United States - major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).
- Baross, J., Liston, J. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State. Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).
- Baross, J., Liston, J. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific. Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).
- Kueh, C. S., Chan, K. Y. Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster. J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).
- Food and Drug Administration. Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , Second Edition, (2012).
- Qadri, F., et al. Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus. J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).
- Food and Drug Administration. Quantitative risk assessment on the public health impact of Vibrio parahaemolyticus in raw oysters. , Available from: http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/ResearchAreas/RiskAssessmentSafetyAssessment/ucm050421.htm (2005).
- Food and Drug Administration. Bacteriological analytical manual online. , Available from: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070830.htm (2004).
- MacFaddin, J. F. Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, Williams & Wilkins. Baltimore, Md. (1985).
- Bottone, E. J., Robin, T. Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features. J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).
- Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms. Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).
- Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).
- Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).
- Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus. J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).
- Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).
- Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).
- Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish. J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).
- Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates. Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).
- Duan, J., Su, Y. -C. Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).
- Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus. Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).
- Canizalez-Roman, A., Flores-Villaseñor, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Leòn-Sicairos, N. Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples. Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).
- Kriem, M. R., et al. Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains. Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).
- Food Drug Administration. Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests. http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).
- Burd, E. M. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).
- World Organisation for Animal Health. Principles and methods of validation of diagnostic assays for infectious diseases. , Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/1.01.05_VALIDATION.pdf (2013).
