Protocol
טיפול ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות של הרשויות המקומיות השויצריות (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons ברן, שוויץ).
1. הכינו פתרונות לניסויים
- הכן את תאי מטריקס (ECM) פתרון הציפוי (ראה טבלת חומר, נקודה 6): תערובת הפשרת ECM על קרח. לדלל את תערובת ECM 1:10 ב בינוני תרבות הבסיסית (ללא גורמים neurotrophic או עוברי שור הסרום (FBS)) ולאחסן על קרח.
- הכן את המדיום תרבות (ראה טבלה חומר, נקודה 1): הכינו מלאי של מדיום Neurobasal לא המכילים FBS או גורם נוירוטרופי שמופק מהמוח (BDNF). מוסף התקשורת neurobasal עם FBS טרי (10%) ו BDNF (5 ng / ml) זמן קצר לפני הוספת תרבית תאים.
- הכן את הפתרון התאי (ראה טבלת חומר, נקודה 2).
כביסה 2. ועיקור של MEAs
ילדה = "jove_content"> הערה: MEAs המשמש הניסויים מכילים 68 אלקטרודות מסודרים ברשת מלבנית (איור 1E). לכל אלקטרודה בגודל של 40 x 40 מיקרומטר 2 עם מרווח של 200 מיקרומטר ממרכז למרכז. האלקטרודות עשויים פלטינה. האלקטרודות מחוברות המגעים המקבילים ידי מעגל עשוי פח תחמוצת אינדיום. מעגל זה הוא מבודד על ידי שכבת 5 מיקרומטר של SU-8. ראה טבלה מהותית לפרטים על הספק. פריסות MEA אחרות עשויות להיות מתאימות ניסויים אלה.
- עבור MEAs חדש: יש לשטוף אותם על ידי טבילה באתנול 70% למשך 30 שניות ולשטוף עם מים מזוקקים למשך 30 שניות. עבודה במנדף זרימה למינרית.
- תנו יבש MEA למשך 30 דקות במנדף זרימה למינרית.
- שים כל MEA לתוך צלחת פטרי סטרילית בודדת (35 מ"מ x 10 מ"מימ) ואת החותם עם רדיד. לשקילת משקל הג ניתן לאחסן עד בשימוש.
- עבור MEAs בשימוש: דגירה MEAs בצלחת פטרי (35 מ"מ x 10 מ"מ) המכילה 1 מ"ל של solut האנזימטיתיון (ראה חומרים טבלה, הצבע 6) O / N על שייקר מסלולית ב RT להסיר חומר ביולוגי. ואז להמשיך כמו בשלב 2.1.
הערה: טפלו MEAs בזהירות באמצעות מלקחיים עם עצות גומי מכוסה.
3. הכנת MEAs לניסויי תרבות
- מורידים את נייר הכסף איטום ולהשאיר את MEA בצלחת פטרי (35 מ"מ x 10 מ"מ) עבור הניסוי כולו.
- מעיל MEAs עם פתרון מוכן ב 1.1: השתמש קצה פיפטה קר 200 μl (מאוחסן ב -20 ° C) כדי pipet 50 μl של פתרון הציפוי לכל MEA, המכסה את אזור אלקטרודה כולו.
- אפשר MEAs כדי מעיל למשך 30 דקות עד 1 שעה ב RT.
- הסר את פתרון הציפוי בעזרת פיפטה. החל 100 μl של המדיום תרבות בתוספת 10% FBS ו 5ng / מ"ל BDNF ולהשאיר אותה ב RT עד ציפוי הרקמה.
- מניח 2 צלחות פטרי המכילות את MEAs מצופה לתוך צלחת פטרי גדולה (94 מ"מ x 16 מ"מ) ולהוסיף בצלחת פטרי קטנה שלישית המכילה 1.5מ"ל של בופר פוספט (PBS) עבור humidification.
הערה: הוספה בצלחת פטרי קטנה (שלב 3.5) המכילה PBS היא חיונית כדי למזער אידוי משמעותי של מדיום התרבות.
