Consegna degli acidi nucleici attraverso Embrione microiniezione in tutto il mondo agricolo parassita,<em> Capitata Ceratitis</em
Summary
The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.
Abstract
La mosca mediterranea della frutta (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Ditteri: Tephritidae) è una specie di parassiti con altissima rilevanza agricola. Ciò è dovuto al suo comportamento riproduttivo: le femmine danneggiare la superficie esterna di frutta e verdura, quando depongono le uova e le larve si nutrono schiuse sulla loro polpa. Selvaggio C. popolazioni capitata sono tradizionalmente controllati attraverso insetticidi e / o approcci eco-friendly, il maggior successo è la tecnica sterile Insect (SIT). Il SIT deduce mass-allevamento, sterilizzazione radiometrica e abilitazione campo di maschi che mantengono la loro capacità di accoppiarsi, ma non sono in grado di generare progenie fertile. L'avvento e la conseguente rapido sviluppo di strumenti biotecnologici, insieme con la disponibilità della sequenza del genoma medfly, ha notevolmente aumentato la nostra comprensione della biologia di questa specie. Questo ha favorito la proliferazione di nuove strategie per la manipolazione del genoma, che can essere applicata al controllo della popolazione.
In questo contesto, embrione microiniezione gioca un duplice ruolo nell'espansione degli strumenti per il controllo della mosca della frutta. La capacità di interferire con la funzione dei geni che regolano i processi biologici chiave, infatti, amplia la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base invasività medfly. Inoltre, la capacità di raggiungere la trasformazione della linea germinale facilita la produzione di più ceppi transgenici che possono essere testati per le future applicazioni sul campo in contesti SIT romanzo. In effetti, la manipolazione genetica può essere utilizzata per conferire tratti desiderabili che possono, ad esempio, essere utilizzati per monitorare le prestazioni maschio sterile nel campo, o che può provocare nei primi mesi di vita letalità stadi. Qui si descrive un metodo per microinject acidi nucleici in embrioni medfly per raggiungere questi due obiettivi principali.
Introduction
La mosca della frutta mediterranea (medfly) Ceratitis capitata è una specie cosmopolita che estesamente danneggia frutta e coltivazioni. Appartiene alla famiglia Tephritidae, che comprende diverse specie di parassiti, come ad esempio quelli appartenenti ai generi Bactrocera e Anastrepha. La medfly è la specie più studiati di questa famiglia, ed è diventato un modello non solo per lo studio delle invasioni insetti 1, ma anche per ottimizzare le strategie di gestione dei parassiti 2.
Il medfly è una specie multivoltine che possono attaccare più di 300 specie di selvatici e piante coltivate 3,4. Il danno è causato da entrambi gli adulti ed i stadi larvali: femmine fecondate perforare la superficie del frutto per la deposizione delle uova, permettendo ai microrganismi di influenzare la qualità commerciale, mentre le larve si nutrono della polpa di frutta. Dopo tre stadi larvali, larve emergono dall'host e pupate nel terreno. Ceratitiscapitata mostra una distribuzione quasi tutto il mondo, tra cui l'Africa, il Medio-Oriente, Western Australia, Centro e Sud America, Europa, e le aree degli Stati Uniti 5.
Le strategie più comuni per limitare le infestazioni medfly comportano l'uso di insetticidi (ad esempio, Malathion, spinosad) e l'ecologico Sterile Insect Technique (SIT) 6. Il secondo approccio comporta il rilascio nell'ambiente naturale di centinaia di migliaia di maschi resi sterili da esposizione a radiazioni ionizzanti. L'accoppiamento di questi maschi sterilizzati alle femmine selvatiche si traduce in nessun progenie, causando una riduzione della dimensione della popolazione, portando infine alla eradicazione. Anche se SIT si è dimostrato efficace in più campagne in tutto il mondo, i suoi principali svantaggi sono gli alti costi di allevamento e sterilizzazione di milioni di insetti per essere rilasciato. Marcatura di esemplari rilasciati è necessario distinguere sterile da insetti selvatici catturati sul campo duranteattività di monitoraggio ed è attualmente realizzato con polveri fluorescenti. Queste procedure sono costose e hanno effetti collaterali indesiderati 7.
Al fine di ottimizzare e / o per sviluppare approcci più efficaci per il controllo di questo parassita, biologia e genetica medfly sono stati ampiamente esplorato da numerosi ricercatori di tutto il mondo. La disponibilità della sequenza del genoma medfly 8,9, faciliterà nuove indagini sulle funzioni dei geni. RNA interferenza è un potente strumento per tali studi e può essere raggiunto attraverso la microiniezione di dsRNA (RNA a doppio filamento) o siRNA (small interfering RNA). Questa tecnica è stata utilizzata, per esempio, per dimostrare che la determinazione del sesso cascata molecolare in C. capitata è solo parzialmente conservata rispetto a quello di Drosophila 10.
