Summary

Leverans av nukleinsyror genom Embryo mikroinjektion i Worldwide Agricultural Pest Insekt,<em> Ceratitis capitata</em

Published: October 01, 2016
doi:

Summary

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Abstract

Medelhavsfruktflugan (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) är en skadedjur med extremt hög jordbruks relevans. Detta beror på dess reproduktiva beteende: kvinnor skadar den yttre ytan av frukt och grönsaker när de lägger ägg och kläckta larverna livnär sig på deras massa. Wild C. capitata populationer traditionellt kontrolleras genom insekts sprutning och / eller miljövänliga metoder, den mest framgångsrika är den sterila Insect Technique (SIT). SIT bygger på massuppfödning, strålningsbaserad sterilisering och fält frisättning av män som bibehåller sin förmåga att para sig men inte kan generera fertila avkomma. Tillkomsten och den efterföljande snabba utvecklingen av biotekniska verktyg, tillsammans med tillgången på medfly genomsekvensen, har i hög grad ökat vår förståelse av biologin av denna art. Detta gynnade spridningen av nya strategier för genom manipulation, vilket can appliceras på befolkningskontroll.

I detta sammanhang spelar embryo mikroinjektion en dubbel roll i att utöka verktygslåda för medfly kontroll. Förmågan att störa funktionen av gener som reglerar viktiga biologiska processer, ja, expanderar vår förståelse av den molekylära maskiner underliggande medfly invasiv. Dessutom, förmågan att uppnå bakterielinjetransformation underlättar produktionen av flera transgena stammar som kan testas för framtida fältapplikationer i nya SIT inställningar. I själva verket kan genetisk manipulation kan användas för att ge önskvärda egenskaper som kan till exempel användas för att övervaka sterila manliga prestanda i fält, eller som kan leda till tidig etapp i livet dödlighet. Här beskriver vi en metod för att mikroinjicera nukleinsyror i medfly embryon för att uppnå dessa två huvudmål.

Introduction

Medelhavsfruktflugan (medfly) Ceratitis capitata är en kosmopolitisk art som i stor utsträckning skadar frukt och odlade grödor. Det tillhör Tephritidae familjen, som omfattar flera skadedjur, såsom de som tillhör släktena Bactrocera och Anastrepha. Den medfly är de mest studerade arterna av denna familj, och det har blivit en modell inte bara för studier av insekts invasioner 1, men också för att optimera växtskydd strategier 2.

Den medfly är en multivoltine art som kan angripa mer än 300 arter av vilda och odlade växter 3,4. Skadan orsakas av både vuxna och larvstadier: parade honor hål i fruktens yta för äggläggning, så mikroorganismer att påverka deras kommersiella kvalitet, medan larverna foder på fruktkött. Efter tre larvstadier, larver fram ur värden och förpuppas i jorden. Ceratitiscapitata visar en nästan global distribution, inklusive Afrika, Mellanöstern, Western Australia, Central- och Sydamerika, Europa och delar av USA 5.

De vanligaste strategier för att begränsa medfly angrepp innebära användning av insekticider (t.ex. malation, spinosad) och miljövänliga Steril Insect Technique (SIT) 6. Den senare metoden innebär utsläpp i naturen av hundratusentals män utförda steril genom exponering för joniserande strålning. Parningen av sådana steriliserade hanar till vilda kvinnor resulterar i någon avkomma, vilket leder till en minskning av befolkningsstorlek, så småningom leder till utrotning. Även SIT har visat sig effektiv i flera kampanjer runt om i världen, dess stora nackdelar innefattar de höga kostnaderna för uppfödning och sterilisering miljontals insekter att släppas. Märkning av utsatta fiskar är nödvändigt att skilja steril från vilda insekter fångas i fältet underövervakningsverksamhet och det är för närvarande uppnås med hjälp av fluorescerande pulver. Dessa förfaranden är kostsamma och har oönskade bieffekter 7.

