Protocol
cuidados com os animais e experimentação foi realizada em conformidade com as orientações das autoridades locais suíços (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Berna, Suíça).
1. Prepare Soluções para Experimentos
- Preparar a solução de revestimento de matriz extracelular (ECM) (ver Tabela Material, ponto 6): mix Thaw ECM no gelo. Dilui-se a mistura 1:10 de ECM em meio de cultura de base (sem factores neurotróficos ou de Soro Fetal Bovino (FBS)) e guardar no gelo.
- Preparar o meio de cultura (ver Tabela Material, ponto 1): Prepare um estoque de meio Neurobasal não contendo FBS ou cérebro fator neurotrófico derivado (BDNF). Suplementar meios Neurobasal com FBS fresco (10%) e de BDNF (5 ng / ml) imediatamente antes da adição à cultura de células.
- Preparar a solução extracelular (ver Tabela Material, ponto 2).
2. Lavagem e Esterilização de acordos ambientais multilaterais
(Figura 1E). Cada um dos eléctrodos tem um tamanho de 40 x 40 um 2 com um afastamento de 200 um de centro a centro. Os eléctrodos são feitos de platina. Os eléctrodos estão ligados aos contactos correspondentes por um circuito feito de óxido de índio e estanho. Este circuito é isolado por uma camada de 5 mm de SU-8. Veja a tabela de materiais para obter detalhes sobre o provedor. Outras disposições de MEA pode ser adequado para estas experiências.
- Para os novos acordos ambientais multilaterais: Lave-os por imersão em etanol 70% por 30 segundos e lavar com água destilada por 30 seg. Trabalhar em uma capela de fluxo laminar.
- Deixe secar MEA por 30 min em uma capela de fluxo laminar.
- Coloque cada MEA em uma placa de Petri estéril indivíduo (35 mm x 10 mm) e selar com papel alumínio. Os MEAs podem ser armazenados até serem utilizados.
- Para AAM usados: Incubar as MEAs em uma placa de Petri (35 mm x 10 mm) contendo 1 ml de solut enzimáticaion (veja Materiais Mesa, ponto 6) O / N em agitador orbital à temperatura ambiente para remover o material biológico. Em seguida, continue como no passo 2.1.
NOTA: Manipular os acordos ambientais multilaterais com cuidado usando uma pinça com pontas cobertas de borracha.
3. Preparação de AAM para experimentos de cultura
- Remover a película de selagem e deixar a MEA na caixa de Petri (35 mm x 10 mm) para todo o experimento.
- Revestir as MEAs com a solução preparada de 1,1: Usar uma solução fria de 200 ul ponta da pipeta (armazenada a -20 ° C) para Pipetar 50 ul de solução de revestimento, para cada MEA, cobrindo a área do eléctrodo todo.
- Permitir meas para revestimento durante 30 min a 1 h à TA.
- Remover a solução de revestimento usando uma pipeta. Adicionar 100 ul de meio de cultura suplementado com 10% de FBS e 5 ng / ml de BDNF e deixá-lo à temperatura ambiente até o tecido do plaqueamento.
- Coloque 2 placas de Petri contendo os AAM revestidos em uma grande placa de Petri (94 mm x 16 mm) e adicionar uma terceira pequena placa de Petri contendo 1,5ml de tampão fosfato salino (PBS) para a humidificação.
NOTA: A adição de uma pequena placa de Petri (passo 3.5) contendo PBS é crucial para minimizar significativamente a evaporação do meio de cultura.
4. gânglio espiral Dissection
NOTA: dissecção Gross pode ser feito fora da capela de fluxo laminar (Passo 4.1 a 4.4). Para condições estéreis fina dissecção (capela de fluxo laminar) são de preenchimento obrigatório (a partir do passo 4.5).
- Euthanize animais (ratinhos de 5-7 dias de idade) por decapitação sem anestesia prévia.
- Esterilizar a cabeça por pulverização com 70% de etanol.
