Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.
In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.
De flesta djur är starkt beroende av deras kemiska sinnen för att interagera med sin omgivning. Luktsinnet spelar en viktig roll för att hitta och utvärdera mat, undvika rovdjur och lokalisera lämpliga parningspartner. I de flesta däggdjur, består luktsystemet minst fyra anatomiskt och funktionellt distinkta perifera delsystem: huvud luktepitel 1,2, den Grueneberg ganglion 3,4, den septal organ Masera 5,6 och Vomeronasalorganet. VNO omfattar perifer sensorisk struktur tillbehöret luktsinne (AOS), som spelar en viktig roll i att upptäcka kemiska signaler som förmedlar information om identitet, kön, social rang och sexuell tillstånd 7-10. VNO är belägen vid basen av nässkiljeväggen precis ovanför gommen. I möss, är det en bilateral blinda sinande röret inneslutna i en brosk kapsel 11-13. Orgeln består av både en halvmåneformad medial sensorisk epitheLium som hyser de VSNs och är av icke-sensoriska delen på den laterala sidan. Mellan de båda epitel ligger en slemfyllda hålrum som är ansluten till näshålan via den smala vomeronasala kanalen 14. En stor lateral blodkärl i den icke-sensoriska vävnad ger en kärlpumpmekanism för att underlätta inträde av relativt stora, mestadels icke-flyktiga molekyler såsom peptider eller små proteiner i VNO lumen genom undertryck 15,16. De strukturella komponenterna i VNO är närvarande vid födseln och orgeln når vuxen storlek strax före puberteten 17. Men om gnagare AOS är redan funktionell i ungdomar är fortfarande föremål för debatt 18-20.
VSNs särskiljs genom både deras epitelial läge och den typ av receptor de uttrycker. VSNs visar en bipolär morfologi med en omyeliniserad axon och ett enda apikala dendrit som skjuter ut i riktning mot lumen och slutar i en microvillous dendritisk knopp. VSN axeons fasciculate att bilda vomeronasala nerv som lämnar brosk kapsel vid dorso-kaudala ände, stiger längs membranet, passerar cribrosa plattan och projekt till tillbehöret luktbulben (AOB) 21,22. Vomeronasala sensoriska epitel består av två skikt: den apikala lagret ligger närmare luminala sidan och hamnar både V1R- och alla utom en typ av FPR-rs-uttryckande nervceller. Dessa nervceller samtidigt uttrycka G-protein α-subenhet G αi2 och projekt till den främre delen av AOB 23-25. Sensoriska neuroner belägna i mer basal lager express V2Rs eller FPR-RS1 tillsammans G αo och skicka sina axoner till den bakre regionen av AOB 26-28.
Vomeronasala nervceller är sannolikt aktiveras av ganska små semiochemicals 29-33 (V1Rs) eller proteinartade föreningar 34-38 (V2Rs) som utsöndras i olika kroppsvätskor såsom urin, saliv och tårvätska 37,39-41 </sup>. In situ experiment har visat att VSNs också aktiveras genom formyleras peptider och olika antimikrobiella / inflammation bundna föreningarna 25,42. Dessutom heterologt uttryckt FPR-rs proteiner delar agonist spektra med FPRs uttrycks i immunsystemet, vilket tyder på en potentiell roll som detektorer för sjukdom i artfränder eller förstörda matkällor 25 (se referens 43).
