Protocol
La cura degli animali e la sperimentazione è stata eseguita in conformità con le linee guida delle autorità locali svizzere (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Berna, Svizzera).
1. Preparare Soluzioni per esperimenti
- Preparare la soluzione di rivestimento matrice extracellulare (ECM) (vedi tabella Materiale, punto 6): mix Disgelo ECM sul ghiaccio. Diluire il mix ECM 1:10 in terreno di coltura di base (senza fattori neurotrofici o siero fetale bovino (FBS)) e memorizzare sul ghiaccio.
- Preparare il terreno di coltura (vedi tabella Materiale, punto 1): Preparare uno stock di media Neurobasal non contenenti FBS o il cervello derived neurotrophic factor (BDNF). Supplemento supporti Neurobasal con FBS freschi (10%) e BDNF (5 ng / ml) appena prima di aggiungere alla coltura cellulare.
- Preparare la soluzione extracellulare (vedi tabella Materiale, punto 2).
2. lavaggio e sterilizzazione di MEA
(Figura 1E). Ciascun elettrodo ha una dimensione di 40 x 40 micron 2 con una spaziatura di 200 micron da centro a centro. Gli elettrodi sono fatti di platino. Gli elettrodi sono collegati ai corrispondenti contatti da un circuito in ossido di indio-stagno. Questo circuito è isolato da uno strato 5 micron di SU-8. Vedere la tabella Materiale per i dettagli sul fornitore. Altri layout MEA possono essere adatti per questi esperimenti.
- Per i nuovi MEA: Sciacquare immergendolo in etanolo al 70% per 30 secondi e lavare con acqua distillata per 30 sec. Lavorare in una cappa a flusso laminare.
- Lasciate asciugare MEA per 30 minuti in una cappa a flusso laminare.
- Mettere ogni MEA in un individuo piastra di Petri sterile (35 mm x 10 mm) e sigillare con un foglio. Le MEA possono essere memorizzati fino al momento dell'utilizzo.
- Per MEA usati: incubare le MEA in una capsula di Petri (35 mm x 10 mm) contenente 1 ml di soluzioni pe enzimaticalitio (vedi Materiali Tavolo, punto 6) O / N su agitatore orbitale a temperatura ambiente per rimuovere il materiale biologico. Quindi continuare come al punto 2.1.
NOTA: Maneggiare le MEA con cura utilizzando una pinza con punte in gomma-coperto.
3. Preparazione di MEA per esperimenti di coltura
- Rimuovere la lamina di sigillatura e lasciare il MEA nella scatola di Petri (35 mm x 10 mm) per l'intero esperimento.
- Rivestire le MEA con la soluzione preparata al punto 1.1: Usare un raffreddore 200 microlitri punta della pipetta (conservato a -20 ° C) da Dispensare 50 ml di soluzione di rivestimento per ogni MEA, che copre l'intera area degli elettrodi.
- Lasciare MEA a cappotto per 30 minuti a 1 ora a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione di rivestimento con una pipetta. Applicare 100 ml di terreno di coltura supplementato con 10% FBS e 5 ng / ml BDNF e lasciarlo a temperatura ambiente fino a quando la placcatura del tessuto.
- Mettere 2 piastre di Petri contenenti le MEA rivestiti in una grande capsula di Petri (94 mm x 16 mm) e aggiungere una terza piccola capsula di Petri contenente 1,5ml di tampone fosfato (PBS) per l'umidificazione.
NOTA: L'aggiunta di una piccola capsula di Petri (passo 3,5) contenente PBS è fondamentale per ridurre in modo significativo l'evaporazione del terreno di coltura.
4. ganglio spirale Dissection
NOTA: la dissezione lordo può essere fatto al di fuori della cappa a flusso laminare (Passo da 4.1 a 4.4). Per le condizioni di sterilità multa dissezione (cappa a flusso laminare) sono obbligatori (dal punto 4.5).
- Eutanasia degli animali (5-7 giorni di età topi) per decapitazione senza previa anestesia.
- Sterilizzare la testa a spruzzo con il 70% di etanolo.
- Mantenendo il capo, tagliare la connessione tra la pelle e il cranio con una forbice tagliente / tagliente lungo la linea sagittale.