- Segurando a cabeça, cortar a ligação entre a pele eo crânio com uma tesoura afiada / afiada ao longo da linha sagital.
- Corte o crânio sagital e remover o cérebro usando uma tesoura afiada / sem corte.
- Cortar os ossos temporais do crânio e colocar aqueles em uma placa de Petri contendo gelo estéril de Hanks frio "Solução Salina Equilibrada (SSHE).
- Utilizando uma dissecçãomicroscópio ção, dissecar a bula timpânica usando uma pinça fina e isolar o ouvido interno.
- Retirar o osso da cóclea, usando uma pinça fina.
- Remova o ligamento espiral e estria vascular (SV), em conjunto, segurando com uma pinça a porção basal do gânglio espiral (SG) eo SV e lentamente desenrolando a SV da base -para-apex
- Isolar o órgão de Corti (OC), o SG eo modíolo (Figura 1A - C)
- Separe o OC do SG e modíolo, segurando com uma pinça a porção basal da SG e do OC e lentamente desenrolando a OC da base-a-ponta.
- Explantes laterais de corte (200 a 500 um de diâmetro) do gânglio espiral ainda ligado ao modiolus (Figura 1D), utilizando um fórceps e uma micro bisturi.
5. espiral Cultura Ganglion Explant em MEAs
- Coloque dois explantes do gânglio espiral próximos aos eléctrodos na MEA previamente preparado com 100 ul de meio de cultura.
- Coloque o órgão de Corti, aproximadamente, 5 mm de distância de área de eléctrodo.
- Use fórceps para fixar os explantes e o órgão de Corti para o MEA evitando ao mesmo tempo danificar o tecido.
- Coloque as MEAs cuidadosamente na incubadora e cultura a 37 ° C e 5% de CO 2. No dia seguinte, inspeccionar visualmente que os explantes foram ligados ao MEA.
NOTA: Se explantes não ter anexado O / N, eles raramente vai fazê-lo nos próximos dias. O OC é colocado adjacente à cultura para suporte trófico / neurotrófico. - Adicionar 100 ul de meio de cultura contendo 10% de FBS e o BDNF por dia durante 5 dias consecutivos.
- No dia 6, adiciona-se 2 ml de meio de cultura contendo 10% de FBS e 5 ng / ml de BDNF e cultura do tecido durante um período adicional de 13 dias.
6. eletrofisiológicos Gravações para investigar a atividade Dependente espontânea e eletrodo de estimulação
- Lava-se a cultura com MEA extracelular tãolução, preparado no passo 1.3, à TA.
- Seque os contactos com um lenço de papel e montar o MEA na configuração MEA.
NOTA: Para manter a cultura úmido durante a montagem, adicionar uma pequena gota de solução extracelular para a cultura. - Adicionar 300 ul de solução extracelular e esperar durante 10 min antes da gravação, para permitir que o sistema se estabilize.
- atividade espontânea recorde de 2 min de todos os pólos, pressionando sobre o registro botão do software / adquirir e identificar eletrodos de registro.
- Estimulação dos eletrodos MEA: Selecione a amplitude / duração / forma do estímulo sobre o software apropriado e aplicam-se a vários eletrodos consecutivamente como descrito 13. Selecione os eletrodos com base em os que apresentaram atividade espontânea (como no passo 6.4). Registro de todos os eletrodos restantes.
- Para excluir a estimulação artefato, estimulam a partir do mesmo eletrodo 10 vezes. Se a cultura responde, pelo menos, 8 de 10 vezes, pode-se assumir como umresposta positiva com a estimulação do eletrodo induzido.
- Para identificar o ruído de fundo, aplica A tetrodotoxina (TTX) a cultureat uma concentração de 1 | iM, para bloquear os canais de sódio dependentes da voltagem e registo durante 2 min. Use isto para realizar a detecção de pico (7.1 e 7.2).