För att optimera och / eller att utveckla mer effektiva metoder för kontroll av denna skadegörare, har medfly biologi och genetik i stor utsträckning utforskats av många forskare världen över. Tillgängligheten av medfly genomsekvensen 8,9, kommer att underlätta nya undersökningar på genfunktioner. RNA-interferens är ett kraftfullt verktyg för sådana studier och det kan uppnås genom mikroinjektion av dsRNA (dubbelsträngat RNA) eller siRNA (små störande RNA). Denna teknik har använts, till exempel för att visa att könsbestämning molekyl kaskad i C. capitata endast delvis bevarad med avseende på den av Drosophila 10.

Utvecklingen av protokoll för att mikroinjicera medfly embryon tillåts C. capitata att vara den första icke-Drosophilid Gylf arter som skall genetiskt modifierade. Som dess ägg liknar dem av Drosophila, både vad gäller morfologi och motståndskraft mot uttorkning 11, till protokollet leverera plasmid-DNA i pre-BLASTODERM embryon först utvecklats för D. melanogaster 12,13 ursprungligen anpassad för användning i C. capitata. Dessa första försök tillåts medfly bakterielinjetransformation baserat på det transponerbara elementet Minos 11. Därefter det ursprungliga systemet modifierade 14 användning av andra transposonbaserade baserade metoder. Detta är fallet med piggyBac från Lepidoptera Trichoplusia ni 15. Protokollet har därefter ytterligare optimeras och detta har gjort det möjligt att omvandla andra tephritid arter 16-21 och även många andra Diptera 22-31. Alla dessa system förlitar sig på användningen av en typisk binär vektor / hjälparplasmid transformationssystem: artificiell, defekt transposöner innehållande önskade gener sätts samman till plasmid-DNA och integreras i genomet hos insekten genom att tillföra nämnda transposas enzymet 32. Ett antal transgena medfly linjer har genererats, med flera funktioner, inklusive stammar som bär en villkorlig dominant letal gen som inducerar letalitet, stammar som producerar han-bara avkomma och därmed inte kräver ytterligare könsbestämning strategier, och stammar med fluorescerande spermier, vilket kan förbättra noggrannheten av SIT övervakningsfasen 33-37. Även utsläpp i naturen av transgena organismer har skett i pilottester mot mygg endast 38,39, är åtminstone ett företag utvärderar ett antal transgena medfly stammar för deras användning i fält 40.

Embryo mikroinjektion kan också främja utvecklingen av nya genomet redigeringsverktyg, såsom transkriptionsaktivator liknande effektor nukleaser (Talens), klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (CRISPR) / crispr associerat protein 9 nukleas (Cas9) och homing-endonukleaser gener (HEGs), som gör det möjligt nya evolutionära och utvecklingsstudier, samt expanderar den tillgängliga biotekniska verktygslådan. Genome-redigering metoder redan tillät genereringen av genen-drivsystem i myggor 41, och deras överföring till medfly är nära förestående. Här beskriver vi en universell protokoll för microinjecting nukleinsyror i medfly embryon som kan vara användbara för alla de ovan nämnda ansökningarna.

Protocol

1. försöksuppställningen insectary krav Bibehålla alla C. capitata levnadsstadier vid 25 ° C, 65% luftfuktighet och 12/12 h ljus / mörker fotoperiod. Häll ca 1,500-2,000 medfly puppor i en 6 L bur. Använd en bur med en mässings mesh på ena sidan med hål tillräckligt små för att stimulera äggläggning 42. Sätt en svamp remsa genom en liten öppning i buren bas för att ge flugor med vatten med hjälp av kapillärkraften. Använd en blandni…

Representative Results

Här rapporterar vi två tillämpningar av embryomikroinjektion riktas mot den funktionella karakteriseringen av en gen av intresse (Case 1), och vid generering av transgena stammar (Fall 2), respektive. Leverans av dsRNA till embryon för att riva upp genfunktion. Den innexin-5-genen kodar för ett gap-junction att i insekter, uttrycks specifikt i manliga …

Discussion

Mikroinjektion av nukleinsyror i insektsembryon är en universell teknik som underlättar både analysen av genfunktion och biotekniska tillämpningar.

