Leverans av nukleinsyror genom Embryo mikroinjektion i Worldwide Agricultural Pest Insekt,<em> Ceratitis capitata</em

Summary

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Abstract

Medelhavsfruktflugan (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) är en skadedjur med extremt hög jordbruks relevans. Detta beror på dess reproduktiva beteende: kvinnor skadar den yttre ytan av frukt och grönsaker när de lägger ägg och kläckta larverna livnär sig på deras massa. Wild C. capitata populationer traditionellt kontrolleras genom insekts sprutning och / eller miljövänliga metoder, den mest framgångsrika är den sterila Insect Technique (SIT). SIT bygger på massuppfödning, strålningsbaserad sterilisering och fält frisättning av män som bibehåller sin förmåga att para sig men inte kan generera fertila avkomma. Tillkomsten och den efterföljande snabba utvecklingen av biotekniska verktyg, tillsammans med tillgången på medfly genomsekvensen, har i hög grad ökat vår förståelse av biologin av denna art. Detta gynnade spridningen av nya strategier för genom manipulation, vilket can appliceras på befolkningskontroll.

I detta sammanhang spelar embryo mikroinjektion en dubbel roll i att utöka verktygslåda för medfly kontroll. Förmågan att störa funktionen av gener som reglerar viktiga biologiska processer, ja, expanderar vår förståelse av den molekylära maskiner underliggande medfly invasiv. Dessutom, förmågan att uppnå bakterielinjetransformation underlättar produktionen av flera transgena stammar som kan testas för framtida fältapplikationer i nya SIT inställningar. I själva verket kan genetisk manipulation kan användas för att ge önskvärda egenskaper som kan till exempel användas för att övervaka sterila manliga prestanda i fält, eller som kan leda till tidig etapp i livet dödlighet. Här beskriver vi en metod för att mikroinjicera nukleinsyror i medfly embryon för att uppnå dessa två huvudmål.

Introduction

Medelhavsfruktflugan (medfly) Ceratitis capitata är en kosmopolitisk art som i stor utsträckning skadar frukt och odlade grödor. Det tillhör Tephritidae familjen, som omfattar flera skadedjur, såsom de som tillhör släktena Bactrocera och Anastrepha. Den medfly är de mest studerade arterna av denna familj, och det har blivit en modell inte bara för studier av insekts invasioner ^1, men också för att optimera växtskydd strategier ^2.

Den medfly är en multivoltine art som kan angripa mer än 300 arter av vilda och odlade växter ^3,4. Skadan orsakas av både vuxna och larvstadier: parade honor hål i fruktens yta för äggläggning, så mikroorganismer att påverka deras kommersiella kvalitet, medan larverna foder på fruktkött. Efter tre larvstadier, larver fram ur värden och förpuppas i jorden. Ceratitiscapitata visar en nästan global distribution, inklusive Afrika, Mellanöstern, Western Australia, Central- och Sydamerika, Europa och delar av USA ^5.

De vanligaste strategier för att begränsa medfly angrepp innebära användning av insekticider (t.ex. malation, spinosad) och miljövänliga Steril Insect Technique (SIT) ^6. Den senare metoden innebär utsläpp i naturen av hundratusentals män utförda steril genom exponering för joniserande strålning. Parningen av sådana steriliserade hanar till vilda kvinnor resulterar i någon avkomma, vilket leder till en minskning av befolkningsstorlek, så småningom leder till utrotning. Även SIT har visat sig effektiv i flera kampanjer runt om i världen, dess stora nackdelar innefattar de höga kostnaderna för uppfödning och sterilisering miljontals insekter att släppas. Märkning av utsatta fiskar är nödvändigt att skilja steril från vilda insekter fångas i fältet underövervakningsverksamhet och det är för närvarande uppnås med hjälp av fluorescerande pulver. Dessa förfaranden är kostsamma och har oönskade bieffekter ^7.

För att optimera och / eller att utveckla mer effektiva metoder för kontroll av denna skadegörare, har medfly biologi och genetik i stor utsträckning utforskats av många forskare världen över. Tillgängligheten av medfly genomsekvensen ^8,9, kommer att underlätta nya undersökningar på genfunktioner. RNA-interferens är ett kraftfullt verktyg för sådana studier och det kan uppnås genom mikroinjektion av dsRNA (dubbelsträngat RNA) eller siRNA (små störande RNA). Denna teknik har använts, till exempel för att visa att könsbestämning molekyl kaskad i C. capitata endast delvis bevarad med avseende på den av Drosophila ^10.

