The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.
Middelhavet bananfluen (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) er et skadedyr arter med ekstremt høj landbrugs relevans. Dette er på grund af sin reproduktive adfærd: hunner beskadige den udvendige overflade af frugt og grøntsager, når de lægger æg og udklækkede larver lever af deres pulp. Wild C. capitata befolkninger er traditionelt styret gennem insekticid sprøjtning og / eller miljøvenlige metoder, den mest succesfulde er den sterile Insect Teknik (SIT). Den SIT afhængig masse-opdræt, stråling-baserede sterilisation og felt frigivelse af mænd, der bevarer deres evne til at parre sig, men ikke er i stand til at generere frugtbare afkom. Fremkomsten og den efterfølgende hurtige udvikling af bioteknologiske værktøjer, sammen med tilgængeligheden af medfly genomsekvens, har i høj grad styrket vores forståelse af biologien af denne art. Dette begunstigede spredning af nye strategier for genom manipulation, hvilket can anvendes på befolkningskontrol.
I denne sammenhæng, embryo mikroinjektion spiller en dobbelt rolle i at udvide værktøjskassen for medfly kontrol. Evnen til at interferere med funktionen af gener, der regulerer vigtige biologiske processer, ja, udvider vores forståelse af den molekylære maskineri, der understøtter medfly invasionsevne. Endvidere evnen til at opnå kimlinje-transformation letter produktionen af multiple transgene stammer, der kan testes for fremtidige anvendelser i marken i hidtil ukendte SIT indstillinger. Faktisk kan genetisk manipulation kan anvendes til at bibringe ønskede træk, der kan for eksempel anvendes til at overvåge steril mandlige ydeevne i marken, eller som kan resultere i tidligt liv-fase letalitet. Her beskriver vi en metode til at microinject nukleinsyrer i Medfly embryoner til at nå disse to mål.
Middelhavet bananfluen (medfly) Ceratitis capitata er en kosmopolitisk art at det ekstensive skader frugter og dyrkede afgrøder. Det hører til Tephritidae familien, som omfatter flere skadedyr arter, såsom dem, der tilhører slægterne Bactrocera og Anastrepha. Den medfly er de mest undersøgte arter af denne familie, og det er blevet en model, ikke kun for studiet af insekt invasioner 1, men også til optimering skadedyrsbekæmpelse strategier 2.
Den medfly er en multivoltine arter, der kan angribe mere end 300 arter af vilde og dyrkede planter 3,4. Skaden er forårsaget af både voksne og larvestadier: parret hunner gennembore overfladen af frugt til æglægning, så mikroorganismer til at påvirke deres kommercielle kvalitet, mens larver lever på pulp. Efter tre larvestadier, larver emerge fra værten og forpupper i jorden. Ceratitiscapitata viser en næsten verdensomspændende distribution, herunder Afrika, Mellemøsten, Western Australia, Central- og Sydamerika, Europa og områder i USA fem.
De mest almindelige strategier til begrænsning Medfly parasitære indebærer brug af insekticider (f.eks Malathion, spinosad) og miljøvenlige Steril Insekt Teknik (SIT) 6. Sidstnævnte fremgangsmåde omfatter frigivelse i naturen af hundredtusindvis af mænd ydede steril ved udsættelse for ioniserende stråling. Parringen af sådanne steriliserede hanner til vilde hunner resulterer i ingen afkom, hvilket medfører en reduktion i befolkningens størrelse, i sidste ende fører til udryddelse. Selv SIT har vist sig effektiv i flere kampagner over hele verden, dens store ulemper omfatter de høje omkostninger ved opdræt og sterilisering millioner af insekter til at blive frigivet. Mærkning af genudsatte individer er nødvendigt at skelne sterile fra vilde insekter fanget i området underovervågningsaktiviteter og det er i øjeblikket opnås ved hjælp af fluorescerende pulvere. Disse procedurer er dyre og har uønskede bivirkninger 7.
For at optimere og / eller for at udvikle mere effektive metoder til bekæmpelse af dette skadedyr, har medfly biologi og genetik blevet bredt udforsket af mange forskere verden over. Tilgængeligheden af medfly genomsekvens 8,9, vil lette hidtil ukendte undersøgelser på genfunktioner. RNA-interferens er et kraftfuldt værktøj til sådanne undersøgelser, og det kan opnås gennem mikroinjektion af dsRNA (dobbeltstrenget RNA) eller siRNA (lille interfererende RNA). Denne teknik er blevet anvendt, for eksempel for at vise, at kønsbestemmelse molekylære kaskade i C. capitata er kun delvist bevaret i forhold til den for Drosophila 10.
