Protocol
Hayvan bakımı ve deney İsviçre yerel yetkililer (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, İsviçre) kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Deney için Çözümler hazırlayın
- Buz üzerinde Çözülme ECM karışımı: hücre dışı matris (ECM) kaplama çözeltisi hazırlayın (Malzeme Tablosu, nokta 6). (Nörotrofik faktörler ve fetal sığır serumu (FBS) olmadan), temel kültür ortamında ECM karışımı 1:10 seyreltilir ve buz üzerinde muhafaza edin.
- (Malzeme Tablosu gelin 1'e bakınız) kültür ortamı hazırlayın: FBS veya beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) içermeyen Neurobasal orta bir stok hazırlayın. hemen önce hücre kültürüne ilave taze FBS (% 10) ve BDNF (5 ng / ml) ile, Neuro temelli ortam ilavesi.
- (Malzeme Tablosu gelin 2'ye bakınız) dışı çözüm hazırlayın.
ÇÇA 2. Yıkama ve Sterilizasyon
(Şekil 1E) içinde düzenlenmiş 68 elektrotları içermektedir. Her bir elektrot merkezden merkeze 200 um'lik bir mesafe ile 40 x 40 um bir 2 boyuta sahiptir. elektrotlar platin yapılır. Elektrotlar indiyum kalay oksit yapılmış bir devre ile ilgili kişiler bağlanır. Bu devre SU-8, 5 mikron tabaka ile izole edilmiştir. sağlayıcıya ilgili ayrıntılar için malzeme tabloya bakın. Diğer MEA düzenleri Bu deneyler için uygun olabilir.
- Yeni ölçümü için: 30 saniye için% 70 etanol içinde daldırarak durulayın ve 30 saniye süreyle damıtılmış su ile yıkayın. Laminer akış kaputu çalışın.
- Laminer akış kaputu 30 dakika MEA kurumasını bekleyin.
- Tek bir steril Petri kabı (35 mm x 10 mm) içine her MEA koyun ve folyo ile kapatın. kullanılana kadar taraflı çevre saklanabilir.
- Kullanılan ölçüm için: Enzimatik solut 1 ml ihtiva eden bir Petri kabı (35 mm x 10 mm) Meas inkübeiyon biyolojik materyali kaldırmak için oda sıcaklığında orbital çalkalayıcı üzerinde O / N (Malzeme Tablo, nokta 6). Sonra adım 2.1 olarak devam etmektedir.
NOT: bakım kauçuk kaplı ipuçları forseps kullanarak ÇÇA tutun.
Kültür Deney için ÇÇA 3. hazırlanması
- sızdırmazlık folyoyu çıkarın ve bütün deney için Petri kabındaki (35 mm x 10 mm) MEA bırakın.
- Kat 1.1 hazırlanan çözelti ile taraflı çevre: Bütün elektrot alanı kapsayan her MEA kaplama çözeltisi 50 ul pipetleme için (-20 ° C'de saklanan) soğuk 200 ul pipet kullanın.
- Oda sıcaklığında 30 dakika ile 1 saat boyunca kaplamak için ÇÇA izin verir.
- bir pipet kullanılarak kaplama çözeltisi çıkarın. % 10 FBS ve 5ng / ml BDNF ile takviyeli kültür ortamında 100 ul uygulayın ve doku kaplama kadar oda sıcaklığında bırakın.
- Büyük bir petri (94 mm x 16 mm) içine kaplı ÇÇA içeren 2 Petri kapları yerleştirin ve 1.5 içeren üçüncü küçük petri ekleyinnemlendirme Fosfat Tamponlu Salin ml (PBS).
Not: PBS içeren küçük bir petri (aşama 3.5) eklenmesi önemli ölçüde kültür ortamının buharlaşmasını en aza indirmek çok önemlidir.
4. Spiral Ganglion Diseksiyon
NOT: Brüt diseksiyon laminer akış kaputu dışında yapılabilir (4.4 4.1 Adım). ince diseksiyon steril koşullar (laminer akış kaput) için (adım 4.5 dan itibaren) zorunludur.
