세계적인 농업 해충 곤충의 배아 미세 주입을 통해 핵산 배달,<em> Ceratitis의 capitata</em
Summary
The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.
Abstract
지중해 과실 파리 (medfly) Ceratitis capitata (WIEDEMANN) (파리목 : Tephritidae)은 매우 높은 농업 관련을 가진 해충 종입니다. 이는 생식 행동에 기인한다 : 그들은 계란과 펄프의 부화 유충 피드를 배치 할 때 여성은 과일과 야채의 외부 표면을 손상. 야생 C. capitata 인구는 전통적으로 분무 및 / 또는 환경 친화적 인 접근 방식이, 가장 성공적인은 멸균 곤충 기술 (SIT) 인 살충제를 통해 제어된다. 농성 대량 사육, 방사선 기반의 살균과 짝짓기를하는 능력을 유지하지만 비옥 한 자손을 생성 할 수없는 남성의 필드 자료에 의존한다. 출현과 함께 medfly 게놈 시퀀스의 가용성과 생명 공학 도구의 이후의 급속한 발전,이 종의 생물학에 대한 우리의 이해를 밀어 크게하고있다. 이 게놈 조작, 캘리포니아위한 새로운 전략의 확산을 선호N 인구 조절에인가 될 수있다.
이러한 맥락에서, 배아 미세 주입은 medfly 컨트롤의 도구 상자를 확장의 이중 역할을한다. 키 생물학적 과정을 조절하는 유전자의 기능을 방해 할 수있는 능력은, 참으로, medfly 침입을 기본 분자 기계에 대한 우리의 이해를 확장합니다. 또한, 배아 – 라인 변환을 달성하는 능력은 새로운 SIT 설정 미래 응용 분야에 대해 시험 할 수있는 다수의 형질 전환 균주의 제조를 용이하게한다. 실제로 유전자 조작은, 예를 들어, 현장에서 웅성 불임의 성능을 모니터링 할 수 바람직한 특성을 부여하기 위해 사용될 수 있으며, 또는 초기 생명 단계의 사멸을 초래할 수있다. 여기에서 우리는이 두 가지 목표를 달성하기 위해 medfly 배아로 핵산을 microinject하는 방법을 설명합니다.
Introduction
지중해 과실 파리는 (medfly) Ceratitis capitata는 국제적인 종 광범위하게 손상 과일과 재배 작물이다. 이 같은 장군 Bactrocera 및 Anastrepha에 속하는 것과 같은 여러 가지 해충 종을 포함 Tephritidae 가족에 속한다. medfly 패밀리의 대부분의 연구 종이며, 곤충 침입 (1)의 연구뿐만 아니라 해충 관리 전략을 최적화이 단지 모델이되었다.
medfly 300 개 이상의 야생의 종과 재배 식물 3,4를 공격 할 수있는 multivoltine 종입니다. 손상은 성인과 애벌레 단계 모두에 의해 발생 : 성관계 여성은 미생물이 상업적 품질에 영향을 미칠 수 있도록, 산란을 위해 과일의 표면을 관통, 과일 펄프의 애벌레 피드 반면. 세 애벌레 단계 후, 애벌레는 호스트에서 등장하고 토양에 번데기가되다. Ceratitis을capitata 아프리카, 중동, 웨스턴 오스트레일리아, 중남미, 유럽, 미국 (5)의 지역을 포함하여 거의 전 세계적으로 분포를 표시합니다.
가장 일반적인 전략 medfly 침략는 살충제의 사용을 포함하는 제한 (예를 들어, 말라 티온, 스피노 사드) 및 환경 친화적 해충 멸균 기법 (SIT) 6. 후자의 접근 방식은 조사를 이온화에 노출 멸균 렌더링 남성의 수천 수백의 야생으로 방출을 포함한다. 야생 암컷 같은 멸균 남성 정합 결국 박멸 선도 모집단 크기의 감소를 초래없이 자손을 초래한다. SIT는 전 세계 여러 캠페인에서 효과가 입증되었지만, 주요 단점은 양육 및 출시 될 곤충의 수백만 살균의 높은 비용을 포함한다. 출시 개인으로 표시하면 중에 분야에서 캡처 야생 곤충에서 멸균 구별 할 필요가있다활동을 모니터링하며, 현재 형광 분말을 사용하여 달성된다. 이러한 절차는 비용이 많이 드는 바람직하지 않은 부작용 (7)이있다.