Grundläggande för att förstå receptor-ligand relationer och nedströms signaleringskaskader i specifika VSN populationer är en detaljerad utvärdering av deras grundläggande biofysikaliska egenskaper i en infödd miljö. I det förflutna, har analysen av cellulära signalerings kraftigt dragit nytta av genetiskt modifierade djur som markerar en definierad population av nervceller genom samuttrycker en fluorescerande markörprotein 30,44-49. I detta protokoll, en transgen mus linje som uttrycker FPR-RS3 tillsammans med en fluorescerande markör (Fpr-RS3-i-Venus) används.Detta tillvägagångssätt exemplifierar hur man använder en sådan genetiskt modifierad musstam för att utföra elektrofysiologiska analys av ett optiskt identifierbar cellpopulation med hjälp av enda neuron patch-clamp inspelningar i akut koronala VNO vävnadssnitt. En tryckluftsdriven flera fat perfusion system för sensoriska stimuli och farmakologiska medel ger snabb, reversibel och fokal neuronal stimulering eller hämning under inspelningar. Helcells-inspelningar i slice förberedelser möjliggör en detaljerad analys av inneboende egenskaper, spänningsaktiverade conductances, liksom handlings potentiella mönster urladdnings i cellens naturliga miljö.
VNO är en chemosensory struktur som detekterar semiochemicals. Hittills förblir huvuddelen av vomeronasala receptorer som skall deorphanized eftersom endast några receptor-ligand par har identifierats. Bland dem var V1rb2 beskrivits specifikt aktiveras av manliga urin feromon 2-heptanon 30 till V2rp5 aktiveras av manliga specifika feromon ESP1 57 samt V2r1b och V2rf2 att aktiveras av MHC peptiderna SYFPEITHI 48 och SEIDLILGY 58, respektive. En förutsättning för att förs…
The authors have nothing to disclose.
We thank Ivan Rodriguez and Benoit von der Weid for generating the FPR-rs3-i-venus mouse line, their constructive criticism and fruitful discussions. This work was funded by grants of the Volkswagen Foundation (I/83533), the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) and by the Excellence Initiative of the German federal and state governments. MS is a Lichtenberg Professor of the Volkswagen Foundation.
Chemicals | |||
Agarose (low-gelling temperature) | PeqLab | 35-2030 | |
ATP (Mg-ATP) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES) | Sigma-Aldrich | B9879 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
GTP (Na-GTP) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 03564 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Surgical tools and consumables | |||
Large petri dish, 90 mm | VWR | decapitation, dissection of VNO capsule | |
Small petri dish, 35 mm | VWR | lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose | |
Sharp large surgical scissor | Fine Science Tools | decapitation, removal of lower jaw | |
Strong bone scissors | Fine Science Tools | cutting incisors | |
Medium forceps, Dumont tweezers #2 | Fine Science Tools | removing skin and palate | |
Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades | Fine Science Tools | cutting out VNO | |
Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5 | Fine Science Tools | dissecting VNO out of cartilaginous capsule | |
Small stainless steel spatula | Fine Science Tools | handling agarose block and tissue slices | |
Surgical scalpel | cutting agarose block into pyramidal shape | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Amplifier | HEKA Elektronik | EPC-10 | |
Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID) | Science Products | ||
CCD-camera | Leica Microsystems | DFC360FX | |
Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515 | Leica Microsystems | I3 | |
Fluorescence lamp | Leica Microsystems | EL6000 | |
Hot plate magnetic stirrer | Snijders | 34532 | |
Microforge | Narishige | MF-830 | |
Micromanipulator Device | Luigs & Neumann | SM-5 | |
Micropipette puller, vertical two-step | Narishige | PC-10 | |
Microscope | Leica Microsystems | CSM DM 6000 SP5 | |
Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug) | Quest Scientific | ||
Objective | Leica Microsystems | HCX APO L20x/1.00 W | |
Oscilloscope | Tektronik | TDS 1001B | |
Osmometer | Gonotec | Osmomat 030 | |
Perfusion system 8-in-1 | AutoMate Scientific | ||
pH Meter five easy | Mettler Toledo | ||
Pipette storage jar | World Precision Instruments | e212 | |
Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
Razor blades | Wilkinson Sword GmbH | Wilkinson Sword Classic | |
Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are e.g. BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments) | custom-made | ||
Stereo microscope | Leica Microsystems | S4E | |
Trigger interface | HEKA Elektronik | TIB-14 S | |
Vibratome | Leica Microsystems | VT 1000 S | |
Water bath | Memmert | WNB 45 |