Levering af nukleinsyrer gennem Embryo Mikroinjektion i Worldwide Agricultural Pest Insekt,<em> Ceratitis capitata</em

Summary

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Abstract

Middelhavet bananfluen (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) er et skadedyr arter med ekstremt høj landbrugs relevans. Dette er på grund af sin reproduktive adfærd: hunner beskadige den udvendige overflade af frugt og grøntsager, når de lægger æg og udklækkede larver lever af deres pulp. Wild C. capitata befolkninger er traditionelt styret gennem insekticid sprøjtning og / eller miljøvenlige metoder, den mest succesfulde er den sterile Insect Teknik (SIT). Den SIT afhængig masse-opdræt, stråling-baserede sterilisation og felt frigivelse af mænd, der bevarer deres evne til at parre sig, men ikke er i stand til at generere frugtbare afkom. Fremkomsten og den efterfølgende hurtige udvikling af bioteknologiske værktøjer, sammen med tilgængeligheden af ​​medfly genomsekvens, har i høj grad styrket vores forståelse af biologien af ​​denne art. Dette begunstigede spredning af nye strategier for genom manipulation, hvilket can anvendes på befolkningskontrol.

I denne sammenhæng, embryo mikroinjektion spiller en dobbelt rolle i at udvide værktøjskassen for medfly kontrol. Evnen til at interferere med funktionen af ​​gener, der regulerer vigtige biologiske processer, ja, udvider vores forståelse af den molekylære maskineri, der understøtter medfly invasionsevne. Endvidere evnen til at opnå kimlinje-transformation letter produktionen af ​​multiple transgene stammer, der kan testes for fremtidige anvendelser i marken i hidtil ukendte SIT indstillinger. Faktisk kan genetisk manipulation kan anvendes til at bibringe ønskede træk, der kan for eksempel anvendes til at overvåge steril mandlige ydeevne i marken, eller som kan resultere i tidligt liv-fase letalitet. Her beskriver vi en metode til at microinject nukleinsyrer i Medfly embryoner til at nå disse to mål.

Introduction

Middelhavet bananfluen (medfly) Ceratitis capitata er en kosmopolitisk art at det ekstensive skader frugter og dyrkede afgrøder. Det hører til Tephritidae familien, som omfatter flere skadedyr arter, såsom dem, der tilhører slægterne Bactrocera og Anastrepha. Den medfly er de mest undersøgte arter af denne familie, og det er blevet en model, ikke kun for studiet af insekt invasioner ^1, men også til optimering skadedyrsbekæmpelse strategier ^2.

Den medfly er en multivoltine arter, der kan angribe mere end 300 arter af vilde og dyrkede planter ^3,4. Skaden er forårsaget af både voksne og larvestadier: parret hunner gennembore overfladen af ​​frugt til æglægning, så mikroorganismer til at påvirke deres kommercielle kvalitet, mens larver lever på pulp. Efter tre larvestadier, larver emerge fra værten og forpupper i jorden. Ceratitiscapitata viser en næsten verdensomspændende distribution, herunder Afrika, Mellemøsten, Western Australia, Central- og Sydamerika, Europa og områder i USA ^fem.

De mest almindelige strategier til begrænsning Medfly parasitære indebærer brug af insekticider (f.eks Malathion, spinosad) og miljøvenlige Steril Insekt Teknik (SIT) ^6. Sidstnævnte fremgangsmåde omfatter frigivelse i naturen af ​​hundredtusindvis af mænd ydede steril ved udsættelse for ioniserende stråling. Parringen af ​​sådanne steriliserede hanner til vilde hunner resulterer i ingen afkom, hvilket medfører en reduktion i befolkningens størrelse, i sidste ende fører til udryddelse. Selv SIT har vist sig effektiv i flere kampagner over hele verden, dens store ulemper omfatter de høje omkostninger ved opdræt og sterilisering millioner af insekter til at blive frigivet. Mærkning af genudsatte individer er nødvendigt at skelne sterile fra vilde insekter fanget i området underovervågningsaktiviteter og det er i øjeblikket opnås ved hjælp af fluorescerende pulvere. Disse procedurer er dyre og har uønskede bivirkninger ^7.

For at optimere og / eller for at udvikle mere effektive metoder til bekæmpelse af dette skadedyr, har medfly biologi og genetik blevet bredt udforsket af mange forskere verden over. Tilgængeligheden af medfly genomsekvens ^8,9, vil lette hidtil ukendte undersøgelser på genfunktioner. RNA-interferens er et kraftfuldt værktøj til sådanne undersøgelser, og det kan opnås gennem mikroinjektion af dsRNA (dobbeltstrenget RNA) eller siRNA (lille interfererende RNA). Denne teknik er blevet anvendt, for eksempel for at vise, at kønsbestemmelse molekylære kaskade i C. capitata er kun delvist bevaret i forhold til den for Drosophila ^10.