- Tagliare il cranio sagittalmente e rimuovere il cervello usando forbici affilate / smussato.
- Tagliare le ossa temporali dal cranio e mettere quelli in una capsula di Petri contenente una soluzione salina bilanciata sterile ghiaccio freddo Hanks '(HBSS).
- Usando una dissezionemicroscopio zione, sezionare la bolla timpanica utilizzando una pinza sottile e isolare l'orecchio interno.
- Rimuovere l'osso della coclea, utilizzando una pinza sottile.
- Rimuovere il legamento a spirale e stria vascularis (SV) insieme tenendo con una pinza la parte basale del ganglio spirale (SG) e la SV e rilassarsi lentamente la SV dalla base-to-apice
- Isolare l'organo del Corti (OC), la SG e il modiolus (Figura 1A - C)
- Separare il OC dalla SG e modiolus tenendo con una pinza la parte basale del SG e l'OC e rilassarsi lentamente la OC dalla base-a-apice.
- Espianti laterali CUT (da 200 a 500 micron di diametro) dal ganglio spirale ancora attaccate al modiolus (Figura 1D) utilizzando una pinza e un micro bisturi.
5. Spirale Cultura ganglio Espianto su MEA
- Inserire due espianti gangliari spirale prossimi agli elettrodi sulla MEA precedentemente preparato con 100 ml di terreno di coltura.
- Inserire l'organo di Corti a circa 5 mm dalla superficie degli elettrodi.
- Utilizzare pinze per appuntare gli espianti e l'organo del Corti sulla MEA, evitando di danneggiare il tessuto.
- Posizionare i MEA attentamente nell'incubatrice e nella cultura a 37 ° C e 5% di CO 2. Il giorno successivo, ispezionare visivamente che gli espianti hanno attaccato al MEA.
NOTA: Se espianti non hanno attaccato O / N, che raramente farlo nei prossimi giorni. The OC è posto adiacente alla cultura per il supporto trofico / neurotrofico. - Aggiungere 100 pl di mezzo di coltura contenente 10% FBS e BDNF giorno per 5 giorni consecutivi.
- Il giorno 6 aggiungere 2 ml di terreno di coltura contenente il 10% FBS e 5 ng / ml BDNF e la cultura del tessuto per altri 13 giorni.
6. elettrofisiologiche registrazioni per indagare spontanea e degli elettrodi di stimolazione di attività dipendente
- Lavare la cultura MEA con extracellulare cosìluzione preparata al punto 1.3, a temperatura ambiente.
- Asciugare i contatti con un fazzoletto di carta e montare il MEA sulla configurazione MEA.
NOTA: per mantenere la cultura umido durante il montaggio, aggiungere una piccola goccia di soluzione extracellulare alla cultura. - Aggiungere 300 pl di soluzione extracellulare ed attendere 10 minuti prima della registrazione, per consentire al sistema di stabilizzarsi.
- Registra attività spontanea per 2 minuti da tutti gli elettrodi premendo sul pulsante Record del software / acquisire e identificare elettrodi di registrazione.
- Stimolazione dell'elettrodo MEA: Selezionare l'ampiezza / durata / forma dello stimolo sul software appropriato e si applicano a più elettrodi consecutivamente come descritto 13. Selezionare gli elettrodi basati su quelli che mostrano attività spontanea (come nel passaggio 6.4). Registra da tutti i restanti elettrodi.
- Per escludere da stimolo, stimolare dal medesimo elettrodo 10 volte. Se la cultura risponde almeno 8 volte su 10, può essere assunta comerisposta positiva su elettrodo indotta stimolazione.
- Per identificare il rumore di fondo, applicare Tetrodotoxina (TTX) alla cultureat una concentrazione di 1 micron, per bloccare i canali del sodio voltaggio-dipendenti e record per 2 min. Usare questo per eseguire il rilevamento picco (7.1 e 7.2).
Analisi 7. I dati
NOTA: L'analisi dei dati è stata precedentemente descritta in dettaglio in 6 e 5. Per le specifiche sul software utilizzati in questo studio vedi Materiali Tavolo, punto 7.
- Utilizzando il software appropriato rilevare l'attività spontanea per ogni elettrodo impiegando un rivelatore sulla base di deviazioni standard e una successiva discriminatore. Questa procedura è descritta in 6. Attività appare transitori più veloce di tensione (<5 msec).