Análise 7. Os dados
NOTA: A análise dos dados foi previamente descrito em detalhe em 6 e 5. Para detalhes sobre software utilizados neste estudo ver Materiais Mesa, ponto 7.
- Utilizando o software apropriado detectar atividade espontânea para cada eletrodo empregando um detector baseado em desvios-padrão e um discriminador subsequente. Este procedimento é descrito em 6. Atividade aparece transientes de tensão mais rápido (<5 ms).
- Escolha um limite que resulta em nenhuma atividade quando se analisa a TTX tratada samples.Adapt o valor limite para cada experimento para discriminar entre falso positive e detecções de falsos negativos.
- Utilizando o software apropriado observar a actividade neuronal detectada de cada eléctrodo como uma trama de varredura de acordo com procedimentos padrão (ver Figura 2A - C).
- Determinar e exibir a atividade total da rede somando-se todos os eventos detectados dentro de uma janela deslizante de 10 ms, desviado por passos de 1 ms.
- Detectar a atividade induzida por estimulação por exibir os dados brutos usando software de análise apropriado. Identificar os pontos individuais desligada manualmente. Picos individuais aparecem transientes mais rápido de tensão, que ocorreu após o artefacto de estimulação (cabeça de seta na Figura 2E). Um exemplo é mostrado na Figura 2E.
- Dependendo da experiência, analisar o número de eléctrodos que respondem, o limiar necessária para alcançar uma resposta, número de potenciais de acção por eléctrodos e de outros parâmetros de interesse 5.
8. Tissue Fixação e Immunohistochemistry
NOTA: O processo de coloração irá destruir o MEA. Veja a Tabela de materiais (ponto 4) para os reagentes.
- Logo após a gravação lavar as culturas com 37 ° C quentes PBS três vezes. Descartar o PBS e aplicam-se 4% de paraformaldeído (PFA) (em PBS), pré-aquecido a 37 ° C durante 10 min.
CUIDADO: PFA é tóxico. Trabalho em uma capa química com uma protecção adequada e uma solução de descarte de acordo com as orientações. - Lavam-se as culturas três vezes com PBS e bloquear com 2% de Albumina de Soro Bovino (BSA) em PBS (0,01% de Triton-X100) durante 2 h.
- Adicione o primeiro anticorpo (anti-tubulina βIII, anticorpo Tuj) diluída em PBS (2% de BSA e 0,01% de Triton-X100) e deixar O / N a 4 ° C. Lava-se a cultura por três vezes com PBS.
NOTA: A partir de agora manter a amostra no escuro o mais rápido possível para minimizar o branqueamento do anticorpo marcado com fluorescência secundária. - Adicionar o anticorpo secundário, diluiu-se em PBS (2% de BSA umad 0,01% de Triton-X100) e incubar durante 1 a 2 horas à temperatura ambiente. Para corar núcleos adicionar 1: 10.000 DAPI (1 mg / ml) durante 10 min.
- Lavar três vezes com PBS e montar as amostras para trás a lamelas finas (24 x 50 mm 2), utilizando o meio de montagem (ver Materiais Tabela, ponto 4). Imagem usando um microscópio de fluorescência com 5X e 20X de ampliação.
Representative Results
A Figura 1 resume o procedimento para o isolamento de tecido, e a preparação da cultura em MEA. Mostramos os passos consecutivos de dissecção de tecidos para isolar o gânglio espiral (SG) a partir do epitélio sensorial do órgão de Corti (OC) e estria vascular (SV) e anexa o ligamento espiral (Figura 1 A - C). Explantes do gânglio da espiral (3-4 em número) são cortados com micro-tesouras do gânglio como esquematicamente ilustrado na Figura 1D e colocado no MEA (Figura 1E), ao longo do eléctrodo de área de ocupado (2,2 mm2). A OC é colocado em proximidade, fora da superfície do eletrodo. O crescimento da cultura pode ser monitorizada ao longo do tempo (Figura 1G). Um diagrama esquemático do protocolo é demonstrado na Figura 1F. actividade electrofisiológica pode ser detectado após 6 dias de cultura, o que aumenta com o tempo a cultura prolongada. Nós somosecommend avaliação de 18 dias as culturas que produzem números significativamente maiores de eléctrodos de registo, em comparação com pontos de tempo anteriores 5.