4. ספירלה גנגליון Dissection
הערה: לנתיחה ברוטו יכול להיעשות מחוץ למכסה המנוע זרימה למינרית (בשלב 4.1 כדי 4.4). לקבלת בתנאים סטריליים בסדר לנתיחה (ברדס זרימה למינרית) הינם שדות חובה (משלב 4.5).
- להרדים בעלי חיים (עכברים ישנים 5-7 ביום) על ידי עריפת ראש ללא הרדמה מוקדמת.
- לעקר את הראש על ידי ריסוס עם אתנול 70%.
- על ידי מחזיק את הראש, לחתוך את הקשר בין העור ואת הגולגולת עם מספריים חדים / חדה לאורך קו sagittal.
- חותכים את הגולגולת sagittally ולהסיר את המוח באמצעות מספריים חדים / בוטה.
- חותך את העצמות הזמניות מהגולגולת ומניח אותם בצלחת פטרי המכילה תמיסת המלח המאוזנת 'קר הנקס קרח סטרילי (HBSS).
- באמצעות dissecמיקרוסקופ tion, לנתח את הבולה התוף באמצעות מלקחיים בסדר ולבודד את האוזן הפנימית.
- הסר את העצם של השבלול, באמצעות מלקחיים בסדר.
- הסר את רצועת ספירלת stria vascularis (SV) יחד ידי החזקה עם מלקחיים חלקים של בסיס הגנגליון הספירלה (SG) ואת SV ולאט לאט לגלגל בנפרד את SV מבסיס -כדי-איפקס
- לבודד את האיבר של קורטי (OC), המזכ"ל ואת כִּישׁוֹר (איור 1 א - ג)
- הפרד את OC מן SG ו כִּישׁוֹר ידי החזקת עם מלקחיים החלק של הבסיס של SG ואת OC ולאט לאט לגלגל בנפרד את OC מהבסיס אל הקודקוד.
- Explants לרוחב חותכים (200 עד 500 מיקרומטר קוטר) מן הגנגליון ספירלה עדיין מחוברת כִּישׁוֹר (1D איור) באמצעות מלקחיים אזמל מיקרו.
5. תרבות ספירלה גנגליון explant על MEAs
- מניחים שתי explants גנגליון ספירלה ליד האלקטרודות על MEA הכין בעבר עם 100 μl של המדיום לתרבות.
- מניחים את האיבר של קורטי במרחק של כ 5 מ"מ מאזור האלקטרודה.
- שימוש במלקחיים כדי להצמיד את explants ואת האיבר של קורטי על MEA, תוך הימנעות פגיעה ברקמה.
- מניחים את MEAs בזהירות לתוך החממה ותרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. למחרת, חזותי לבדוק כי explants יש מצורף MEA.
הערה: אם explants לא מחובר O / N, שהם כמעט ולא יעשו זאת בימים הקרובים. The OC ממוקם סמוך התרבות לתמיכה trophic / neurotrophic. - הוספת 100 μl של מדיום התרבות המכיל 10% FBS ו BDNF ביום למשך 5 ימים רצופים.
- ביום 6 להוסיף 2 מ"ל של מדיום תרבות המכיל 10% FBS ו 5ng / מ"ל BDNF ותרבות הרקמה עבור 13 ימים נוספים.
קלטות אלקטרו 6. לחקור ספונטני גירוי אלקטרודה פעילות Dependent
- שטוף את תרבות MEA עם תאיים כךlution מוכן בשלב 1.3, ב RT.
- לייבש את המגעים בעזרת רקמות הר MEA על התקנת MEA.
הערה: כדי לשמור על התרבות והלחה במהלך ההרכבה, להוסיף טיפה קטנה של פתרון תאי לתרבות. - הוספת 300 μl של פתרון תאי ולחכות 10 דקות לפני ההקלטה, כדי לאפשר למערכת כדי לייצב.
- שיא פעילות ספונטנית למשך 2 דקות מכל האלקטרודות על ידי לחיצה על ההקלטה / לרכוש כפתור של התוכנה ולזהות אלקטרודות הקלטה.