- Scegli una soglia che si traduce in alcuna attività quando si analizza il TTX trattati samples.Adapt il valore soglia per ogni esperimento per discriminare tra falsi positivE e false rilevazioni negative.
- Utilizzando un software appropriato osservare l'attività neuronale rilevata di ciascun elettrodo come diagramma raster secondo procedure standard (vedere la Figura 2A - C).
- Determinare e visualizzare l'attività di rete totale sommando tutti gli eventi rilevati all'interno di una finestra scorrevole di 10 msec, spostato da passi di 1 msec.
- Rilevare l'attività di stimolazione indotta visualizzando i dati non elaborati utilizzando il software di analisi appropriato. Identificare offline manualmente i singoli picchi. Picchi singoli appaiono transitori di tensione più veloce, che si verificano dopo l'artefatto stimolazione (freccia testa nella Figura 2E). Un esempio è mostrato nella Figura 2E.
- A seconda del esperimento, analizzare il numero di elettrodi rispondenti, la soglia necessaria per ottenere una risposta, il numero di potenziali di azione per elettrodi e altri parametri di interesse 5.
8. Tessuto Fissazione e Immunohistochemistry
NOTA: Il processo di colorazione distruggerà il MEA. Vedere la Tabella Materiale (punto 4) per i reagenti.
- Subito dopo la registrazione lavare le culture con 37 ° C caldo PBS tre volte. Eliminare il PBS e applicare 4% paraformaldeide (PFA) (in PBS), preriscaldata a 37 ° C per 10 min.
ATTENZIONE: PFA è tossico. Lavorare in una cappa chimica con una protezione adeguata e la soluzione di scarto secondo le linee guida. - Lavare le culture tre volte con PBS e bloccare con 2% di sieroalbumina bovina (BSA) in PBS (0,01% Triton-X100) per 2 ore.
- Aggiungere il primo anticorpo (anti-βIII tubulina, anticorpo TUJ) diluito in PBS (2% BSA e 0,01% Triton-X100) e lasciare O / N a 4 ° C. Lavare la cultura tre volte con PBS.
NOTA: Da ora in poi mantenere il campione al buio più spesso possibile per minimizzare sbiancamento dell'anticorpo fluorescenza marcata secondario. - Aggiungere l'anticorpo secondario, diluito in PBS (BSA un 2%d 0.01% Triton-X100) e incubare per 1 a 2 ore a RT. Per colorare i nuclei aggiungi 1: 10.000 DAPI (1 mg / ml di magazzino) per 10 minuti.
- Lavare tre volte con PBS e montare i campioni all'indietro per sottili coprioggetto (24 x 50 mm 2) con mezzo di montaggio (vedi Materiali Tavolo, punto 4). Immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza con 5X e 20X di ingrandimento.
Representative Results
La figura 1 riassume la procedura per l'isolamento dei tessuti, la preparazione e la cultura su MEA. Noi mostriamo le fasi consecutive di dissezione dei tessuti per isolare il ganglio spirale (SG) da dell'epitelio sensoriale dell'organo del Corti (OC) e vascularis stria (SV) ed allegate legamento a spirale (Figura 1 A - C). Espianti gangliari spirale (3-4 in numero) vengono tagliati con micro-forbici dal ganglio come schematicamente illustrato in Figura 1D e immessi sul MEA (Figura 1E), sopra la zona occupata elettrodo (2,2 mm 2). La OC è posto in prossimità, al di fuori della superficie dell'elettrodo. La crescita della coltura può essere monitorata nel tempo (Figura 1G). Un diagramma schematico del protocollo è mostrato nella Figura 1F. attività elettrofisiologica può essere rilevato dopo 6 giorni di coltura, che aumentano con il tempo la cultura prolungato. we recommend valutare 18 culture giorno che producono numeri significativamente più elevati di elettrodi di registrazione rispetto ai punti temporali precedenti 5.