Figura 1. preparação de cultura celular. (A) recentemente dissecados rato ouvido interno. Branco linha a tracejado que indica a localização da cóclea, linha a tracejado preto indica a região vestibular. Ouvido interno (B) do rato após a remoção da parede óssea da cóclea. giros cocleares são indicadas por linhas tracejadas brancos. (C) O gânglio espiral (SG) e modíolo, o órgão de Corti (OC) e os estria vascular (SV) e ligamento espiral são mostrados após a dissecação. (D) Esquema de SG e dissecção OC e preparação SG explante {figure adaptado de 5 com a aprovação da editora}. (E) Ilustração da matriz multi eléctrodo utilizado no presente estudo. recodificaçãoeléctrodos são organizados em uma grade retangular no centro e ocupam uma área de 2,2 mm2. eléctrodos 4 Terra e contatos secundários são ilustrados. (F) esquemática do protocolo de cultura. As gravações são realizadas no dia 18. (G) imagens representativas (imagens de campo claro) e esquemas de explantes SG sobre MEA monitorados em cultura no dia 1, 6 e 18. As barras de escala = 400 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.
actividade espontânea pode ser detectado no MEA e mostrado como um gráfico de quadriculação, onde cada linha do gráfico representa um pico detectado. Um exemplo representativo que mostra a actividade espontânea detectada a partir de vários eléctrodos (cores diferentes nos gráficos) é mostrado (Figura 2A, 2B, e 2C).
(Figura 2D), 5 eléctrodos de responder (traços vermelho) e eléctrodos não responder (traços azul) é mostrado na Figura 2E. Para estas experiências foi um eléctrodo utilizado para a estimulação e todos os outros eléctrodos para gravação. potenciais de ação individuais apareceu 1 ms após o artefato estimulação (cabeça de seta preta). O CME pode ser imunocoradas no final do processo, a fim de avaliar a cobertura dos processos neuronais sobre a área do eléctrodo. O eletrodo indicado em verde na Figura 2F foi usado para a estimulação, e os eletrodos indicados em vermelho foram usadas para registrar as respostas (Figura 2E).
Figura 2. gravações de dados sobre MEA. (A </ Strong>) Traços de gravações originais de seis em cada 63 eletrodos que mostram a atividade espontânea. Plot (B) Raster dos seis eletrodos de Figura 2A após a detecção de pico. Cada barra representa um potencial de ação. (C) enredo Raster incluindo todos os eletrodos (como em A e B) A atividade é gravado a partir de 63 eletrodos (canais de número 0-63) para 2 min. (D) Um estímulo bifásica com duração total de 80 ms e a amplitude de 80 mA foi usada para a estimulação da cultura a partir de um eléctrodo (E58 na Figura 2F). (E) Exemplo representativo de vestígios de dados brutos obtidos após a estimulação do eletrodo 58 mostrando os potenciais de ação (traços vermelhos) ou sem respostas (traços azuis) após a estimulação (seta-cabeça preta). (F) a cultura do gânglio da espiral no MEA imunocoradas para o marcador neuronal Tuj (verde) no final da experiência para visualizar neuro cobertura nal da área do eléctrodo {figure adaptado de 5 com a aprovação da editora}. Eletrodo 58 usado para a estimulação é indicado em verde, eléctrodos que respondem são indicados em vermelho. Barra de escala = 50 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Finalmente, a configuração MEA permite estudar possível modificação da superfície do eletrodo que podem aumentar a sensibilidade de gravação. Dois eléctrodos MEA disponíveis comercialmente foram utilizados neste estudo, com duas superfícies de platina diferentes: Cinzento platina (cinzento Pt), consistindo de um 150 camada de Pt nm de espessura (impedância: 400 KQ / 1 KHz) e platina negra, (preto, Pt), obtida por deposição electroquimica de Pt no final do processo de fabricação de micro-(impedância: 20 KQ / 1 KHz). Veja a Tabela de Materiais (ponto 6) para obter detalhes.