- גירוי אלקטרודה MEA: בחר את משרעת / משך / צורה של גירוי על התוכנה המתאימה ולהחיל לכמה אלקטרודות ברציפות כמתואר 13. בחר את האלקטרודות בוסס על אלה מראים פעילות ספונטנית (כמו בשלב 6.4). שיא מכל האלקטרודות הנותרים.
- כדי לא לכלול חפץ גירוי, לעורר מאותו אלקטרודה 10 פעמים. אם התרבות מגיבה לפחות 8 מתוך 10 פעמים, ניתן להניח את זה בתורתשובה חיובית על גירוי הנגרם האלקטרודה.
- כדי לזהות את רעשי הרקע, להחיל tetrodotoxin (TTX) אל cultureat בריכוז של 1 מיקרומטר, כדי לחסום תעלות נתרן מתח מגודרת ולהקליט למשך 2 דקות. השתמש באפשרות זו כדי לבצע זיהוי ספייק (7.1 ו -7.2).
ניתוח 7. נתונים
הערה: ניתוח נתונים תוארה בעבר בהרחבה 6 ו -5. לקבלת פרטים על תוכנה השתמשו במחקר זה ראה חומרי טבלה, צבע 7.
- באמצעות התוכנה המתאימה לזהות פעילות ספונטנית של כל אלקטרודה העסיקה גלאי המבוסס על סטיות תקן מאבחן שלאחר מכן. הליך זה מתואר 6. פעילות מופיעה ארעי מתח מהר ככל (<5 msec).
- בחר סף כי התוצאות לא פעילות בניתוח TTX מטופלים samples.Adapt ערך הסף עבור כל ניסוי להפלות בין positiv שוואדואר ו לתגליות שליליות כוזבות.
- התוכנה המתאימה באמצעות יצפה בפעילות העצבית מזוהה של כל אלקטרודה כמזימה סריקה על פי נהלים קבועים (ראה איור 2 א - ג).
- לקבוע ולהציג את פעילות הרשת הכולל מסיכום כל האירועים זוהה בתוך חלון הזזה של 10 מילי-שניות, מוזז על ידי 1 צעדים msec.
- זיהוי פעילות הנגרמת גירוי על ידי הצגת הנתונים הגולמיים באמצעות תוכנת ניתוח מתאימה. זהה את הקוצים היחידים מחובר באופן ידני. קוצים בודדים מופיעים ארעי מתח מהר ככל, שהתרחשו לאחר חפץ הגירוי (ראש חץ באיור 2E). דוגמה לכך היא שמוצג באיור 2E.
- בהתאם הניסוי, לנתח את מספר אלקטרודות להגיב, הסף הדרוש כדי להשיג תגובה, מספר פוטנציאל פעולה לכל אלקטרודות ופרמטרים אחרים בעלי עניין 5.
רקמות 8. קיבוע Immunohistochemistry
הערה: התהליך המכתים יהרוס את MEA. ראה חומר שולחן (4 נקודות) עבור חומרים כימיים.
- מייד לאחר ההקלטה לשטוף את התרבויות עם 37 מעלות צלזיוס פעמים חמות שלוש PBS. בטל PBS וליישם 4 Paraformaldehyde% (PFA) (PBS), שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
זהירות: PFA הוא רעיל. עבודה במנדף כימי עם הגנה מתאימות פתרון שנזרק על פי הנחיות. - שטפו את התרבויות שלוש פעמים עם PBS ולחסום עם 2% שור סרום אלבומין (BSA) ב- PBS (0.01% Triton-X100) עבור 2 שעות.
- מוסיפים את הנוגדן הראשון (Anti-βIII טובולין, נוגדן TUJ) מדולל PBS (BSA 2% ו 0.01% Triton-X100) ולהשאיר O / N ב 4 ° C. שטפו את התרבות שלוש פעמים עם PBS.
הערה: מעתה ואילך לשמור על המדגם בחושך לעתים קרובות ככל האפשר כדי למזער הלבנה של נוגדני fluorescently שכותרתו המשניים. - מוסיפים את נוגדנים משני, מדולל PBS (BSA 2%ד 0.01% Triton-X100) ו דגירה של 1 עד 2 שעות ב RT. כדי להכתים גרעינים להוסיף 1: 10,000 DAPI (1 מ"ג / ml המלאי) במשך 10 דקות.