순서 최적화 및 / 또는 해충의 제어를위한보다 효과적인 방법을 개발하기 위해서는, medfly 생물학 및 유전학 널리 전세계 많은 연구자들이 탐구되어왔다. medfly 게놈 서열 8, 9의 가용성, 유전자 기능에 대한 새로운 조사를 용이하게합니다. RNA 간섭은 이러한 연구를위한 강력한 도구이며 dsRNA를 (이중 가닥 RNA) 또는 siRNA를 (작은 간섭 RNA)의 미세 주입을 통해 달성 될 수있다. 이 기술을 보여주기 위해, 예를 들어, 사용 된 그 C.에서 결정 성 고분자 연쇄 capitata 일부만 초파리 (10)의에 대해 보존된다.
프로토콜의 발전은 C. 허용 medfly 배아 microinject 할 capitata이 아닌 첫 번째가 될 수 있습니다-Drosophilid 파리 종은 유전자 변형된다. 그 계란 11 탈수 양쪽 형태와 저항의 관점에서, 초파리와 마찬가지이기 때문에, 프로토콜은 제 D. 위해 개발 된 프리 배반 배아로 플라스미드 DNA를 전달하도록 melanogaster의 12, 13 C. 초기에 사용하도록했다 capitata. 이 첫 번째 실험은 transposable 요소 미노스 (11)에 따라 medfly 세균 라인 변환을 허용했다. 이어서, 원래의 시스템은 다른 트랜스포존 기반의 접근법을 사용하여 14 변형시켰다. 이것은 나비목 트리코 NI (15)로부터 피기 백하는 경우이다. 프로토콜은 이후 상기 최적화되었으며, 이는 많은 다른 파리목 22-31의 또 다른 tephritid 종의 16-21 변환 및 허가되었다. 모든 이러한 시스템은 일반적인 바이너리 벡터 / 헬퍼 플라스미드의 형질 전환 시스템의 사용에 의존한다 : 인공 결함을 견인원하는 유전자를 포함하는 아들은 플라스미드 DNA로 조립 및 트랜스 효소 (32)를 제공하여 곤충의 게놈에 통합되어 있습니다. 형질 medfly 라인의 수는 정확성을 향상시킬 수있는 형광 정자 균주 남성 만 자손을 생산하고, 따라서 추가적인 sexing 전략을 필요로하지 않으며, 균주 사멸을 유도하는 조건을 보이면서 치사 유전자를 운반하는 균주를 포함한 여러 기능과, 생성 된 농성 모니터링 단계 33-37의. 형질 전환 된 미생물의 야생에서 박리가 모기 만 (38, 39)에 대하여 파일럿 테스트에서 발생하지만, 하나 이상의 회사는 필드 (40)으로 사용하기위한 유전자 medfly 균주들을 평가하고있다.
배아 미세 주입도 (CR을 같은 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴 클레아 제 (TALENs), 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 팔린 드롬 반복 새로운 게놈 편집 도구의 개발을 선호 할 수 있습니다ISPR) / CRISPR 관련 단백질 (9) 뉴 클레아 제 (Cas9)과 새로운 진화 및 발달 연구를 활성화뿐만 아니라 가능한 생명 공학 도구 상자를 확장합니다 원점 복귀 엔도 뉴 클레아 유전자 (HEGs). 게놈 편집 방법은 이미 모기 41 유전자 드라이브 시스템의 생성을 허용하고 medfly 그들의 전송이 임박. 여기에서 우리는 위에서 언급 한 모든 응용 프로그램에 유용 할 수 있습니다 medfly 배아에서 핵산을 마이크로 인젝션위한 범용 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
곤충 배아 핵산 마이크로 인젝션은 유전자 기능 및 생물 공학적 응용 분석 모두를 용이하게하는 범용 기술이다.