Den senaste publiceringen av genomsekvenser från ett ökande antal insektsarter leder till ett akut behov av verktyg för funktionell karakterisering av gener av ännu okänd funktion. RNA-interferens har visat sig vara en av de mest värdefulla metoder för att sluta molekylära funktioner 49 och embryomikroinjektion underlättar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank all the members of the “Insect Genetics and Genomics” Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia “IMPROVE” (FS).

Materials

1 x injection Buffer  Buffer 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5mM KCl
Construct Plasmid DNA
Helper Plasmid DNA
dsRNA RNA Phenol-Chloroform purified
Standard Larval food Rearing Food  1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products  dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer’s yeast, 1 kg soft wheat bran
Carrot Larval Food Rearing food 2.5 g Agar, 4 g Sodium Benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1L
Adult Food Rearing food yeast extract and sugar (1:10) 
Microscope slides Sigma-Aldrich Z692247
Injection needles  Eppendorf 5242956000
Microloaders Eppendorf 5242956003
Double slided tape
Whatman Black circle paper
Bleach Generic reagent Diluite 1:2 before use
Paintbrush (000) Generic tool
Micromanipulator Instrument Narishige MN-153
Microinjector Instrument Eppendorf Femtojet
Adult cages Generic tool
Halocarbon oil 700 Reagent Sigma-Aldrich H8898
Ceratitis capitata Animal The strain used is ISPRA