- önceden anestezi olmadan kafaları kesilmek suretiyle hayvanlar (5-7 gün eski fareler) euthanize.
- % 70 etanol ile püskürtülerek baş sterilize edin.
- kafa tutarak, cilt ve sagital hattı boyunca keskin / sivri makas ile kafatası arasındaki bağlantıyı kesti.
- sagittally kafatası kesin ve keskin / künt makas kullanarak beyin kaldırmak.
- kafatasından temporal kemik kesin ve steril, buz kadar soğuk Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ihtiva eden bir petri bu yerleştirin.
- Bir dissec kullanılmasıyon mikroskop, ince forseps kullanılarak timpanik bül incelemek ve iç kulak izole.
- ince forseps kullanarak, koklea kemiği kaldırmak.
- (SV) birlikte forseps ile spiral ganglion (SG) ve SV bazal kısmını tutarak ve yavaş yavaş-apeks -to tabanından SV gevşemek spiral ligament ve stria vaskularis kaldır
- Corti (OC) organı izole SG ve modiolus (Şekil 1A - C)
- forseps ile SG ve OC bazal kısmını tutarak ve yavaş yavaş tabanına-to-tepe noktasından OC gevşemek ile SG ve modiolus gelen OC ayırın.
- Spiral gangliyondan kesin yan eksplantlar (200 çapı um ila 500), yine, bir forseps ve bir mikro neşter kullanılarak modiolus (Şekil 1D) eklenmiş.
ÇÇA 5. Spiral Ganglion Eksplantasyon Kültür
- Daha önce 10 ile hazırlanan MEA elektrotlara önümüzdeki iki spiral ganglion eksplantları yerleştirinkültür ortamının 0 ul.
- yaklaşık 5 mm uzakta elektrot alanından Corti organı yerleştirin.
- doku zarar kaçınarak MEA üzerine eksplantlar ve Corti organı pin forseps kullanabilir.
- 37 ° C'de kuvöz ve kültürün içine dikkatlice ÇÇA yerleştirin ve% 5 CO 2. Ertesi gün, görsel eksplantlar MEA bağlı olduğunu kontrol edin.
NOT: eksplantlar O / N bağlı değil, nadiren önümüzdeki gün içinde yapacağız. OC trofik / nörotrofik destek kültür bitişik yerleştirilir. - Birbirini takip eden 5 gün süre ile,% 10 FBS ve BDNF gün içeren kültür ortamı 100 ul ekle.
- 6. günde ilave 13 gün boyunca% 10 FBS ve 5ng / ml BDNF ve kültür dokusu ihtiva eden kültür ortamı 2 ml ilave ediniz.
6. Elektrofizyolojik Kayıtlar Spontan ve Elektrot Uyarım Bağımlı Etkinliği Araştırma
- hücre-dışı MEA kültürü yıkama,dökülmesinden oda sıcaklığında, adım 1.3 hazırlanan.
- Bir doku ile temas kurutun ve MEA kurulumuna MEA monte edin.
NOT: montaj sırasında nemli kültürünü korumak kültüre ekstrasellüler çözüm küçük bir damla ekleyin. - ekstrasellüler çözüm 300 ul ekleyin ve sistem stabilize etmek için izin vermek, kaydetmeden önce 10 dakika bekleyin.
- kaydında basarak tüm elektrotlar 2 dakika süreyle kayıt spontan aktivite / yazılım butonuna kazanmak ve kayıt elektrotları tespit.
- MEA elektrot stimülasyon: Uygun yazılım üzerinde uyarıcı genlik / süresini / şekli seçin ve ardışık olarak 13 açıklanan çeşitli elektrotlar için geçerlidir. (Adım 6.4 gibi) spontan aktivite gösteren olanlar dayalı elektrotlar seçin. Kalan tüm elektrotların Tutanak.
- stimülasyon artefaktını dışlamak için, aynı elektrottan 10 kez uyarır. kültür 10 kez üzerinden en az 8 yanıt verirse, o kadar kabul edilebilirelektrot kaynaklı stimülasyon üzerine olumlu cevap.