ent "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Seis experimentos MEA independentes foram realizadas por tipo de eletrodo Preto Pt MEA permite a detecção da atividade neuronal em um maior número de eléctrodos por MEA (Figura 3A) e redução da. a amplitude do estímulo necessária para provocar uma resposta (Figura 3B). analisou-se por 30-35 pares de eléctrodos independentes, em 6 experiências diferentes, o nível de corrente necessário para atingir uma resposta. preto eléctrodos de Pt tiveram um desempenho significativamente melhor que mostra um limiar de 31,09 μ um +/- 2,4 em comparação com os eléctrodos de Pt 47,57 Cinza μ a +/- 1,97.
Figura 3. Comparação de Cinza vs eletrodos Preto PT. Dois tipos de eletrodos (cinzento e preto Pt) foram comparados lado a lado com 12 culturas MEA independentes, 6 em cada tipo MEA. (A) O número total de reeletrodos corres- por experimento é mostrado. (B) limiar de amplitude para induzir uma resposta, medida utilizando 30-35 pares de eléctrodos independentes em 6 experiências independentes MEA é mostrado. Os dados são apresentados como média +/- DP. (Teste t de Student p <0,001) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O protocolo descrito aqui mostra como a cultura de explantes SGN no MEA e avaliar a actividade SGN por gravações não-invasivos extracelulares. Esta plataforma eo protocolo temos desenvolvido recentemente 5 permitir a identificação de novos protocolos de estimulação e materiais de eletrodo, resultando em exigências de energia reduzidas para ativar SGN, com potencial interesse para o prosseguimento da execução dos implantes cocleares e outros neuro-próteses. Várias precauções no procedimento apresentado são fundamentais para a realização de experimentos precisos e reprodutíveis.
dissecção cuidadosa do gânglio espiral e posterior manipulação do tecido primário requer um cuidado especial. Estas experiências foram realizadas usando murganhos C57 / Bl6 entre 5 e 7 dias de idade. Foram obtidos resultados semelhantes utilizando ratos Wistar na mesma faixa etária, (dados não mostrados). Acreditamos que esta é a melhor idade para dissecção bem como o osso coclear ainda está mole enOUGH para facilitar a remoção por meio de fórceps, e o gânglio espiral e órgão de Corti podem ser facilmente separados sem se romper processos dendríticos ou SGN somas. Em idades mais precoces do tecido é também macio e as possibilidades para rasgar o SGN somas em conjunto com o órgão de Corti é maior, enquanto que em fases posteriores, o endurecimento da cápsula óssea da cóclea aumenta o risco de danificar o tecido ao mesmo tempo de dissecação. isolamento adequado do SG assim como o corte cuidadoso dos explantes é crítica. Estes devem ser na gama de 200-500 uM em tamanho para maximizar a fixação à superfície da MEA e para ter um número suficiente de somas SG nos explantes, a partir do qual irá regredir neurites. Para aumentar o apoio neurotrófico nos dias iniciais da cultura, fresco BDNF é adicionado diariamente e o órgão de Corti é colocado em co-cultura.
A velocidade de dissecção é também importante. Todos os passos devem ser executados rapidamente e com soluções frias de gelo, a fim de minimizar a deterioração do tecido. oo tempo entre a eutanásia e colocar o explante sobre o MEA deve estar entre 10-15 min e é crucial para culturas bem sucedidas. Tem todas as ferramentas prontas, para evitar atrasos no chapeamento de cultura.
