Доставка нуклеиновых кислот через Эмбрион микроинъекции в во всем мире насекомых-вредителей сельского хозяйства,<em> Ceratitis capitata</em
Summary
The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.
Abstract
Средиземноморская плодовая муха (Medfly) Ceratitis capitata (Видеман) (Diptera: Tephritidae) является видов вредителей с чрезвычайно высокой сельскохозяйственной значимости. Это связано с его репродуктивном поведении: женщины повредить внешнюю поверхность фруктов и овощей, когда они откладывают яйца и вылупившихся личинки питаются их мякотью. Дикий С. популяции capitata традиционно контролируется с помощью распыления инсектицидов и / или экологически чистые подходы, наиболее успешным является стерильных насекомых (МСН). SIT полагается на массового разведения, радиационной стерилизации на основе и выпуска поля самцов, которые сохраняют свою способность к спариванию, но не в состоянии генерировать плодородную потомство. Появление и последующее быстрое развитие биотехнологических инструментов, вместе с доступностью Medfly последовательности генома, значительно повысили наше понимание биологии этого вида. Это способствовало распространению новых стратегий для манипулирования генома, что сап применяться для контроля населения.
В этом контексте, эмбрион микроинъекции играет двойную роль в расширении набора инструментальных средств для Medfly контроля. Способность влиять на функции генов, которые регулируют основные биологические процессы, действительно, расширяет наше понимание молекулярных механизмов, лежащей в основе Medfly инвазивность. Кроме того, способность достичь трансформации зародышевой линии облегчает получение нескольких трансгенных линий, которые могут быть проверены для будущих приложений на местах в новых установках SIT. Действительно, генетические манипуляции могут быть использованы для придания желательных качеств, которые могут, например, использоваться для мониторинга стерильную производительности мужчин в этой области, или, что может привести к ранней стадии жизни летальности. Здесь мы опишем метод microinject нуклеиновых кислот в Medfly эмбрионов для достижения этих двух основных целей.
Introduction
Средиземноморская плодовая муха (Medfly) Ceratitis capitata является космополитическим видов , которые экстенсивно повреждает плоды и пропашных культур. Она принадлежит к семейству Tephritidae, которая включает в себя несколько видов вредителей, таких как те , которые принадлежат к роду Bactrocera и Anastrepha. Medfly является наиболее изученным видов этого семейства, и он стал образцом не только для изучения нашествий насекомых – 1, но и для оптимизации стратегии борьбы с вредителями 2.
Medfly является multivoltine видов , которые могут атаковать более 300 видов диких и культурных растений 3,4. Ущерб причинен как на взрослых, так и личиночных стадий: вязка самки прокалывают поверхность плодов для яйцекладки, позволяя микроорганизмов влиять на их товарное качество, в то время как личинки питаются на плодовой мякоти. После трех личиночной стадии, личинки выходят из хозяина и окукливаются в почве. Ceratitiscapitata отображает почти распространение во всем мире, в том числе Африки, Ближнего Востока, Западной Австралии, Центральной и Южной Америке, Европе и районах Соединенных Штатов 5.
Наиболее распространенные стратегии для ограничения Medfly инвазии предусматривают использование инсектицидов (например, малатион, Спинозад) и экологически чистых стерильных насекомых (SIT) 6. Последний подход предполагает выпуск в дикую природу сотен тысяч мужчин стерилизуют под воздействием ионизирующего излучения. Спаривание таких стерилизованных самцов диких самок приводит к отсутствию потомства, что приводит к уменьшению численности населения, в конечном итоге приводит к ликвидации. Хотя SIT доказала свою эффективность в нескольких кампаниях по всему миру, ее основные недостатки включают высокие затраты на выращивание и стерилизовать миллионы насекомых, которые будут освобождены. Маркировка освобожденных лиц необходимо отличать стерильными от диких насекомых, захваченных в поле во времямониторинг деятельности и в настоящее время достигается с использованием флуоресцентных порошков. Эти процедуры являются дорогостоящими и имеют нежелательные побочные эффекты 7.
В целях оптимизации и / или разработки более эффективных подходов к борьбе с этим вредителем, Medfly биология и генетика были широко изучены многочисленными исследователями по всему миру. Наличие Medfly последовательности генома 8,9, будет способствовать новые исследования по генных функций. РНК-интерференция является мощным инструментом для таких исследований, и это может быть достигнуто с помощью микроинъекции дцРНК (двухцепочечной РНК) или миРНК (малых интерферирующих РНК). Эта техника была использована, например, чтобы показать , что определение пола молекулярный каскад в C. capitata лишь частично сохраняется относительно у Drosophila 10.