- arka plan gürültü tanımlamak için, 1 mcM cultureat bir konsantrasyon Tetrodotoxin (TTX) uygulamak 2 dakika süreyle voltaj bağımlı sodyum kanallarını ve kayıt engellemek için. başak algılama (7.1 ve 7.2) gerçekleştirmek için bunu kullanın.
7. Veri analizi
Not: Veri analizi daha önce 6 ve 5'te detaylı bir şekilde tarif edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan yazılım üzerinde ayrıntılarına için malzemeler Masa, nokta 7 bkz.
- uygun yazılımı kullanarak standart sapma ve bir sonraki discriminator dayalı bir dedektör kullanılarak her elektrot için spontan aktivite tespit. Bu prosedür 6'da tarif edilmektedir. Etkinlik hızlı gerilim geçişlerini (<5 msn) görünür.
- sahte Ready arasında ayrım her bir deney için samples.Adapt eşik değerini tedavi TTX analiz ederken hiçbir aktivite ile sonuçlanan bir eşik seçinE ve yalancı negatif algılamaları.
- Kullanarak uygun yazılım standart prosedürlere (- C Şekil 2A) göre bir raster arsa olarak her bir elektrodun tespit edilen nöronal aktivitenin gözlemlemek.
- Belirleyin ve 1 msn adımlarla kaydırılır 10 msn kayar penceresi içinde algılanan tüm olayları, toplanarak toplam ağ etkinliğini gösterir.
- uygun analiz yazılımı kullanarak ham verilerini görüntüleyerek uyarma kaynaklı aktivite tespit. çevrimdışı elle tek ani belirleyin. Tek sivri stimülasyon artifact (Şekil 2E ok başı) sonra meydana gelen, hızlı gerilim transientler görünür. Bir örneği Şekil 2E'de gösterilmektedir.
- Deneye bağlı olarak, yanıt Elektrotların sayısı, bir yanıt elde etmek için gerekli bir eşik, elektrotlar ve ilgi 5 diğer parametreler her aksiyon potansiyelinin sayısı analiz eder.
8. Doku Fiksasyon ve Immunohistochemistry
NOT: boyama işlemi MEA yok edecektir. Reaktifler Malzeme Tablosu (nokta 4) Bkz.
- Doğrudan kayıt sonra 37 ° C sıcak PBS üç kez kültürleri yıkayın. PBS atın ve 10 dakika boyunca 37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış (PBS) içinde% 4 paraformaldehit (PFA), uygulanır.
UYARI: PFA zehirlidir. kurallarına göre uygun koruma ve atma solüsyonu ile kimyasal bir kaput çalışın. - PBS olan kültürler, üç kez yıkayın ve 2 saat süreyle PBS içinde% 2 sığır serum albümin (BSA) (% 0.01 Triton-X100) ile bloklayın.
- İlk antikor PBS (% 2 BSA ve% 0.01 Triton-X100) içinde seyreltilmiş (Anti βIII tubulin, Tuj antikoru) ilave edin ve 4 ° C'de O / N bırakın. PBS kültür üç kez yıkayın.
NOT: Şu anda ikincil floresan etiketli antikorun beyazlatma en aza indirmek için mümkün olduğunca sık karanlıkta örnek tutmak seçin. - PBS içinde seyreltilmiş sekonder antikor, ekleme (% 2 BSA, birD% 0.01 Triton-X100) ve oda sıcaklığında 1 ila 2 saat boyunca inkübe edilir. çekirdekleri 1 eklemek leke için: 10,000 DAPI (1 mg / ml stok), 10 dakika boyunca karıştırılır.
- PBS ile üç kez yıkayın ve ince kapak fişleri geriye örnekleri montaj (24 x 50 mm 2) montaj orta (Malzeme Tablo gelin 4) kullanılarak. 5X ve 20X büyütme ile bir floresan mikroskop kullanılarak görüntü.