References

  1. Diamantidis, A. D., Carey, J. R., Nakas, C. T., Papadopoulos, N. T. Population-specific demography and invasion potential in medfly. Ecol. Evol. 1, 479-488 (2011).
  2. Augustinos, A. A., et al. Exploitation of the Medfly Gut Microbiota for the Enhancement of Sterile Insect Technique: Use of Enterobacter sp. in Larval Diet-Based Probiotic Applications. PLoS ONE. 10, e0136459 (2015).
  3. Liquido, N., Shinoda, L., Cunningham, R. Host plants of Mediterranean fruit fly: an annotated World review. Ann Entomol Soc Am. 77, 1-52 (1991).
  4. Szyniszewska, A. M., Tatem, A. J. Global assessment of seasonal potential distribution of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). PLoS ONE. 9, e111582 (2014).
  5. Malacrida, A. R., et al. Globalization and fruitfly invasion and expansion: the medfly paradigm. Genetica. 131, 1-9 (2007).
  6. Dyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. . Sterile Insect Technique: Principles and practice in Area-wide Integrated Pest Management. , (2005).
  7. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
  8. Medfly Genome Annotation Groups. Available from: https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/medfly-genome-annotation-groups (2016)
  9. Pane, A., Salvemini, M., Delli Bovi, P., Polito, C., Saccone, G. The transformer gene in Ceratitis capitata provides a genetic basis for selecting and remembering the sexual fate. Development. 129, 3715-3725 (2002).
  10. Loukeris, T. G., Livadaras, I., Arcà, B., Zabalou, S., Savakis, C. Gene transfer into the medfly, Ceratitis capitata, with a Drosophila hydei transposable element. Science. 270, 2002-2005 (1995).
  11. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
  12. Hoy, M. . Insect Molecular Genetics. An Introduction to Principles and Applications. , (2013).
  13. Christophides, G. K., Livadaras, I., Savakis, C., Komitopoulou, K. Two medfly promoters that have originated by recent gene duplication drive distinct sex, tissue and temporal expression patterns. Genetics. 156, 173-182 (2000).
  14. Handler, A. M., McCombs, S. D., Fraser, M. J., Saul, S. H. The lepidopteran transposon vector, piggyback, mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 7520-7525 (1998).
  15. Handler, A. M., Harrell, R. A. Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31, 199-205 (2001).
  16. Koukidou, M., et al. Germ line transformation of the olive fly Bactrocera oleae using a versatile transgenesis marker. Insect Mol Biol. 15, 95-103 (2006).
  17. Condon, K. C., et al. Germ-line transformation of the Mexican fruit fly. Insect Mol Biol. 16, 573-580 (2007).
  18. Raphael, K. A., et al. Germ-line transformation of the Queensland fruit fly, Bactrocera tryoni, using a piggyBac vector in the presence of endogenous piggyBac elements. Genetica. 139, 91-97 (2011).
  19. Meza, J. S., Nirmala, X., Zimowska, G. J., Zepeda-Cisneros, C. S., Handler, A. M. Development of transgenic strains for the biological control of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens. Genetica. 139, 53-62 (2011).
  20. Schetelig, M. F., Handler, A. M. Strategy for enhanced transgenic strain development for embryonic conditional lethality in Anastrepha suspensa. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9348-9353 (2012).
  21. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  22. Allen, M. L., O’Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38, 701-710 (2001).
  23. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem Mol Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  24. Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. J Biol Chem. 277, 8759-8762 (2002).
  25. Rodrigues, F. G., Oliveira, S. B., Rocha, B. C., Moreira, L. A. Germline transformation of Aedes fluviatilis (Diptera:Culicidae) with the piggyBac transposable element. Mem Inst Oswaldo Cruz. 101, 755-757 (2006).
  26. Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. J Vis Exp. , e216 (2007).
  27. Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti embryos to obtain transgenic mosquitoes. J Vis Exp. , e219 (2007).
  28. Concha, C., et al. Efficient germ-line transformation of the economically important pest species Lucilia cuprina and Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae). Insect Biochem Mol Biol. 41, 70-75 (2011).
  29. Takken, W., Scott, T. W. . Ecological Aspects for Application of Genetically Modified Mosquitoes. , (2003).
  30. Handler, A. M., Handler, A. M., James, A. A. An Introduction to the History and Methodology of Insect Gene Transfer. Insect transgenesis: methods and applications. , 3-26 (2000).
  31. Handler, A. M. A current perspective on insect gene transformation. Insect Biochem Mol Biol. 31, 111-128 (2001).
  32. Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
  33. Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). N Biotechnol. 25, 76-84 (2008).
  34. Schetelig, M. F., et al. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18171-18176 (2009).
  35. Schetelig, M. F., Caceres, C., Zacharopoulou, A., Franz, G., Wimmer, E. A. Conditional embryonic lethality to improve the sterile insect technique in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). BMC Biol. 7, 4 (2009).
  36. Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochem Mol Biol. 43, 1-8 (2013).
  37. Lacroix, R., et al. Open field release of genetically engineered sterile male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS ONE. 7, e42771 (2012).
  38. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
  39. Leftwich, P. T., et al. Genetic elimination of field-cage populations of Mediterranean fruit flies. Proc. Biol. Sci. 281, (2014).
  40. Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-E6743 (2015).
  41. Economopoulos, A. P., Judt, S. Artificial Rearing of the Mediterranean Fruit Fly (Diptera: Tephritidae): Size of Oviposition Holes. J. Econ. Entomol. 82, 668-674 (1989).
  42. Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 13677-13681 (2011).
  43. Gilbert, L. . Insect Development. Morphogenesis, Molting and Metamorphosis. , (2009).
  44. Schetelig, M. F., Horn, C., Handler, A. M., Wimmer, E. A., Vreysen, M. J., Robinson, A., Hendrichs, J. . Area-Wide control of insect pests. From research to field implementation. , 85-93 (2007).
  45. Gabrieli, P., et al. Sex and the single embryo: early development in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Dev Biol. 10, 12 (2010).
  46. Tazuke, S. I., et al. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
  47. Gabrieli, P., Marois, E., Catteruccia, F., Benedict, M. Q. . Transgenic insects: techniques and applications. , 188-207 (2014).
  48. Scolari, F., et al. How functional genomics will impact fruit fly pest control: the example of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Genet. 15, S11 (2014).
  49. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
  50. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).

Play Video

Cite This Article
Gabrieli, P., Scolari, F. Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata. J. Vis. Exp. (116), e54528, doi:10.3791/54528 (2016).

View Video