Разработка протоколов к microinject Medfly эмбрионов позволили С. capitata , чтобы быть первым-Drosophilid Видов мух, чтобы быть генетически модифицированы. Как его яйца аналогичны таковым у Drosophila, как с точки зрения морфологии и устойчивости к высыханию 11, протокол для доставки плазмидной ДНК в предварительно бластодермой эмбрионов впервые разработаны для D. MELANOGASTER 12,13 первоначально был адаптирован для использования в C. capitata. Эти первые опыты позволила Medfly трансформации зародышевой линии , основанной на элементе Миноса транспозируемого 11. Впоследствии, исходная система была изменена 14 с использованием других подходов транспозона основе. Это случай PiggyBac от чешуекрылых Trichoplusia п 15. Протокол с тех пор был дополнительно оптимизирован , и это позволило преобразование других видов tephritid 16-21 , а также многих других двукрылых 22-31. Все эти системы основаны на использовании типичного бинарного вектора / хелперов системы трансформации плазмидами: искусственный, дефектного TRANSPOсыновья , содержащие желаемых генов собраны в плазмидной ДНК , и интегрированы в геном насекомого путем подачи транспозаза фермента 32. Ряд трансгенных Medfly линий были сформированы, с множеством функций, включая штаммы, несущие условный доминантный летальный ген, который вызывает летальность, штаммы, продуцирующие только для мужчин потомства и, таким образом, не требуя дополнительных стратегий Sexing, и штаммы с флуоресцентным спермы, что может повысить точность фазы мониторинга МСН 33-37. Хотя выпуск в дикой природе трансгенных организмов произошло в пилотных испытаниях против комаров только 38,39, по крайней мере , одна компания оценивает ряд трансгенных Medfly штаммов , используемых для их использования в полевых условиях 40.
Эмбрион микроинъекции может также способствовать развитию новых инструментов генома редактирования, такие как активатор транскрипции, как эффекторных нуклеаз (Таленс), сгруппированных регулярно interspaced короткие палиндромных повторами (CRИСПИ) / CRISPR белок, ассоциированный с 9 нуклеазы (cas9) и самонаведения эндонуклеаз генов (HEGs), что позволит новые эволюционные и развития исследований, а также расширение доступного биотехнологического набор инструментов. Геном редактирования подходов уже позволило поколение генно-приводных систем в комаров 41, и их передача в Medfly неизбежна. Здесь мы опишем универсальный протокол для microinjecting нуклеиновых кислот в Medfly эмбрионов, которые могут быть полезны для всех указанных выше применений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микроинъекция нуклеиновых кислот у эмбрионов насекомых является универсальным методом, который облегчает как анализ функции гена и биотехнических применений.
Недавней публикации геномных последовательностей из большего числа видов насекомых приводит к острой необх…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank all the members of the “Insect Genetics and Genomics” Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia “IMPROVE” (FS).
Materials
| 1 x injection Buffer | Buffer | 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5mM KCl | ||
| Construct Plasmid | DNA | |||
| Helper Plasmid | DNA | |||
| dsRNA | RNA | Phenol-Chloroform purified | ||
| Standard Larval food | Rearing Food | 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer’s yeast, 1 kg soft wheat bran | ||
| Carrot Larval Food | Rearing food | 2.5 g Agar, 4 g Sodium Benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1L | ||
| Adult Food | Rearing food | yeast extract and sugar (1:10) | ||
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | Z692247 | ||
| Injection needles | Eppendorf | 5242956000 | ||
| Microloaders | Eppendorf | 5242956003 | ||
| Double slided tape | ||||
| Whatman Black circle paper | ||||
| Bleach | Generic reagent | Diluite 1:2 before use | ||
| Paintbrush (000) | Generic tool | |||
| Micromanipulator | Instrument | Narishige | MN-153 | |
| Microinjector | Instrument | Eppendorf | Femtojet | |
| Adult cages | Generic tool | |||
| Halocarbon oil 700 | Reagent | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Ceratitis capitata | Animal | The strain used is ISPRA |
References
- Diamantidis, A. D., Carey, J. R., Nakas, C. T., Papadopoulos, N. T. Population-specific demography and invasion potential in medfly. Ecol. Evol. 1, 479-488 (2011).
- Augustinos, A. A., et al. Exploitation of the Medfly Gut Microbiota for the Enhancement of Sterile Insect Technique: Use of Enterobacter sp. in Larval Diet-Based Probiotic Applications. PLoS ONE. 10, e0136459 (2015).
- Liquido, N., Shinoda, L., Cunningham, R. Host plants of Mediterranean fruit fly: an annotated World review. Ann Entomol Soc Am. 77, 1-52 (1991).
- Szyniszewska, A. M., Tatem, A. J. Global assessment of seasonal potential distribution of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). PLoS ONE. 9, e111582 (2014).
- Malacrida, A. R., et al. Globalization and fruitfly invasion and expansion: the medfly paradigm. Genetica. 131, 1-9 (2007).
- Dyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. . Sterile Insect Technique: Principles and practice in Area-wide Integrated Pest Management. , (2005).