Representative Results
Şekil 1 MEA doku izolasyonu, hazırlanması ve kültür prosedürü özetlemektedir. Biz Corti (OC) ve stria vaskularis (SV) organının duyusal epitelinden spiral ganglion (SG) izole etmek doku diseksiyonu ardışık adımları göstermektedir ve spiral ligament ekli (Şekil 1 A - C). Şematik Şekil 1D gösterilen ve elektrot işgal alanı (2.2 mm 2) üzerinde, MEA (Şekil 1E) üzerine yerleştirilmiş olarak spiral ganglion eksplantları (sayı 3-4) ganglion mikro-makas ile kesilir. OC elektrot yüzeyinin dışında, yakın yerleştirilir. Kültürünün büyüme süresi (Şekil 1G) üzerinden takip edilebilir. Protokolün bir şematik diyagramıdır Şekil 1F gösterilmiştir. Elektrofizyolojik aktivitesi uzamış kültür süresi ile artar 6 günlük bir kültürden sonra tespit edilebilir. Bizecommend erken zaman noktalarında 5 ile karşılaştırıldığında kayıt elektrotları önemli ölçüde daha yüksek sayıda üreten 18 gün kültürleri değerlendirirken.
Şekil 1. Hücre kültürü hazırlanması. (A) Taze fare iç kulak disseke. Beyaz çizgi Kokleanın yeri, siyah kesikli çizgi vestibüler bölgesini gösterir gösterir kesik. Koklear kemik duvarının çıkarılmasından sonra (b), fare iç kulak. Koklear döner beyaz kesik çizgilerle gösterilmiştir. (C) Spiral ganglion (SG) ve modiolus, Corti (OC) ve stria vaskularis (SV) ve spiral ligament organ diseksiyonu sonra gösterilmektedir. (D) SG ve OC diseksiyonu ve SG eksplant hazırlanması {yayıncı onayı ile 5 uyarlanan rakam} şematik. Bu çalışmada kullanılan çoklu elektrot dizisinin (E) Çizim. recodingelektrotlar merkezinde dikdörtgen bir ızgara düzenlenen ve 2,2 mm 2 lik bir alanı işgal edilir. 4 Zemin elektrotlar ve yan kontakları gösterilmektedir. Kültür protokolü (F) şematik. Kayıtlar gün 18. (G) Temsilcisi resimler (parlak bir alan görüntüler) ve 1 gün, 6 ve 18. Ölçek çubukları = 400 mikron kültürde izlenen MEA SG eksplant planları yapılmaktadır. Büyük halini görmek için tıklayınız bu figür.
Spontan aktivite MEA tespit ve arsa her satırı bir tespit başak temsil eden bir raster arsa olarak gösterilebilir. (Grafiklerde farklı renklerde) birçok elektrodlardan tespit spontan aktivite gösteren temsili bir örneği, (Şekil 2A, 2B ve 2C) de gösterilmiştir.
(Şekil 2D), stimülasyon için kullanılan bir iki fazlı vurum gösteren temsili bir örneği, 5 yanıt elektrotlar (kırmızı izleri) ve non-yanıt elektrotlar (mavi izleri) Şekil 2E'de gösterilmektedir. Bu deneyler için bir elektrot uyarılması ve kayıt için tüm diğer elektrot kullanılmıştır. Tek aksiyon potansiyelleri stimülasyon artifact (siyah ok başı) sonra 1 msn ortaya çıktı. MEA elektrot alanı üzerinde nöron kapsamını değerlendirmek için prosedürün sonunda boyanmış olabilir. Şekil 2F'de, yeşil belirtilen elektrot uyarılması için kullanılmıştır ve kırmızı belirtilen elektrotlar yanıt (Şekil 2E) kaydetmek için kullanılmıştır.