- לשטוף שלוש פעמים עם PBS ו הר דגימות אחורה כדי תלושי לכסות דק (24 x 50 מ"מ 2) באמצעות הרכבה בינונית (ראה חומרים טבלה, הצבע 4). תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם הגדלה 5X ו 20X.
Representative Results
איור 1 מסכם את הליך בידוד רקמות, הכנה והתרבות על MEA. אנו מציגים את השלבים הרצופים של דיסקציה רקמות לבודד הגנגליון הספירלה (SG) מן האפיתל החושית של האיבר של קורטי (OC) ו vascularis stria (SV) וספחנו רצועת ספירלה (איור 1 א '- ג'). Explants גנגליון ספירלה (3-4 במספר) נחתכים עם מספריים מיקרו מן גנגליון כמו סכמטי באיור 1D והניח על MEA (איור 1E), מעל לאיזור אלקטרודה (2.2 מ"מ 2). The OC מושם בסמיכות, מחוץ פני האלקטרודה. הצמיחה של התרבות ניתן לנטר לאורך זמן (איור 1G). תרשים סכמטי של הפרוטוקול מוצג באיור 1F. ניתן לאתר פעילות אלקטרו לאחר 6 ימים של תרבות, מגדילות עם זמן תרבות ממושך. אנו recommend להערכת 18 תרבויות יום אשר מייצרים מספרים גבוהים יותר באופן משמעותי של אלקטרודות הקלטה לעומת נקודות מוקדם יותר זמן 5.
הכנת תרבית תאים באיור 1.. (א) גזור טרי אוזן עכבר פנימית. לבן קו מקווקו מציין את המיקום של השבלול, קו מקווקו שחור מציין באזור שיווי המשקל. (ב) אוזן פנימית עכבר לאחר הסרת הקיר הגרמי השבלול. פניות שבלול מסומנות על ידי קווים מקווקוים לבנים. (ג) גנגליון ספירלה (SG) ו כִּישׁוֹר, האיבר של קורטי (OC) ואת vascularis stria (SV) וגידים ספירלה מוצגים לאחר דיסקציה. (ד) סכמטי של SG ו לנתיחה OC והכנת explant SG {דמות מותאמת 5 באישור המו"ל}. (ה) איור של מערך אלקטרודות רב השתמשו במחקר זה. סימול מחדש אלקטרודות מאורגנים ברשת מלבנית במרכז לכבוש שטח של 2.2 מ"מ 2. 4 אלקטרודות קרקע וקשרים בצד מומחשות. (F) סכמטי של פרוטוקול התרבות. הקלטות מבוצעות יום 18. (G) תמונות נציג (תמונות בשדה בהירות) וערכות של explants SG על MEA פיקוח בתרבות ביום 1, 6 ו -18 ברי סולם = 400 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
ניתן לאתר פעילות ספונטנית על MEA והראתה כמזימת סריקה שבו כל שורה של העלילה מייצגת ספייק זוהה. דוגמא מייצגת מראת פעילות ספונטנית זוהתה מכמה אלקטרודות (צבעים שונים הגרפים) מוצגת (איור 2A, 2B, ו 2C).
-together.within-page = "1"> בנוסף, ניתן להשתמש אלקטרודות MEA כדי לעורר את התרבות. דוגמא מייצגת מראה דופק biphasic משמש גירוי (איור 2 ד), 5 אלקטרודות להגיב (עקבות אדומות) שאינו מגיב אלקטרודות (עקבות כחולות) מוצגות באיור 2E. בניסויים אלה אלקטרודה אחד שמש גירוי וכל אלקטרודות האחרות להקלטה. פוטנציאל פעולה יחיד הופיע 1 msec לאחר חפץ הגירוי (ראש חץ שחור). את MEA ניתן immunostained בסוף ההליך על מנת להעריך את הכיסוי של תהליכים עצביים מעל האזור האלקטרודה. האלקטרודה המסומן בירוק האיור 2F שמש גירוי, ואת אלקטרודות מצוינת אדום שמשה כדי להקליט תגובות (איור 2E).