Utvecklingen av protokoll för att mikroinjicera medfly embryon tillåts C. capitata att vara den första icke-Drosophilid Gylf arter som skall genetiskt modifierade. Som dess ägg liknar dem av Drosophila, både vad gäller morfologi och motståndskraft mot uttorkning ^11, till protokollet leverera plasmid-DNA i pre-BLASTODERM embryon först utvecklats för D. melanogaster ^12,13 ursprungligen anpassad för användning i C. capitata. Dessa första försök tillåts medfly bakterielinjetransformation baserat på det transponerbara elementet Minos ^11. Därefter det ursprungliga systemet modifierade ¹⁴ användning av andra transposonbaserade baserade metoder. Detta är fallet med piggyBac från Lepidoptera Trichoplusia ni ^15. Protokollet har därefter ytterligare optimeras och detta har gjort det möjligt att omvandla andra tephritid arter ^16-21 och även många andra Diptera ^22-31. Alla dessa system förlitar sig på användningen av en typisk binär vektor / hjälparplasmid transformationssystem: artificiell, defekt transposöner innehållande önskade gener sätts samman till plasmid-DNA och integreras i genomet hos insekten genom att tillföra nämnda transposas enzymet ^32. Ett antal transgena medfly linjer har genererats, med flera funktioner, inklusive stammar som bär en villkorlig dominant letal gen som inducerar letalitet, stammar som producerar han-bara avkomma och därmed inte kräver ytterligare könsbestämning strategier, och stammar med fluorescerande spermier, vilket kan förbättra noggrannheten av SIT övervakningsfasen ^33-37. Även utsläpp i naturen av transgena organismer har skett i pilottester mot mygg endast ^38,39, är åtminstone ett företag utvärderar ett antal transgena medfly stammar för deras användning i fält ^40.

Embryo mikroinjektion kan också främja utvecklingen av nya genomet redigeringsverktyg, såsom transkriptionsaktivator liknande effektor nukleaser (Talens), klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (CRISPR) / crispr associerat protein 9 nukleas (Cas9) och homing-endonukleaser gener (HEGs), som gör det möjligt nya evolutionära och utvecklingsstudier, samt expanderar den tillgängliga biotekniska verktygslådan. Genome-redigering metoder redan tillät genereringen av genen-drivsystem i myggor ^41, och deras överföring till medfly är nära förestående. Här beskriver vi en universell protokoll för microinjecting nukleinsyror i medfly embryon som kan vara användbara för alla de ovan nämnda ansökningarna.

Protocol

1. försöksuppställningen insectary krav Bibehålla alla C. capitata levnadsstadier vid 25 ° C, 65% luftfuktighet och 12/12 h ljus / mörker fotoperiod. Häll ca 1,500-2,000 medfly puppor i en 6 L bur. Använd en bur med en mässings mesh på ena sidan med hål tillräckligt små för att stimulera äggläggning 42. Sätt en svamp remsa genom en liten öppning i buren bas för att ge flugor med vatten med hjälp av kapillärkraften. Använd en blandni…

Representative Results

Här rapporterar vi två tillämpningar av embryomikroinjektion riktas mot den funktionella karakteriseringen av en gen av intresse (Case 1), och vid generering av transgena stammar (Fall 2), respektive. Leverans av dsRNA till embryon för att riva upp genfunktion. Den innexin-5-genen kodar för ett gap-junction att i insekter, uttrycks specifikt i manliga …

Discussion

Mikroinjektion av nukleinsyror i insektsembryon är en universell teknik som underlättar både analysen av genfunktion och biotekniska tillämpningar.

Den senaste publiceringen av genomsekvenser från ett ökande antal insektsarter leder till ett akut behov av verktyg för funktionell karakterisering av gener av ännu okänd funktion. RNA-interferens har visat sig vara en av de mest värdefulla metoder för att sluta molekylära funktioner ⁴⁹ och embryomikroinjektion underlättar…

Materials

1 x injection Buffer	Buffer			0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5mM KCl
Construct Plasmid	DNA
Helper Plasmid	DNA
dsRNA	RNA			Phenol-Chloroform purified
Standard Larval food	Rearing Food			1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products  dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer’s yeast, 1 kg soft wheat bran
Carrot Larval Food	Rearing food			2.5 g Agar, 4 g Sodium Benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1L
Adult Food	Rearing food			yeast extract and sugar (1:10)
Microscope slides		Sigma-Aldrich	Z692247
Injection needles		Eppendorf	5242956000
Microloaders		Eppendorf	5242956003
Double slided tape
Whatman Black circle paper
Bleach	Generic reagent			Diluite 1:2 before use
Paintbrush (000)	Generic tool
Micromanipulator	Instrument	Narishige	MN-153
Microinjector	Instrument	Eppendorf	Femtojet
Adult cages	Generic tool
Halocarbon oil 700	Reagent	Sigma-Aldrich	H8898
Ceratitis capitata	Animal			The strain used is ISPRA