MEA Şekil 2. Veri kayıtları. (A </ Strong>) spontan aktivite gösteren altı 63 üzerinden elektrotlar orijinal kayıtların izleri. Başak algılama sonra Şekil 2A altı elektrotlar (B) Raster arsa. Her çubuk bir aksiyon potansiyeli temsil etmektedir. Elektrotlar faaliyeti (A ve B) de dahil olmak üzere (C) Tarama arsa 2 dakika boyunca 63 elektrotlar (kanal numarası 0-63) için kaydedilir. (D) toplam 80 mikro-saniye süresine ve 80 uA genliği ile bir iki fazlı uyarı için tek bir elektrot (Şekil 2F'de E58) kültür uyarılması için kullanılmıştır. (E) ya da uyarılmasından sonra yanıtları (mavi izleri olmadan) elektrodun aksiyon potansiyelleri (kırmızı izleri) gösteren 58 uyarıldıktan sonra elde edilen ham veri izleri Temsilcisi örneği (siyah ok kafalı). Nöro görselleştirmek için deney sonunda (F) nöronal belirteç Tuj (yeşil) immunohistokimyasal MEA Spiral ganglion kültürü elektrot alanının nal kapsama {figure yayıncı onayı ile 5 uyarlanmıştır}. uyarılması için kullanılan elektrot 58 yeşil gösterilir yanıt elektrotlar kırmızı ile gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 50 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Son olarak, MEA kurulum kayıt hassasiyetini artırabilir olası elektrot yüzey modifikasyonu incelemek için izin verir. 150 nm kalınlığında bir Pt tabakası (empedansı: 400 kH / 1 KHz) 'den oluşan, Gri Platinyum (Gri Pt): iki ticari olarak temin edilebilir MEA elektrotlar, iki farklı platin yüzeyi ile bu çalışmada kullanılmıştır ve siyah Platin (siyah, Pt), mikro üretim süreci (20 kH / 1 KHz empedansı) sonunda Pt elektrokimyasal birikmesi ile elde edilmiştir. Ayrıntılar için malzemeler Tablosu (madde 6) Bkz.
1 "> Altı bağımsız MEA deneyleri elektrot tipine göre gerçekleştirilmiştir Siyah Pt MEA MEA (Şekil 3A) başına elektrotlar daha yüksek sayıda nöronal aktivitenin tespiti için izin verir ve azaltma.:" keep-together.within sayfa = fo "ent bir yanıt (Şekil 3B) ortaya çıkarmak için gerekli olan bir uyarıcı genlik. Biz, 6 farklı deneylerde, 30-35, bağımsız elektrot çiftleri için bir yanıt elde etmek için gerekli akım eşiği analiz edilmiştir. Siyah Pt elektrotlar önemli ölçüde daha iyi 31.09 μ a bir eşik gösteren gerçekleştirilen Gri Pt elektrotlar 47.57 μ A +/- 1.97 oranla +/- 2.4.
Siyah Pt elektrotlar vs Grey 3. Karşılaştırılması Şekil. İki elektrot tipleri (Gri ve Siyah Pt) 12 bağımsız MEA kültürleri, her MEA tipine 6 kullanarak yan yana karşılaştırıldı. (A) re toplam sayısıDeneme başına sponding elektrotlar gösterilir. 6 bağımsız MEA deneylerinde 30-35 bağımsız elektrot çiftleri kullanılarak ölçüldü (B) bir yanıt ortaya çıkarmak için amplitüd eşik gösterilmiştir. Veriler ortalama +/- SD olarak gösterilmiştir. (Student t testi p <0.001) , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Burada açıklanan protokol nasıl MEA kültür SGN eksplantlar ve hücre dışı girişimsel olmayan kayıtları ile SGN aktivitesini değerlendirmek gösterir. Bu platform ve biz son zamanlarda koklear implant ve diğer nöro-protez uygulanmasına ilişkin potansiyel ilgi ile SGN etkinleştirmek için azaltılmış enerji gereksinimleri ile sonuçlanan yeni stimülasyon protokolleri ve elektrot malzemelerinin belirlenmesi için izin 5 geliştirdik protokol. sunulan prosedürde bazı önlemler doğru ve tekrarlanabilir deneyler başarı için esastır.
