Levering av nukleinsyrer gjennom Embryo Mikroinjeksjon i Worldwide Agricultural Pest Insect,<em> Appelsinflue</em

Summary

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Abstract

Middelhavet bananflue (medfly) appelsinflue (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) er en pest arter med ekstremt høy landbruks relevans. Dette er på grunn av sin reproduktive atferden: hunner skade den ytre overflaten av frukt og grønnsaker når de legger egg og klekket larver lever på sin masse. Wild C. Capitata populasjoner er tradisjonelt kontrolleres gjennom insektmiddel sprøyting og / eller miljøvennlige tilnærminger, den mest vellykkede være Sterile Insect Teknikk (SIT). SIT er avhengig av masseoppdragelse, stråling basert sterilisering og felt utgivelsen av menn som beholder sin evne til å parre seg, men er ikke i stand til å generere fruktbar avkom. Advent og den påfølgende raske utviklingen av bioteknologiske verktøy, sammen med tilgjengeligheten av medfly genomsekvens, har i stor grad styrket vår forståelse av biologi av denne arten. Dette favoriserte spredning av nye strategier for genom manipulasjon, som can brukes til befolkningskontroll.

I denne sammenheng spiller embryo mikroinjeksjon en dobbel rolle i å utvide verktøykassen for medfly kontroll. Evnen til å forstyrre funksjonen av gener som regulerer viktige biologiske prosesser, ja, utvider vår forståelse av det molekylære maskineri underliggende medfly invasivitet. Videre er evnen til å oppnå bakterie-linje transformasjon letter produksjon av flere transgene stammer som kan testes for fremtidige feltapplikasjoner i nye SIT innstillinger. Faktisk kan genetisk manipulasjon benyttes for å gi ønskelige egenskaper som kan, for eksempel, kan brukes til å overvåke sterile hannytelse i felten, eller som kan resultere i tidlig i livet stadium letalitet. Her beskriver vi en metode for å microinject nukleinsyrer inn medfly embryo for å oppnå disse to hovedmålene.

Introduction

Middelhavet bananflue (medfly) appelsinflue er en kosmopolitisk art som i stor utstrekning skader frukt og dyrket avlinger. Det hører til Tephritidae familien, som inkluderer flere skadedyr, for eksempel de som tilhører slektene Bactrocera og Anastrepha. Den medfly er de mest studerte arter av denne familien, og det har blitt en modell ikke bare for studiet av insekt invasjoner ^1, men også for å optimalisere pest forvaltningstiltak ^2.

Den medfly er en multivoltine arter som kan angripe mer enn 300 arter av ville og kultiverte planter ^3,4. Den skade er forårsaket av både voksne og larvestadier: parrede hunner stikke hull på overflaten av frukten for egglegging, slik at mikroorganismer for å påvirke deres kommersielle kvalitet, mens larvene lever på fruktkjøtt. Etter tre larvestadier, larver dukke opp fra verten og forpupper seg i jorda. Ceratitiscapitata viser en nesten verdensomspennende distribusjon, inkludert Afrika, Midt-Østen, Western Australia, Mellom- og Sør-Amerika, Europa og deler av USA ^fem.

De mest vanlige strategier for å begrense medfly infestations innebære bruk av insektmidler (f.eks Malathion, Spinosad) og miljøvennlig Steril Insect Technique (SIT) ^6. Sistnevnte tilnærming innebærer utsetting i naturen av hundretusener av menn gjengis steril av eksponering for ioniserende stråling. Paring av slike steriliserte menn å ville hunner resulterer i ingen avkom, forårsaker en reduksjon i bestandsstørrelse, til slutt fører til utrydding. Selv om SIT har vist seg effektiv i flere kampanjer over hele verden, sine store ulemper inkludere de høye kostnadene ved stell og sterilisering millioner av insekter til å bli utgitt. Merking av frigjorte individer er nødvendig å skille steril fra vill insekter fanget i feltet i løpetovervåkingsaktiviteter, og det blir for tiden oppnådd ved bruk av fluorescerende pulver. Disse fremgangsmåter er kostbare og har uønskede bivirkninger ^7.

For å optimalisere og / eller for å utvikle mer effektive metoder for kontroll av skadedyr, har medfly biologi og genetikk blitt mye utforsket av mange forskere over hele verden. Tilgjengeligheten av medfly genomsekvens ^8,9, vil legge til rette for nye undersøkelser på genet funksjoner. RNA-interferens er et kraftig verktøy for slike undersøkelser, og det kan oppnås gjennom den mikroinjeksjon av dsRNA (dobbelt-trådet RNA) eller siRNA (liten forstyrrende RNA). Denne teknikken har blitt anvendt, for eksempel for å demonstrere at den kjønnsbestemmelse molekyl kaskade i C. capitata er bare delvis konservert med hensyn til den av Drosophila ^10.