איור 2. הקלטות נתונים על MEA. (א </ Strong>) עקבות של הקלטות מקוריות של שישה מתוך 63 אלקטרודות מראות פעילות ספונטנית. (ב) העלילה סריקה של שישה האלקטרודות של איור 2A לאחר זיהוי ספייק. כל עמודה מייצגת פוטנציאל פעולה אחד. (C) עלילת סריקה כולל כל אלקטרודות (כמו A ו- B) פעילות נרשמה מ 63 אלקטרודות (ערוצי מספר 0-63) למשך 2 דקות. (ד) גירוי biphasic עם משך הזמן הכולל של 80 μsec משרעת של 80 מיקרו-אמפר שימש גירוי של תרבות מן האלקטרודה אחד (E58 באיור 2F). (E) דוגמא מייצגת של עקבות נתונים גולמיות המתקבלות לאחר הגירוי מן האלקטרודה 58 מראה פוטנציאל פעולה (עקבות אדומות) או ללא תגובות (עקבות כחולות) לאחר הגירוי (חץ-ראש שחור). (F) תרבות הגנגליון ספירלה על MEA immunostained עבור סמן העצבי TUJ (הירוק) בסוף הניסוי לדמיין נוירו כיסוי סופי של אזור אלקטרודה {דמות מותאמת 5 באישור המו"ל}. אלקטרודה 58 המשמשת גירוי מסומנת בירוק, אלקטרודות להגיב המסומנים באדום. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
לבסוף, התקנת MEA מאפשרת לחקר שינוי פני האלקטרודה אפשרי שעלולות להגביר את רגישות הקלטה. שתי זמינה מסחרי אלקטרודות MEA שמשה במחקר זה עם שני משטחי פלטינה שונים: פלטינום גריי (Grey Pt), מורכב 150 שכבת Pt ננומטר העבה (עכבה: 400 קילו-אוהם / 1 KHz) ושחור פלטינום, (שחור, Pt), מתקבל על ידי בתצהיר אלקטרוכימיים של Pt בסוף תהליך מיקרו-ייצור (עכבה: 20 קילו-אוהם / 1 קילוהרץ). ראה חומרי הטבלה (נקודה 6) לפרטים.
אף אוזן גרון "FO: keep-together.within-page =" 1 "> שישה ניסויי MEA עצמאיים בוצעו לפי סוג אלקטרודה MEA השחור Pt מאפשר זיהוי של פעילות עצבית על מספר גבוה יותר של אלקטרודות לכל MEA (איור 3 א) וצמצום. משרעת הגירוי הדרוש כדי לעורר תגובה (איור 3 ב). נתחנו עבור 30-35 זוגות אלקטרודה עצמאיים, ב 6 ניסויים שונים, הסף הנוכחי הנדרש כדי להשיג תגובה. אלקטרודות השחורה Pt בצעה באופן משמעותי טוב יותר מראה סף של 31.09 μ +/- 2.4 לעומת אלקטרודות גריי Pt 47.57 μ +/- 1.97.
איור 3. השוואה של גריי vs אלקטרודות שחור Pt. שני סוגים של אלקטרודות (אפור ושחור Pt) הושוו זה לצד זה באמצעות 12 תרבויות MEA עצמאית, 6 על כל סוג MEA. (א) המספר הכולל של מחדשאלקטרודות sponding לכל ניסוי מוצגת. (ב) סף משרעת כדי לעורר תגובה, הנמדד על 30-35 זוגות אלקטרודה עצמאיים 6 ניסויי MEA עצמאיים מוצג. הנתונים מוצגים כפי SD +/- Mean. (P t מבחן סטודנט <0.001) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מראה כיצד תרבות explants SGN על MEA ולהעריך פעילות SGN ידי הקלטות תאיות לא פולשנית. פלטפורמה זו והפרוטוקול שפתחנו לאחרונה 5 לאפשר זיהוי של פרוטוקולי גירוי רומן וחומרים אלקטרודה שמניבים דרישות אנרגיה מופחתות להפעיל SGN, עם ריבית פוטנציאל מימוש נוסף של שתלי שבלול ו-תותבות נוירו אחרות. אמצעי זהירות מספר הנוהל שהוצג הם יסוד עבור ההישג של ניסויים מדויקים לשחזור.