spiral ganglion ve primer doku daha fazla taşıma dikkatli diseksiyon özellikle dikkat gerektirir. Bu deneyler, 5 ile 7 gün arasında C57 / BL6 fareleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Benzer sonuçlar aynı yaş grubundaki Wistar sıçanları kullanılarak elde edilmiştir (veriler gösterilmemiştir). Biz koklear kemik tr hala yumuşak olduğu gibi bu ince diseksiyon için en iyi yaş olduğunu düşünüyorumough kolay forseps ile çıkarılması ve Corti spiral ganglion ve org için kolayca dendrit süreçleri veya SGN Somas zarar vermeden ayrılabilir. önceki yaşlarda doku çok yumuşak ve daha sonraki aşamalarda, koklea kemik kapsülün sertleşmesi diseksiyon sırasında doku zarar riskini artırırken Corti organı, yüksek olan şansı somas birlikte SGN rip. SG Uygun izolasyon yanı sıra eksplant dikkatli kesim önemlidir. boyutunda 200-500 um MEA yüzeye bağlanmak en üst düzeye çıkarmak ve nevritler tekrar çıkar olan eksplantlar, SG mis yeterli sayıda olması ve bu aralıkta olmalıdır. Kültürün ilk günlerinde nörotrofik desteğini arttırmak için, taze BDNF günlük eklenir ve Corti organı ko-kültür yerleştirilir.
Diseksiyon hızı önemlidir. Tüm adımlar, doku bozulmasını en aza indirmek için hızlı ve buz çözeltiler kullanılarak yapılmalıdır.ötanazi ve MEA eksplant yerleştirerek arasındaki zaman 10-15 dakika arasında olması ve başarılı kültürleri için çok önemlidir olmalıdır. kültür kaplama gecikmeleri önlemek için, tüm araçlar hazır.
ince diseksiyon, kültür bakım ve orta ve donanım hazırlanmasına dahil olmak üzere tüm adımları, steril koşullar altında gerçekleştirilir. ECM çözeltisi ile MEA kaplanması zaman buz üzerinde erimesine ve daha yüksek sıcaklıklarda ECM karışımı jeller buz soğukluğunda pipet uçları ve buz gibi soğuk bir ortam kullanılması önemlidir. ÇÇA üzerinde eksplantlar yerleştirirken, ilk sonradan eksplantlar yerleştirin elektrot alanlarına orta ekleyin. ortamı, ikinci bir aşamada eklenirse, eksplantlar MEA nedeniyle yırtılma gücüne ayırmak eğilimindedir. orta, küçük miktarlar ilk 5 gün kültüre uygulandığı için, kültür ortamı buharlaştırılması en aza indirilmesi gerekir. Nedenle son derece yakın Proxim içinde PBS içeren küçük petri kaplarına kullanarak nemlendirilmiş odasına oluşturmak için tavsiye edilirÇÇA için Sığ.
Burada tarif edilen deneyler özel elektrot boyutları, kaplama malzemeleri ve intra elektrot mesafesi (alanına 2'de tarif edildiği gibi, Not) ile ticari olarak temin edilebilir MEA elektrotlar kullanılarak yapıldı. kültür koşulları belirli elektrot ızgara tasarımı nöronal kapsama maksimize etmek için buraya optimize edilmiştir. Elektrot aralığı, geometri ve yüzey diğer düzenlemeler farklı kaplamalar ya da hücre yoğunlukları gerektirebilir mümkündür. Bu adımlar, yüksek yoğunluklu kültürleri elde etmek için, ilk sorun gerektirebilir.
Kültür oda sıcaklığında hücre dışı çözeltiye, 37 ° C'de kültür ortamından transfer kayıtları başlamadan önce, elektrofizyolojik kayıtları ile ilgili olarak. kararsız kayıtları önlemek için, kültür stabilize sağlamak için yaklaşık 10 dakika boyunca bekleyin. kültür uyarma olduğunda, özel dikkat uyaran seçiminde kullanılmalıdırgibi büyük genlikleri (> 3 V) ve süreleri kültürüne zarar verebilir. Uyarım darbe şekilleri ve süresi ile ilgili bir başvuru için, başvuru 5'e bakın.