Udviklingen af protokoller til microinject Medfly embryoner tilladt C. capitata at være den første ikke-Drosophilid Fluearter at være genetisk modificeret. Som sine æg ligner dem af Drosophila, både med hensyn til morfologi og modstand mod udtørring 11, til protokollen levere plasmid DNA i præ-blastoderm embryoer først udviklet til D. melanogaster 12,13 blev oprindeligt indrettet til brug i C. capitata. Disse første forsøg tilladt medfly kimlinje-transformation baseret på det transposerbare element Minos 11. Efterfølgende blev det oprindelige system modificerede 14 ved anvendelse af andre transposon tilgange. Dette er tilfældet for piggyBac fra Lepidoptera Trichoplusia ni 15. Protokollen er siden blevet yderligere optimeret og dette har tilladt omdannelsen af andre tephritid arter 16-21 og også for mange andre Diptera 22-31. Alle disse systemer er baseret på anvendelsen af en typisk binære vektor / hjælper-plasmid transformation systemet: kunstig, defekt transposønner indeholdende ønskede gener samles til plasmid-DNA og integreres i genomet af insektet ved at give transposaseenzymet 32. En række transgene Medfly linjer er blevet genereret, med flere funktioner, herunder stammer, der bærer en betinget dominant letal gen, der inducerer letalitet, stammer, der producerer mandlige kun afkom og dermed ikke kræver yderligere kønsbestemmelse strategier, og stammer med fluorescerende sperm, der kan forbedre nøjagtigheden af SIT overvågningsfasen 33-37. Selv udgivelsen i naturen af transgene organismer er sket i pilotforsøg mod myg kun 38,39, er mindst én virksomhed evaluere en række transgene Medfly stammer for deres anvendelse i marken 40.
Embryo mikroinjektion kan også fremme udviklingen af nye genom-redigeringsværktøjer, såsom transskription aktivator-lignende effektor nukleaser (Talens), grupperet regelmæssigt spatierede korte palindrome gentagelser (CRISPR) / CRISPR protein 9 nuklease (Cas9) og målsøgende endonukleaserne gener (HEGs), som vil sætte nye evolutionære og udviklingsmæssige undersøgelser, samt udvide den tilgængelige bioteknologiske værktøjskasse. Genom-redigering tilgange allerede tilladt generation af gen-drivsystemer i myg 41, og deres overførsel til medfly er nært forestående. Her beskriver vi en universel protokol for mikroinjektion nukleinsyrer i Medfly embryoner, der kan være nyttige for alle de ovennævnte programmer.
Mikroinjektion af nukleinsyrer i insekt embryoer er en universel teknik, der fremmer såvel analysen af genfunktion og bioteknologiske anvendelser.
Den nylige offentliggørelse af genom-sekvenser fra et stigende antal insektarter fører til et presserende behov for værktøjer til funktionel karakterisering af gener af endnu ukendt funktion. RNA-interferens har vist sig at være en af de mest værdifulde metoder til at udlede molekylære funktioner 49 og embryo mikroinjektio…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank all the members of the “Insect Genetics and Genomics” Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia “IMPROVE” (FS).
1 x injection Buffer | Buffer | 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5mM KCl | ||
Construct Plasmid | DNA | |||
Helper Plasmid | DNA | |||
dsRNA | RNA | Phenol-Chloroform purified | ||
Standard Larval food | Rearing Food | 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer’s yeast, 1 kg soft wheat bran | ||
Carrot Larval Food | Rearing food | 2.5 g Agar, 4 g Sodium Benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1L | ||
Adult Food | Rearing food | yeast extract and sugar (1:10) | ||
Microscope slides | Sigma-Aldrich | Z692247 | ||
Injection needles | Eppendorf | 5242956000 | ||
Microloaders | Eppendorf | 5242956003 | ||
Double slided tape | ||||
Whatman Black circle paper | ||||
Bleach | Generic reagent | Diluite 1:2 before use | ||
Paintbrush (000) | Generic tool | |||
Micromanipulator | Instrument | Narishige | MN-153 | |
Microinjector | Instrument | Eppendorf | Femtojet | |
Adult cages | Generic tool | |||
Halocarbon oil 700 | Reagent | Sigma-Aldrich | H8898 | |
Ceratitis capitata | Animal | The strain used is ISPRA |