Utviklingen av protokoller for å microinject medfly embryoer tillatt C. capitata å være den første non-Drosophilid Fluearter som skal genmodifisert. Som dens egg er lik de av Drosophila, både når det gjelder morfologi og resistens overfor uttørking ^11, til protokollen som gir plasmid-DNA inn i pre-blastoderm embryoer først utviklet for D. melanogaster ^12,13 ble først tilpasset for bruk i C. capitata. Disse første forsøkene tillatt medfly bakterie-line transformasjon basert på transposable element Minos ^11. Deretter ble det opprinnelige systemet modifisert ¹⁴ ved hjelp av andre transposon-baserte tilnærminger. Dette er tilfellet med piggyBac fra Lepidoptera Trichoplusia ni ^15. Protokollen har siden blitt ytterligere optimalisert og dette har tillatt transformasjon av andre tephritid arter ^16-21 og også av mange andre Diptera ^22-31. Alle disse systemene er avhengige av bruken av en typisk binær vektor / hjelper plasmid transformasjonssystem: kunstig, defekte transposønner som inneholder ønskede gener er montert inn i plasmid-DNA og integrert i genomet av insekt ved å tilføre den transposase enzymet ^32. En rekke av transgene medfly linjene har blitt generert, med flere funksjoner, inkludert stammer som bærer en betinget dominant dødelig gen som forårsaker dødelighet, stammer som produserer kun for menn avkom og dermed ikke er nødvendig med flere sexing strategier, og stammer med fluoriserende sperm, som kan forbedre nøyaktigheten av SIT overvåkingsfasen ^33-37. Selv om frigjørings i naturen av transgene organismer har funnet sted i pilottester mot mygg bare ^38,39 er i det minste ett firma å vurdere en rekke transgene medfly stammer for deres bruk i felten ^40.

Embryo mikroinjeksjon kan også favorisere utvikling av nye genom-redigeringsverktøy som transkripsjons aktivator lignende effektor nukleaser (Talens), gruppert regelmessig avbrutt av korte palindromic repetisjoner (CRISPR) / CRISPR assosiert protein 9 nuklease (Cas9) og homing-endonukleaser gener (HEGs), som vil muliggjøre nye evolusjonære og utviklingsstudier, samt utvide det tilgjengelige bioteknologiske verktøykasse. Genome-redigering tilnærminger lov generering av gene-drivsystemer i mygg ^41, og deres overføring til medfly er nært forestående. Her beskriver vi en universal protokoll for microinjecting nukleinsyrer i medfly embryo som kan være nyttig for alle de ovennevnte programmene.

Protocol

1. Eksperimentell Set-up Insectary krav Opprettholde alle C. capitata livsstadier ved 25 ° C, 65% luftfuktighet og 12/12 timers lys / mørk daglengde. Plasser om 1,500-2,000 medfly puppe i en 6 L bur. Bruke et bur med en messing mesh på den ene siden med hull som er små nok til å stimulere egglegging 42. Sette inn en svamp strimmel gjennom en liten åpning i buret base for å tilveiebringe fluer med vann ved hjelp av kapillarvirkning. Bruk en blandin…

Representative Results

Her kan vi rapportere to anvendelser av embryo mikroinjeksjon rettet mot den funksjonelle karakterisering av et gen av interesse (case 1), og ved generering av transgene stammer (Tilfelle 2), henholdsvis. Levering av dsRNA i embryoer å rakne gen-funksjon. Den innexin-5-genet koder for et gap-knutepunkt som, i insekter, uttrykkes spesifikt i de mannlige og …

Discussion

Mikroinjeksjon av nukleinsyrer i insekt embryoer er en universell teknikk som muliggjør både analysen av genfunksjon og bioteknologiske anvendelser.

Den nylige publisering av genomsekvenser fra et økende antall insektarter fører til et stort behov for verktøy for funksjonell karakterisering av gener ennå ukjent funksjon. RNA-interferens har vist seg å være en av de mest verdifulle metoder for å antyde molekyl funksjoner ⁴⁹ og embryo mikroinjeksjon letter disse studiene. <…

Materials

1 x injection Buffer	Buffer			0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5mM KCl
Construct Plasmid	DNA
Helper Plasmid	DNA
dsRNA	RNA			Phenol-Chloroform purified
Standard Larval food	Rearing Food			1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products  dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer’s yeast, 1 kg soft wheat bran
Carrot Larval Food	Rearing food			2.5 g Agar, 4 g Sodium Benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1L
Adult Food	Rearing food			yeast extract and sugar (1:10)
Microscope slides		Sigma-Aldrich	Z692247
Injection needles		Eppendorf	5242956000
Microloaders		Eppendorf	5242956003
Double slided tape
Whatman Black circle paper
Bleach	Generic reagent			Diluite 1:2 before use
Paintbrush (000)	Generic tool
Micromanipulator	Instrument	Narishige	MN-153
Microinjector	Instrument	Eppendorf	Femtojet
Adult cages	Generic tool
Halocarbon oil 700	Reagent	Sigma-Aldrich	H8898
Ceratitis capitata	Animal			The strain used is ISPRA