Veri toplama ve işleme, ev yapımı donanım (kayıt odasına amplifikatörler ve amplifikatörler bağlantıları) için (Malzeme Tablosu gelin 7) kullanılmış ve spesifik analiz programları seçildi. Ancak, diğer ticari MEA kurulumları ve diğer yazılım paketleri bu işlemler için de uygundur. Daha önce 3 farklı zaman noktalarında eden kültürler tepkileri değerlendirildi ve uzun süreli, kültür süresi 5, artan bir aktivite göstermiştir. Burada kayıtları için in vitro 18 gün öneririz. Steril, nemli odalarında sürekli kayıtlar için izin MEA sistemleri, her kültür türü için en uygun zaman noktalarının belirlenmesini kolaylaştırabilir.
Bu biyoassay önemli bir dezavantajı t yüksek varyasyonUyarıya yanıtları göstermek kültür başına elektrot o numara. uyarıma tepkilerin Bu oran temel olarak dört faktöre bağlıdır: kültürdeki neurites yoğunluğu, neurites ve elektrotlar, neurites veya neurites demetleri çapı ve elektrotların empedansı arasındaki temaslar. nörit yoğunluk ile ilgili olarak, en az iki elektrot üzerinde büyüyebilir yalnızca nevritler stimülasyon deneyleri için de kullanılabilir. nöritlerin ve elektrotlar arasındaki iletişim bir yandan elektrot nevritlerin izole ve böylece diğer taraftan temas kötüye veya nöritler ve çevresindeki banyosundan elektrot izole etmek ve bu şekilde artırabilir çevreleyen doku bağlıdır iletişim. Doku yoğunluğu, hem de nörit büyüklüğü, kullanılan çıkarılması ve kültür koşulları ile tanımlanır. Ayrışmış nöronal kültürler de başarılı bir şekilde test edilmiş, ancak, bu kültürlerde nöronal yoğunluğu reco azaltılmış sayıda yol, çok daha düşüktür edilmiştirrding elektrotlar. Bu nedenle hücre kültürü ele alınacak belirli bilimsel soruya adapte edilmelidir.
Son olarak, elektrot impedansı başlıca boyutu ve elektrot yüzeyine verilir. Malzeme, Şekil 3'te de gösterildiği gibi, aynı zamanda elektrot ve nöritlere 7-9 arasındaki bağlantıyı iyileştirebilir elektrot empedansı azaltılması, örneğin siyah platinyum gibi geniş bir yüzey yaratır.
Stimülasyon başarı oranını artırmak için stratejiler nedenle kültür şartlarının optimizasyonu, toplam elektrotlar veya elektrotlar yoğunluğu sayısının artışı ve elektrot yüzeyine 10 modülasyonu içerir.
Şimdiye kadar, SG nöronlannm elektrofizyolojik karakterizasyon bağlantı klemp tekniği kullanılarak gerçekleştirilmiştir edilmiştir. Bu eylem potansiyellerinin hücre içi kayıtları ve hücre içi iyonik akımların detaylı analiz için izin verirTek nöronlar. Burada aynı zamanda bir çok nöronların hücre dışı uyarım kendiliğinden aktivitesini veya yanıtları analiz spiral ganglion nöronlarının aktivitesi profilleri incelemek için kullanılabilecek bir in vitro biyolojik tayini sunulmuştur. Ayrıca, elektrot ve spiral ganglion nöronları arasındaki etkileşim okudu ve modifiye edilmiş veya yeni malzemelerin uygulama tarafından optimize edilebilir. En son uyarıcı elektrot ve Kültür aktivitesi mesafesi arasındaki ilişkiyi incelemek üzere, grubumuz 5 ile gösterildiği gibi Son olarak, burada gösterilmemiş olan bile, bu platform bir dış elektrot ile bir arada kullanılabilir, bir mikromanipülatör monte edilebilir. koklear implant elektrotlar temel özellikleri taklit ederek yeni protez tasarımı yol açabilir için tüm bu yeni yönleri izin verir.