דיסקציה הזהירה של הגנגליון הספירלה לטיפולה של הרקמה העיקרית מחייבת זהירות מיוחדת. ניסויים אלה בוצעו באמצעות עכברים C57 / BL6 בין 5 ל 7 ימים. תוצאות דומות התקבלו באמצעות חולדות Wistar באותו טווח גילאים, (מידע לא מוצג). אנו מאמינים כי זהו הגיל הטוב ביותר עבור לנתיחת קנס כמו עצם השבלול הוא עדיין רך enough להסרה קלה בעזרת מלקחיים, ואת הגנגליון ספירלה האיבר של קורטי ניתן להפריד בקלות ללא פקיעת תהליכים דנדריט או somas SGN. בגילים מוקדמים יותר הרקמה היא רכה מדי והסיכויים לקרוע את SGN somas יחד עם האיבר של קורטי הוא גבוה, בעוד בשלבים מאוחר יותר, ההתקשות של הקפסולה הגרמי של השבלול מעלה את הסיכון של פגיעה ברקמה תוך ביתור. בידוד נכון של SG כמו גם חיתוך זהיר של explants הוא קריטי. אלה צריכים להיות בטווח של 200-500 מיקרומטר בגודל למקסם מצורף אל פני השטח MEA וכדי יש מספר מספיק של SG somas ב explants, שממנו neurites יחל לצמוח מחדש. כדי להגביר את התמיכה נוירוטרופי בימים הראשונים של תרבות, BDNF הטרי מתווסף יומי ואת האיבר של קורטי מושם שיתוף תרבות.
המהירות לנתיחה היא גם חשובה. כל הצעדים צריכות להתבצע במהירות באמצעות פתרונות קרים קרח כדי למזער הידרדרות רקמה. הזמן בין המתת חסד הצבת explant על MEA צריך להיות בין 10-15 דקות והיא חיונית עבור תרבויות מוצלחות. יש את כל הכלים מוכנים, כדי למנוע עיכובים ציפוי תרבות.
כל השלבים, כוללים לנתיחת קנס, תחזוקה של התרבות והכנה בינוני וציוד מבוצעים בתנאים סטריליים. כאשר ציפוי MEA עם פתרון ECM חשוב להפשיר אותו על קרח ולהשתמש טיפים פיפטה קר כקרח ובינוני קר כקרח כמו ג'לים ECM התמהיל בטמפרטורות גבוהות. כאשר נחת explants על MEAs, ראשון להוסיף מדיום לאזורי אלקטרודה, ובהמשך למקם את explants. אם המדיום הוא הוסיף בשלב שני, explants נוטה להתנתק MEA בשל גז מתח. בגלל כמויות קטנות של מדיום מוחלות על התרבות ב 5 ימים ראשונים, אידוי של מדיום התרבות צריך להיות ממוזער. לכן מומלץ מאוד כדי ליצור תא humidified על ידי צלחות פטרי קטנות המכילות PBS ב Proxim הקרובity אל MEAs.
הניסויים שתוארו כאן בוצעו באמצעות אלקטרודות MEA זמינות מסחרי עם ממדים אלקטרודה ספציפית, חומרי ציפוי ומרחק אלקטרודה תוך (כמתואר בסעיף 2 קטנים, הערה). תנאי תרבות מוטבו כאן כדי למקסם את הכיסוי עצבי של עיצוב רשת אלקטרודה הספציפי. יתכן כי בתצורות אחרות של מרווח אלקטרודה, גיאומטריות ומשטחים עשויות לדרוש ציפויים שונים או צפיפות תא. צעדים אלה עשויים לדרוש פתרון בעיות ראשוניות על מנת להשיג תרבויות בצפיפות גבוהה.