Udviklingen af protokoller til microinject Medfly embryoner tilladt C. capitata at være den første ikke-Drosophilid Fluearter at være genetisk modificeret. Som sine æg ligner dem af Drosophila, både med hensyn til morfologi og modstand mod udtørring ^11, til protokollen levere plasmid DNA i præ-blastoderm embryoer først udviklet til D. melanogaster ^12,13 blev oprindeligt indrettet til brug i C. capitata. Disse første forsøg tilladt medfly kimlinje-transformation baseret på det transposerbare element Minos ^11. Efterfølgende blev det oprindelige system modificerede ¹⁴ ved anvendelse ^af andre transposon tilgange. Dette er tilfældet for piggyBac fra Lepidoptera Trichoplusia ni ^15. Protokollen er siden blevet yderligere optimeret og dette har tilladt omdannelsen af andre tephritid arter ^16-21 og også for mange andre Diptera ^22-31. Alle disse systemer er baseret på anvendelsen af ​​en typisk binære vektor / hjælper-plasmid transformation systemet: kunstig, defekt transposønner indeholdende ønskede gener samles til plasmid-DNA og integreres i genomet af insektet ved at give transposaseenzymet ^32. En række transgene Medfly linjer er blevet genereret, med flere funktioner, herunder stammer, der bærer en betinget dominant letal gen, der inducerer letalitet, stammer, der producerer mandlige kun afkom og dermed ikke kræver yderligere kønsbestemmelse strategier, og stammer med fluorescerende sperm, der kan forbedre nøjagtigheden af SIT overvågningsfasen ^33-37. Selv udgivelsen i naturen af transgene organismer er sket i pilotforsøg mod myg kun ^38,39, er mindst én virksomhed evaluere en række transgene Medfly stammer for deres anvendelse i marken ^40.

Embryo mikroinjektion kan også fremme udviklingen af ​​nye genom-redigeringsværktøjer, såsom transskription aktivator-lignende effektor nukleaser (Talens), grupperet regelmæssigt spatierede korte palindrome gentagelser (CRISPR) / CRISPR protein 9 nuklease (Cas9) og målsøgende endonukleaserne gener (HEGs), som vil sætte nye evolutionære og udviklingsmæssige undersøgelser, samt udvide den tilgængelige bioteknologiske værktøjskasse. Genom-redigering tilgange allerede tilladt generation af gen-drivsystemer i myg ^41, og deres overførsel til medfly er nært forestående. Her beskriver vi en universel protokol for mikroinjektion nukleinsyrer i Medfly embryoner, der kan være nyttige for alle de ovennævnte programmer.

Protocol

1. Eksperimentel Set-up insektbetingelser krav Bevar alle C. capitata livsstadier ved 25 ° C, 65% fugtighed og 12/12 timers lys / mørke fotoperiode. Placer omkring 1.500-2.000 medfly pupper i en 6 L bur. Brug et bur med en messing mesh på den ene side med huller små nok til at stimulere æglægning 42. Indsæt en svamp strimmel gennem en lille åbning i buret base for at tilvejebringe fluer med vand ved hjælp af kapillarvirkning. Anvende en blanding…

Representative Results

Her rapporterer vi to anvendelser af embryo mikroinjektion rettet mod den funktionelle karakterisering af et gen af ​​interesse (Case 1), og ved generering af transgene stammer (sag 2), hhv. Levering af dsRNA i embryoner at udrede genfunktion. Den innexin-5-genet koder for et gap-junction, at i insekter, udtrykkes specifikt i de mandlige og kvindelige g…

Discussion

Mikroinjektion af nukleinsyrer i insekt embryoer er en universel teknik, der fremmer såvel analysen af ​​genfunktion og bioteknologiske anvendelser.

Den nylige offentliggørelse af genom-sekvenser fra et stigende antal insektarter fører til et presserende behov for værktøjer til funktionel karakterisering af gener af endnu ukendt funktion. RNA-interferens har vist sig at være en af de mest værdifulde metoder til at udlede molekylære funktioner ⁴⁹ og embryo mikroinjektio…

Materials

1 x injection Buffer	Buffer			0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5mM KCl
Construct Plasmid	DNA
Helper Plasmid	DNA
dsRNA	RNA			Phenol-Chloroform purified
Standard Larval food	Rearing Food			1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products  dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer’s yeast, 1 kg soft wheat bran
Carrot Larval Food	Rearing food			2.5 g Agar, 4 g Sodium Benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1L
Adult Food	Rearing food			yeast extract and sugar (1:10)
Microscope slides		Sigma-Aldrich	Z692247
Injection needles		Eppendorf	5242956000
Microloaders		Eppendorf	5242956003
Double slided tape
Whatman Black circle paper
Bleach	Generic reagent			Diluite 1:2 before use
Paintbrush (000)	Generic tool
Micromanipulator	Instrument	Narishige	MN-153
Microinjector	Instrument	Eppendorf	Femtojet
Adult cages	Generic tool
Halocarbon oil 700	Reagent	Sigma-Aldrich	H8898
Ceratitis capitata	Animal			The strain used is ISPRA