Bizim modelimiz işitsel nöronlar ve ileri op uyarılması etkinliğini artırmak için stratejiler araştırmak için in vitro aracında bir çok yararlıetkisinin optimize CI teknolojisi. teknik hakim sonra, tek bir değişken bir dizi değişiklik için tarama öngörülüyor: a) farklı nöron popülasyonu, B) farklı bir diğer elektrot malzemeleri / boyut / empedans c) Önemli toksisite ya da elektrot stimülasyonu kaynaklı toksisitesini test etmek amacıyla, kronik deneyler, burada in vivo elektrot dizileri tarafından güvenli ve daha etkili stimülasyon protokolleri ışık tutabilir.
Acknowledgments
Yazarlar deneylerle değerli teknik yardım için Bern, İsviçre Üniversitesi Fizyoloji Anabilim Dalı'nda Ruth ruble teşekkür ederim. Bu çalışma, AB-FP7-NMP programı (.; - Www.nanoci.org proje NANOCI hibe anlaşmasında no 281056) tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| culture medium | |||
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | 24 ml (for 25 ml) |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | 250 μl (for 25 ml) |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | 250 μl (for 25 ml) |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 500 μl (for 25 ml) |
| FBS | GIBCO | 10099-141 | 10% (for 25 ml) |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025/CF | final 5 ng/ml (for 25 ml) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| extracellular solution (pH 7.4) | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 4 mM | ||
| MgCl2 | 1 mM | ||
| CaCl2 | 2 mM | ||
| HEPES | 5 mM | ||
| Na-pyruvate | 2 mM | ||
| Glucose | 5 mM | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blocking solution | |||
| PBS | Invitrogen | 10010023 | |
| BSA | Sigma | A4503-50G | 2% |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | 0.01% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| TuJ | R&D Systems | MAB1195 | dil 1:200 |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
| Fluoreshild | Sigma | F6057 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plastic/tools | |||
| Petri dish 35 mm | Huberlab | 7.627 102 | |
| Petri dish 94 mm | Huberlab | 7.633 180 | |
| Dumont #5 tweezer | WPI | 14098 | |
| Dumont #55 tweezer | WPI | 14099 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Enzymatic solution: Terg-a-Zyme | Sigma | Z273287-11KG | |
| Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM | Corning | 356230 | |
| MEA electrodes | Qwane Biosciences | (Lausanne, Switzerland) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Labview | National Instruments | Switzerland | |
| IgorPro | WaveMetrics | Lake Oswega, USA |
References
- O'Donoghue, G. Cochlear implants--science, serendipity, and success. N Engl J Med. 369 (13), 1190-1193 (2013).
- Shepherd, R. K., Hatsushika, S., Clark, G. M. Electrical stimulation of the auditory nerve: the effect of electrode position on neural excitation. Hear Res. 66 (1), 108-120 (1993).
- Tykocinski, M., et al. Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays. Am J Otol. 21 (2), 205-211 (2000).
- Wilson, B. S., Dorman, M. F. Cochlear implants: current designs and future possibilities. J Rehabil Res Dev. 45 (5), 695-730 (2008).
- Hahnewald, S., et al. Response profiles of murine spiral ganglion neurons on multi-electrode arrays. J. Neural Eng. 13, (2015).
- Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).
- Heim, M., Yvert, B., Kuhn, A. Nanostructuration strategies to enhance microelectrode array (MEA) performance for neuronal recording and stimulation. J Physiol Paris. 106 (3-4), 137-145 (2012).
- Kim, R., Nam, Y. Novel platinum black electroplating technique improving mechanical stability. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 184-187 (2013).
- Cellot, G., et al. Carbon nanotubes might improve neuronal performance by favouring electrical shortcuts. Nat Nanotechnol. 4 (2), 126-133 (2009).
- Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nat Nano. 8 (2), 83-94 (2013).