בדבר הקלטות אלקטרו, לפני תחילת הקלטות התרבות מועברת ממדיום התרבות ב 37 ° C עד פתרון תאי ב RT. על מנת להימנע הקלטות יציבות, לחכות כ 10 דקות כדי לאפשר התרבות לייצב. כאשר מגרה את התרבות, זהירות מסוימת יש להשתמש בבחירת הגירויאמפליטודות גדול כמו (> 3 V) ו משכי עלול לגרום נזק התרבות. לקבלת הפניה לגבי צורות דופק גירוי ומשך ראה התייחסות 5.
לרכישת נתונים וחומרת תוצרת בית עיבוד (תא הקלטה, חיבורי המגברים והמגברים) שמשו ותוכניות ניתוח ספציפיות נבחרו (ראה טבלת חומר, נקודת 7). עם זאת, הגדרות MEA המסחרית אחרות חבילות תוכנה אחרות המתאימים כמו גם עבור פעולות אלה. הערכנו בעבר התגובות של תרבותנו ב -3 נקודות זמן שונות והראיתי פעילות מוגברת עם זמן תרבות הממושכת 5. כאן אנו מציעים 18 ימים במבחנה להקלטות. מערכות MEA המאפשרות הקלטות רציפות בתאי סטרילי, humidified, יכולות להקל על זיהוי של נקודות הזמן האופטימליות לכל סוג התרבות.
חסרון עיקרי של המבדק הזה הוא הווריאציה הגבוהה ב tהוא מספר אלקטרודות לכל תרבות המראה תגובות לגירויים. שיעור זה של תגובות לגירויים בעיקר תלוי ארבעה גורמים: הצפיפות של neurites בתרבות, המגעים בין neurites ואת אלקטרודות, הקוטר של neurites או צרורות neurites, ואת העכבה של האלקטרודות. לגבי צפיפות neurite, רק neurites הגדלים על פני לפחות שתי אלקטרודות יכול לשמש בניסויים גירוי. הקשר בין neurites ואלקטרודות תלוי הרקמה שמסביב שיכול מחד לבודד את neurites מן האלקטרודה, ובכך להחמיר את הקשר, או, מצד שני, לבודד את neurites לבין אלקטרודה מהאמבטיה שמסביב ובכך לשפר איש הקשר. צפיפות רקמה, כמו גם גודל neurite, מוגדרת על ידי explant המשמש ואת תנאי התרבות. תרבויות עצביות ניתקו גם נבדקו בהצלחה אבל צפיפות עצבית בתרבויות אלה היא נמוכה בהרבה, וכתוצאה מכך מספר מופחת של recoאלקטרודות rding. לכן תרבות התא צריכה להיות מותאמת לשאלה המדעית הספציפית לטפל.
לבסוף, העכבה של אלקטרודות ניתנת בעיקר על ידי גודל השטח של אלקטרודות. חומרים, יצירת משטח גדול כגון פלטינה שחורה, כפי שמוצג באיור 3, ומקטין את העכבה של אלקטרודות עשוי גם לשפר את הצימוד בין אלקטרודות neurites 7-9.
אסטרטגיות כדי לשפר את שיעור ההצלחה של גירוי ולכן כוללים אופטימיזציה של תנאי התרבות, העלייה של מספר אלקטרודות מוחלט או צפיפות האלקטרודות ואת אפנון של פני האלקטרודה 10.
עד כה, אפיון אלקטרו של נוירונים SG נעשה תוך שימוש בטכניקות מהדק תיקון. זה מאפשר הקלטות תאיות של פוטנציאל פעולה וניתוח מפורט של זרמים יוניים תאיים מנוירונים בודדים. כאן אנו מציגים מבדק במבחנה, שניתן להשתמש בם כדי ללמוד פרופילי פעילות של נוירונים גנגליון ספירלה באמצעות ניתוח פעילות ספונטנית או תגובות לגירויים תאיים של נוירונים רבים בו זמנית. בנוסף, האינטראקציה בין האלקטרודה נוירונים גנגליון ספירלה ניתן ללמוד אופטימיזציה על ידי יישום של חומרים מהונדסים או חדש. לבסוף, גם אם לא מוצג כאן, פלטפורמה זו ניתן להשתמש בשילוב עם אלקטרודה חיצוני, רכוב על micromanipulator כמוצג לאחרונה על ידי הקבוצה שלנו 5, על מנת ללמוד את הקשר בין המרחק של פעילות אלקטרודה ותרבות מגרה. כל היבטי רומן אלה מאפשרים החיקוי של תכונות עיקריות של אלקטרודות שתלו שבלול עשוי להוביל את העיצוב של תותבי רומן.