Todos os passos, incluindo dissecção fina, manutenção da cultura e a preparação de meio de equipamento e são realizadas sob condições estéreis. Quando o revestimento da MEA com a solução de ECM é importante para descongelar em gelo e utilizar pontas de pipeta de gelo-frio e forma gelada como os géis ECM mistura a temperaturas mais elevadas. Ao colocar os explantes na AAM, primeiro adicione a médio e as áreas dos eléctrodos, posteriormente, colocar os explantes. Se o meio é adicionado, num segundo passo, os explantes tendem a separar da MEA devido ao estresse de cisalhamento. Porque pequenos volumes de meio são aplicadas para a cultura em primeiros 5 dias, a evaporação do meio de cultura tem que ser minimizado. Por isso, é altamente recomendado para criar uma câmara úmida utilizando pequenas placas de Petri contendo PBS em estreita Proximdade para os AAM.
As experiências aqui descritas foram realizadas utilizando eletrodos MEA disponíveis comercialmente com dimensões específicas eletrodos, materiais de revestimento e distância eletrodo intra (como descrito no ponto 2, nota). As condições de cultura foram optimizados aqui, a fim de maximizar a cobertura neuronal da concepção específica da rede do eléctrodo. É possível que outras configurações de eléctrodos de espaçamento, geometrias e superfícies podem requerer diferentes revestimentos ou densidades celulares. Estes passos podem exigir solução de problemas inicial, a fim de alcançar as culturas de alta densidade.
Em relação às gravações electrofisiológicas, antes de iniciar as gravações a cultura é transferida do meio de cultura a 37 ° C a solução extracelular à TA. A fim de evitar as gravações instáveis, aguardar cerca de 10 minutos para permitir que a cultura a estabilizar. Ao estimular a cultura, um cuidado especial deve ser usado na escolha do estímulocomo amplitudes grandes (> 3 V) e durações podem causar danos à cultura. Para uma referência relativa a formas de impulso de estimulação e duração ver referência 5.
Para aquisição de dados e processamento de hardware caseiro (câmara de gravação, conexões para os amplificadores e amplificadores) foram usados e programas de análise específicos foram selecionados (ver Tabela Material, ponto 7). No entanto, outras configurações MEA comercial e outros pacotes de software são adequados, bem como para estas operações. Temos anteriormente avaliaram as respostas de nossas culturas em 3 pontos de tempo diferentes e mostrou um aumento da atividade com o tempo a cultura prolongada 5. Aqui sugerimos 18 dias in vitro para as gravações. MEA sistemas que permitem a gravação contínua em câmaras estéreis, humedecido, poderá facilitar a identificação dos pontos de tempo óptimo para cada tipo de cultura.
Uma grande desvantagem deste bioensaio é a alta variação no tele número de eléctrodos por cultura que mostram respostas à estimulação. Esta taxa de respostas à estimulação depende, principalmente, quatro factores: a densidade das neurites na cultura, os contactos entre as neurites e os eléctrodos, o diâmetro dos neuritos ou feixes de neurites, e a impedância dos eléctrodos. Em relação à densidade de neurites, apenas neurites que crescem ao longo, pelo menos, dois eléctrodos podem ser utilizados para experiências de estimulação. O contacto entre as neurites e eléctrodos depende do tecido envolvente que pode, por um lado, isolar as neurites a partir do eléctrodo e, assim, piorar o contacto, ou, por outro lado, isolar as neurites e o eléctrodo do banho envolvente e, assim, melhorar o contato. a densidade do tecido, bem como o tamanho de neurites, são definidos por o explante utilizado e as condições de cultura. culturas neuronais dissociadas também foram testados com sucesso mas a densidade neuronal nestas culturas é muito menor, o que resulta num número reduzido de recoeletrodos rding. Por conseguinte, a cultura de células deve ser adaptada à pergunta científica específica a ser tratada.