곤충 종의 증가로부터 게놈 시퀀스의 최근 간행물은 아직 미지의 기능 유전자의 기능적 특성화 도구 시급 리드. RNA 간섭 분자 기능 (49)을 추론하기위한 가장 중요한 방법 중 하나 입증 배아 미세 주입이 연구를 용이하게하고있다.
플?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank all the members of the “Insect Genetics and Genomics” Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia “IMPROVE” (FS).
Materials
| 1 x injection Buffer | Buffer | 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5mM KCl | ||
| Construct Plasmid | DNA | |||
| Helper Plasmid | DNA | |||
| dsRNA | RNA | Phenol-Chloroform purified | ||
| Standard Larval food | Rearing Food | 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer’s yeast, 1 kg soft wheat bran | ||
| Carrot Larval Food | Rearing food | 2.5 g Agar, 4 g Sodium Benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1L | ||
| Adult Food | Rearing food | yeast extract and sugar (1:10) | ||
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | Z692247 | ||
| Injection needles | Eppendorf | 5242956000 | ||
| Microloaders | Eppendorf | 5242956003 | ||
| Double slided tape | ||||
| Whatman Black circle paper | ||||
| Bleach | Generic reagent | Diluite 1:2 before use | ||
| Paintbrush (000) | Generic tool | |||
| Micromanipulator | Instrument | Narishige | MN-153 | |
| Microinjector | Instrument | Eppendorf | Femtojet | |
| Adult cages | Generic tool | |||
| Halocarbon oil 700 | Reagent | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Ceratitis capitata | Animal | The strain used is ISPRA |
References
- Diamantidis, A. D., Carey, J. R., Nakas, C. T., Papadopoulos, N. T. Population-specific demography and invasion potential in medfly. Ecol. Evol. 1, 479-488 (2011).
- Augustinos, A. A., et al. Exploitation of the Medfly Gut Microbiota for the Enhancement of Sterile Insect Technique: Use of Enterobacter sp. in Larval Diet-Based Probiotic Applications. PLoS ONE. 10, e0136459 (2015).
- Liquido, N., Shinoda, L., Cunningham, R. Host plants of Mediterranean fruit fly: an annotated World review. Ann Entomol Soc Am. 77, 1-52 (1991).
- Szyniszewska, A. M., Tatem, A. J. Global assessment of seasonal potential distribution of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). PLoS ONE. 9, e111582 (2014).
- Malacrida, A. R., et al. Globalization and fruitfly invasion and expansion: the medfly paradigm. Genetica. 131, 1-9 (2007).
- Dyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. . Sterile Insect Technique: Principles and practice in Area-wide Integrated Pest Management. , (2005).
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
- Medfly Genome Annotation Groups. Available from: https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/medfly-genome-annotation-groups (2016)
- Pane, A., Salvemini, M., Delli Bovi, P., Polito, C., Saccone, G. The transformer gene in Ceratitis capitata provides a genetic basis for selecting and remembering the sexual fate. Development. 129, 3715-3725 (2002).
- Loukeris, T. G., Livadaras, I., Arcà, B., Zabalou, S., Savakis, C. Gene transfer into the medfly, Ceratitis capitata, with a Drosophila hydei transposable element. Science. 270, 2002-2005 (1995).
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
- Hoy, M. . Insect Molecular Genetics. An Introduction to Principles and Applications. , (2013).
- Christophides, G. K., Livadaras, I., Savakis, C., Komitopoulou, K. Two medfly promoters that have originated by recent gene duplication drive distinct sex, tissue and temporal expression patterns. Genetics. 156, 173-182 (2000).
- Handler, A. M., McCombs, S. D., Fraser, M. J., Saul, S. H. The lepidopteran transposon vector, piggyback, mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 7520-7525 (1998).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31, 199-205 (2001).