המודל שלנו הוא מאוד שימושי בכלי במבחנה לחקור אסטרטגיות כדי לשפר את היעילות של גירוי של נוירונים שמיעתיים אופ נוספתטכנולוגית CI timize. לאחר הטכניקה שולטת, אפשר לדמיין הקרנה עבור שינוי של מספר משתנה: א) אוכלוסיות נוירונים שונות, ב) אלקטרודה חומרים שונות / גודל / עכבות ג) לבצע ניסויים כרוניים לבדוק רעילויות חומר או האלקטרודה גירוי רעילות מושרה, אשר יכול לשפוך אור על פרוטוקולי גירוי בטוחים ויעילים יותר על ידי מערכי אלקטרודות in vivo.
Acknowledgments
המחברים מודים רות Rubli במחלקה לפיזיולוגיה של אוניברסיטת ברן, שוויץ לעזרה טכנית יקר עם הניסויים. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי התוכנית של האיחוד האירופי FP7-NMP (הסכם מענק לא 281,056; פרויקט NANOCI - www.nanoci.org.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| culture medium | |||
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | 24 ml (for 25 ml) |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | 250 μl (for 25 ml) |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | 250 μl (for 25 ml) |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 500 μl (for 25 ml) |
| FBS | GIBCO | 10099-141 | 10% (for 25 ml) |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025/CF | final 5 ng/ml (for 25 ml) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| extracellular solution (pH 7.4) | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 4 mM | ||
| MgCl2 | 1 mM | ||
| CaCl2 | 2 mM | ||
| HEPES | 5 mM | ||
| Na-pyruvate | 2 mM | ||
| Glucose | 5 mM | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blocking solution | |||
| PBS | Invitrogen | 10010023 | |
| BSA | Sigma | A4503-50G | 2% |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | 0.01% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| TuJ | R&D Systems | MAB1195 | dil 1:200 |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
| Fluoreshild | Sigma | F6057 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plastic/tools | |||
| Petri dish 35 mm | Huberlab | 7.627 102 | |
| Petri dish 94 mm | Huberlab | 7.633 180 | |
| Dumont #5 tweezer | WPI | 14098 | |
| Dumont #55 tweezer | WPI | 14099 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Enzymatic solution: Terg-a-Zyme | Sigma | Z273287-11KG | |
| Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM | Corning | 356230 | |
| MEA electrodes | Qwane Biosciences | (Lausanne, Switzerland) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Labview | National Instruments | Switzerland | |
| IgorPro | WaveMetrics | Lake Oswega, USA |
References
- O'Donoghue, G. Cochlear implants--science, serendipity, and success. N Engl J Med. 369 (13), 1190-1193 (2013).
- Shepherd, R. K., Hatsushika, S., Clark, G. M. Electrical stimulation of the auditory nerve: the effect of electrode position on neural excitation. Hear Res. 66 (1), 108-120 (1993).
- Tykocinski, M., et al. Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays. Am J Otol. 21 (2), 205-211 (2000).
- Wilson, B. S., Dorman, M. F. Cochlear implants: current designs and future possibilities. J Rehabil Res Dev. 45 (5), 695-730 (2008).
- Hahnewald, S., et al. Response profiles of murine spiral ganglion neurons on multi-electrode arrays. J. Neural Eng. 13, (2015).
- Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).
- Heim, M., Yvert, B., Kuhn, A. Nanostructuration strategies to enhance microelectrode array (MEA) performance for neuronal recording and stimulation. J Physiol Paris. 106 (3-4), 137-145 (2012).
- Kim, R., Nam, Y. Novel platinum black electroplating technique improving mechanical stability. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 184-187 (2013).
- Cellot, G., et al. Carbon nanotubes might improve neuronal performance by favouring electrical shortcuts. Nat Nanotechnol. 4 (2), 126-133 (2009).
- Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nat Nano. 8 (2), 83-94 (2013).