Lo sviluppo di protocolli per microinject embrioni medfly ammessi C. capitata di essere il primo nonspecie di mosca -Drosophilid da geneticamente modificati. Come le sue uova sono simili a quelli di Drosophila, sia in termini di morfologia e la resistenza all'essiccamento 11, il protocollo per fornire DNA plasmidico in embrioni pre-blastoderma primo sviluppati per D. melanogaster 12,13 inizialmente è stato adattato per l'uso in C. capitata. Questi primi esperimenti autorizzati medfly trasformazione della linea germinale in base all'elemento trasponibili Minos 11. Successivamente, il sistema originale è stato modificato 14 utilizzando altri approcci basati trasposoni. Questo è il caso del piggyBac dal Lepidoptera Trichoplusia ni 15. Il protocollo è stato poi ulteriormente ottimizzato e questo ha permesso la trasformazione di altre specie tephritid 16-21 e anche di molti altri Ditteri 22-31. Tutti questi sistemi si basano sull'impiego di un tipico / helper sistema plasmidico trasformazione binaria vettoriale: artificiale, Transpo difettosofigli contenenti geni desiderati vengono assemblati in DNA plasmidico e integrato nel genoma dell'insetto fornendo l'enzima trasposasi 32. Un certo numero di linee medfly transgenici sono stati generati, con molteplici funzioni, tra cui i ceppi che trasportano un condizionale gene dominante letale che induce letalità, ceppi produttori di soli uomini prole e quindi non richiedono strategie di sessaggio aggiuntivi, e ceppi con sperma fluorescente, che può migliorare la precisione della fase di monitoraggio SIT 33-37. Anche se il rilascio in natura di organismi transgenici è verificato nei test pilota contro le zanzare solo 38,39, almeno una società sta valutando una serie di ceppi medfly transgenici per il loro utilizzo in campo 40.
Embrione microiniezione può anche favorire lo sviluppo di nuovi strumenti di genoma-editing, come la trascrizione nucleasi attivatore simile effettrici (Talens), raggruppati regolarmente intervallati brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) / CRISPR proteina associata 9 nucleasi (Cas9) e endonucleasi homing geni (HEGs), che permetteranno nuovi studi evolutivi e di sviluppo, così come l'espansione degli strumenti biotecnologico disponibile. Genome-editing approcci già permesso la generazione di sistemi gene-drive in zanzare 41, e il loro trasferimento al medfly è imminente. Qui si descrive un protocollo universale per microinjecting acidi nucleici in embrioni medfly che possono essere utili per tutte le applicazioni di cui sopra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microiniezione di acidi nucleici in embrioni insetti è una tecnica universale che facilita sia l'analisi della funzione genica e applicazioni biotecnologiche.
La recente pubblicazione delle sequenze genomiche da un crescente numero di specie di insetti porta ad una necessità urgente di strumenti per la caratterizzazione funzionale dei geni di funzione ancora sconosciute. RNA-interferenza ha dimostrato di essere uno dei metodi più importanti per dedurre funzioni molecolari 49</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank all the members of the “Insect Genetics and Genomics” Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia “IMPROVE” (FS).
Materials
| 1 x injection Buffer | Buffer | 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5mM KCl | ||
| Construct Plasmid | DNA | |||
| Helper Plasmid | DNA | |||
| dsRNA | RNA | Phenol-Chloroform purified | ||
| Standard Larval food | Rearing Food | 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer’s yeast, 1 kg soft wheat bran | ||
| Carrot Larval Food | Rearing food | 2.5 g Agar, 4 g Sodium Benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1L | ||
| Adult Food | Rearing food | yeast extract and sugar (1:10) | ||
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | Z692247 | ||
| Injection needles | Eppendorf | 5242956000 | ||
| Microloaders | Eppendorf | 5242956003 | ||
| Double slided tape | ||||
| Whatman Black circle paper | ||||
| Bleach | Generic reagent | Diluite 1:2 before use | ||
| Paintbrush (000) | Generic tool | |||
| Micromanipulator | Instrument | Narishige | MN-153 | |
| Microinjector | Instrument | Eppendorf | Femtojet | |
| Adult cages | Generic tool | |||
| Halocarbon oil 700 | Reagent | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Ceratitis capitata | Animal | The strain used is ISPRA |
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