- Koukidou, M., et al. Germ line transformation of the olive fly Bactrocera oleae using a versatile transgenesis marker. Insect Mol Biol. 15, 95-103 (2006).
- Condon, K. C., et al. Germ-line transformation of the Mexican fruit fly. Insect Mol Biol. 16, 573-580 (2007).
- Raphael, K. A., et al. Germ-line transformation of the Queensland fruit fly, Bactrocera tryoni, using a piggyBac vector in the presence of endogenous piggyBac elements. Genetica. 139, 91-97 (2011).
- Meza, J. S., Nirmala, X., Zimowska, G. J., Zepeda-Cisneros, C. S., Handler, A. M. Development of transgenic strains for the biological control of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens. Genetica. 139, 53-62 (2011).
- Schetelig, M. F., Handler, A. M. Strategy for enhanced transgenic strain development for embryonic conditional lethality in Anastrepha suspensa. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9348-9353 (2012).
- Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
- Allen, M. L., O’Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38, 701-710 (2001).
- Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem Mol Biol. 32, 1211-1220 (2002).
- Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. J Biol Chem. 277, 8759-8762 (2002).
- Rodrigues, F. G., Oliveira, S. B., Rocha, B. C., Moreira, L. A. Germline transformation of Aedes fluviatilis (Diptera:Culicidae) with the piggyBac transposable element. Mem Inst Oswaldo Cruz. 101, 755-757 (2006).
- Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. J Vis Exp. , e216 (2007).
- Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti embryos to obtain transgenic mosquitoes. J Vis Exp. , e219 (2007).
- Concha, C., et al. Efficient germ-line transformation of the economically important pest species Lucilia cuprina and Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae). Insect Biochem Mol Biol. 41, 70-75 (2011).
- Takken, W., Scott, T. W. . Ecological Aspects for Application of Genetically Modified Mosquitoes. , (2003).
- Handler, A. M., Handler, A. M., James, A. A. An Introduction to the History and Methodology of Insect Gene Transfer. Insect transgenesis: methods and applications. , 3-26 (2000).
- Handler, A. M. A current perspective on insect gene transformation. Insect Biochem Mol Biol. 31, 111-128 (2001).
- Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
- Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). N Biotechnol. 25, 76-84 (2008).
- Schetelig, M. F., et al. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18171-18176 (2009).
- Schetelig, M. F., Caceres, C., Zacharopoulou, A., Franz, G., Wimmer, E. A. Conditional embryonic lethality to improve the sterile insect technique in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). BMC Biol. 7, 4 (2009).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochem Mol Biol. 43, 1-8 (2013).
- Lacroix, R., et al. Open field release of genetically engineered sterile male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS ONE. 7, e42771 (2012).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
- Leftwich, P. T., et al. Genetic elimination of field-cage populations of Mediterranean fruit flies. Proc. Biol. Sci. 281, (2014).
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-E6743 (2015).
- Economopoulos, A. P., Judt, S. Artificial Rearing of the Mediterranean Fruit Fly (Diptera: Tephritidae): Size of Oviposition Holes. J. Econ. Entomol. 82, 668-674 (1989).
- Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 13677-13681 (2011).
- Gilbert, L. . Insect Development. Morphogenesis, Molting and Metamorphosis. , (2009).
- Schetelig, M. F., Horn, C., Handler, A. M., Wimmer, E. A., Vreysen, M. J., Robinson, A., Hendrichs, J. . Area-Wide control of insect pests. From research to field implementation. , 85-93 (2007).
- Gabrieli, P., et al. Sex and the single embryo: early development in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Dev Biol. 10, 12 (2010).
- Tazuke, S. I., et al. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
- Gabrieli, P., Marois, E., Catteruccia, F., Benedict, M. Q. . Transgenic insects: techniques and applications. , 188-207 (2014).
- Scolari, F., et al. How functional genomics will impact fruit fly pest control: the example of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Genet. 15, S11 (2014).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