Finalmente, a impedância dos eléctrodos é determinada principalmente pelo tamanho e a superfície dos eléctrodos. Materiais, criando uma grande superfície, tais como negro de platina, como se mostra na Figura 3, diminuindo a impedância dos eléctrodos pode também melhorar o acoplamento entre os eléctrodos e as neurites 7-9.
Estratégias para melhorar a taxa de sucesso de, por conseguinte, incluem a estimulação da optimização das condições de cultura, o aumento do número total de eléctrodos ou eléctrodos de densidade e a modulação da superfície do eléctrodo 10.
Até agora, caracterização electrofisiológica de neurónios SG ter sido realizada utilizando técnicas de fixação de membranas. Isto permite gravações intracelulares de potenciais de ação e análise detalhada de correntes iônicas intracelulares deneurônios individuais. Aqui apresenta-se um bioensaio in vitro que pode ser usado para estudar os perfis de neurónios do gânglio da espiral de actividade por análise da actividade espontânea ou respostas à estimulação extracelular de muitos neurónios simultaneamente. Além disso, a interacção entre o eléctrodo e neurónios do gânglio da espiral pode ser estudado e optimizado pela aplicação de materiais modificados ou novos. Finalmente, mesmo que não seja mostrado aqui, esta plataforma pode ser utilizada em combinação com um eléctrodo externo, montado sobre um micromanipulador como recentemente mostrado pelo nosso grupo de 5, a fim de estudar a relação entre a distância da actividade do eléctrodo estimulante e cultura. Todos estes aspectos novos para permitir a imitação de eléctrodos principais características do implante coclear pode levar à concepção de novos dispositivos protéticos.
O nosso modelo é muito útil em ferramenta vitro para investigar estratégias para melhorar a eficácia da estimulação dos neurônios auditivos e ainda optecnologia CI timize. Uma vez que a técnica é dominada, pode-se imaginar triagem para modificação de um número de variáveis: a) populações neuronais diferentes, b) diferentes materiais de eletrodo / tamanho / impedâncias c) realizar experimentos crônicos para testar a toxicidade toxicidade material ou eletrodo-estimulação induzida, que poderia lançar luz sobre mais eficazes e seguros protocolos de estimulação por in vivo matrizes de eletrodos.
Acknowledgments
Os autores agradecem Ruth Rubli no Departamento da Universidade de Berna, Suíça Fisiologia por ajuda técnica valiosa com os experimentos. Este trabalho foi financiado em parte pelo programa EU-FP7-NMP (convenção de subvenção sem 281,056; NANOCI projeto - www.nanoci.org.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| culture medium | |||
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | 24 ml (for 25 ml) |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | 250 μl (for 25 ml) |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | 250 μl (for 25 ml) |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 500 μl (for 25 ml) |
| FBS | GIBCO | 10099-141 | 10% (for 25 ml) |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025/CF | final 5 ng/ml (for 25 ml) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| extracellular solution (pH 7.4) | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 4 mM | ||
| MgCl2 | 1 mM | ||
| CaCl2 | 2 mM | ||
| HEPES | 5 mM | ||
| Na-pyruvate | 2 mM | ||
| Glucose | 5 mM | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blocking solution | |||
| PBS | Invitrogen | 10010023 | |
| BSA | Sigma | A4503-50G | 2% |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | 0.01% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| TuJ | R&D Systems | MAB1195 | dil 1:200 |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
| Fluoreshild | Sigma | F6057 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plastic/tools | |||
| Petri dish 35 mm | Huberlab | 7.627 102 | |
| Petri dish 94 mm | Huberlab | 7.633 180 | |
| Dumont #5 tweezer | WPI | 14098 | |
| Dumont #55 tweezer | WPI | 14099 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Enzymatic solution: Terg-a-Zyme | Sigma | Z273287-11KG | |
| Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM | Corning | 356230 | |
| MEA electrodes | Qwane Biosciences | (Lausanne, Switzerland) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Labview | National Instruments | Switzerland | |
| IgorPro | WaveMetrics | Lake Oswega, USA |
References
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