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
- Medfly Genome Annotation Groups. Available from: https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/medfly-genome-annotation-groups (2016)
- Pane, A., Salvemini, M., Delli Bovi, P., Polito, C., Saccone, G. The transformer gene in Ceratitis capitata provides a genetic basis for selecting and remembering the sexual fate. Development. 129, 3715-3725 (2002).
- Loukeris, T. G., Livadaras, I., Arcà, B., Zabalou, S., Savakis, C. Gene transfer into the medfly, Ceratitis capitata, with a Drosophila hydei transposable element. Science. 270, 2002-2005 (1995).
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
- Hoy, M. . Insect Molecular Genetics. An Introduction to Principles and Applications. , (2013).
- Christophides, G. K., Livadaras, I., Savakis, C., Komitopoulou, K. Two medfly promoters that have originated by recent gene duplication drive distinct sex, tissue and temporal expression patterns. Genetics. 156, 173-182 (2000).
- Handler, A. M., McCombs, S. D., Fraser, M. J., Saul, S. H. The lepidopteran transposon vector, piggyback, mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 7520-7525 (1998).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31, 199-205 (2001).
- Koukidou, M., et al. Germ line transformation of the olive fly Bactrocera oleae using a versatile transgenesis marker. Insect Mol Biol. 15, 95-103 (2006).
- Condon, K. C., et al. Germ-line transformation of the Mexican fruit fly. Insect Mol Biol. 16, 573-580 (2007).
- Raphael, K. A., et al. Germ-line transformation of the Queensland fruit fly, Bactrocera tryoni, using a piggyBac vector in the presence of endogenous piggyBac elements. Genetica. 139, 91-97 (2011).
- Meza, J. S., Nirmala, X., Zimowska, G. J., Zepeda-Cisneros, C. S., Handler, A. M. Development of transgenic strains for the biological control of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens. Genetica. 139, 53-62 (2011).
- Schetelig, M. F., Handler, A. M. Strategy for enhanced transgenic strain development for embryonic conditional lethality in Anastrepha suspensa. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9348-9353 (2012).
- Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
- Allen, M. L., O’Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38, 701-710 (2001).
- Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem Mol Biol. 32, 1211-1220 (2002).
- Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. J Biol Chem. 277, 8759-8762 (2002).
- Rodrigues, F. G., Oliveira, S. B., Rocha, B. C., Moreira, L. A. Germline transformation of Aedes fluviatilis (Diptera:Culicidae) with the piggyBac transposable element. Mem Inst Oswaldo Cruz. 101, 755-757 (2006).
- Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. J Vis Exp. , e216 (2007).
- Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti embryos to obtain transgenic mosquitoes. J Vis Exp. , e219 (2007).
- Concha, C., et al. Efficient germ-line transformation of the economically important pest species Lucilia cuprina and Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae). Insect Biochem Mol Biol. 41, 70-75 (2011).
- Takken, W., Scott, T. W. . Ecological Aspects for Application of Genetically Modified Mosquitoes. , (2003).
- Handler, A. M., Handler, A. M., James, A. A. An Introduction to the History and Methodology of Insect Gene Transfer. Insect transgenesis: methods and applications. , 3-26 (2000).
- Handler, A. M. A current perspective on insect gene transformation. Insect Biochem Mol Biol. 31, 111-128 (2001).
- Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
- Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). N Biotechnol. 25, 76-84 (2008).
- Schetelig, M. F., et al. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18171-18176 (2009).
- Schetelig, M. F., Caceres, C., Zacharopoulou, A., Franz, G., Wimmer, E. A. Conditional embryonic lethality to improve the sterile insect technique in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). BMC Biol. 7, 4 (2009).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochem Mol Biol. 43, 1-8 (2013).
- Lacroix, R., et al. Open field release of genetically engineered sterile male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS ONE. 7, e42771 (2012).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
- Leftwich, P. T., et al. Genetic elimination of field-cage populations of Mediterranean fruit flies. Proc. Biol. Sci. 281, (2014).
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-E6743 (2015).
- Economopoulos, A. P., Judt, S. Artificial Rearing of the Mediterranean Fruit Fly (Diptera: Tephritidae): Size of Oviposition Holes. J. Econ. Entomol. 82, 668-674 (1989).
- Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 13677-13681 (2011).
- Gilbert, L. . Insect Development. Morphogenesis, Molting and Metamorphosis. , (2009).
- Schetelig, M. F., Horn, C., Handler, A. M., Wimmer, E. A., Vreysen, M. J., Robinson, A., Hendrichs, J. . Area-Wide control of insect pests. From research to field implementation. , 85-93 (2007).
- Gabrieli, P., et al. Sex and the single embryo: early development in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Dev Biol. 10, 12 (2010).
- Tazuke, S. I., et al. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
- Gabrieli, P., Marois, E., Catteruccia, F., Benedict, M. Q. . Transgenic insects: techniques and applications. , 188-207 (2014).
- Scolari, F., et al. How functional genomics will impact fruit fly pest control: the example of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Genet. 15, S11 (2014).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