Figura 1. Preparazione coltura delle cellule. (A) appena sezionato del mouse orecchio interno. Bianco linea tratteggiata indica la posizione della coclea, linea tratteggiata nera indica la regione vestibolare. Dell'orecchio interno (B) del mouse dopo la rimozione del muro ossea cocleare. giri cocleari sono indicati da linee tratteggiate bianche. (C) La spirale ganglio (SG) e modiolus, l'organo del Corti (OC) e le vascularis stria (SV) e del legamento a spirale sono mostrati dopo la dissezione. (D) Schema di SG e OC dissezione e preparazione SG espianto {figure adattato da 5 con l'approvazione da parte dell'editore}. (E) Illustrazione del array multi elettrodi utilizzati in questo studio. Registrareelettrodi sono organizzati in una griglia rettangolare al centro e occupano un'area di 2,2 mm 2. elettrodi 4 terra e contatti laterali sono illustrati. (F) Schema del protocollo di coltura. Le registrazioni vengono effettuate a giorno 18. (G) immagini Rappresentante (immagini in campo chiaro) e schemi di espianti SG su MEA monitorato in cultura al giorno 1, 6 e 18 bar scala = 400 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande questa figura.
L'attività spontanea può essere rilevato sulla MEA e mostrato come una trama raster cui ogni riga della trama rappresenta un picco rilevato. Un esempio rappresentativo che mostra attività spontanea rilevata da più elettrodi (diversi colori nei grafici) è mostrato (Figura 2A, 2B, e 2C).
(Figura 2D), 5 elettrodi di rispondere (tracce rosse) ed elettrodi non rispondere (tracce blu) è mostrato nella Figura 2E. Per questi esperimenti un elettrodo è stato utilizzato per la stimolazione e tutti gli altri elettrodi per la registrazione. singoli potenziali d'azione sono apparsi 1 msec dopo l'artefatto stimolazione (freccia testa nera). Il MEA può essere immunostained al termine della procedura per valutare la copertura dei processi neuronali sull'area dell'elettrodo. L'elettrodo indicato in verde nella figura 2F è stato utilizzato per la stimolazione, e gli elettrodi indicati in rosso sono stati usati per registrare le risposte (figura 2E).
Figura 2. registrazioni di dati su MEA. (A </ Strong>) Tracce di registrazioni originali di sei su 63 elettrodi che mostrano attività spontanea. Plot (B) Raster dei sei elettrodi della figura 2a dopo il rilevamento picco. Ogni barra rappresenta un potenziale d'azione. (C) trama raster tra cui tutti gli elettrodi (come in A e B) L'attività è registrata da 63 elettrodi (canali numero 0-63) per 2 min. (D) Uno stimolo bifasico con durata complessiva di 80 msec ed ampiezza di 80 μA è stato utilizzato per la stimolazione della cultura da un elettrodo (E58 in Figura 2F). (E) Esempio rappresentativo di tracce di dati grezzi ottenuti dopo la stimolazione da elettrodo 58 che mostra i potenziali d'azione (tracce rosse) o senza risposte (tracce blu) dopo la stimolazione (nero punta di freccia). (F) cultura ganglio spirale sulla MEA immunostained per il marcatore neuronale TUJ (verde) alla fine dell'esperimento per visualizzare neuro la copertura finale della superficie dell'elettrodo {figure adattato da 5 con l'approvazione da parte dell'editore}. Elettrodo 58 utilizzato per la stimolazione è indicata in verde, elettrodi rispondenti sono indicati in rosso. Barra di scala = 50 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Infine, la messa a punto MEA permette di studiare eventuale modifica superficie dell'elettrodo che possono aumentare la sensibilità di registrazione. Due elettrodi MEA disponibili in commercio sono stati usati in questo studio con due diverse superfici platino: grigio platino (grigio Pt), costituito da un 150 nm strato spesso Pt (impedenza: 400 KΩ / 1 KHz) e nero Platino, (nero, Pt), ottenuto mediante deposizione elettrochimica di Pt al termine del processo di microfabbricazione (impedenza: 20 KΩ / 1 KHz). Vedere Materiali Tabella (punto 6) per i dettagli.
ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> sei esperimenti indipendenti MEA sono stati eseguiti in base alla tipologia elettrodo nero Pt MEA consenta di rilevare le attività neuronale su un maggior numero di elettrodi per ogni MEA (figura 3A) e la riduzione del. l'ampiezza dello stimolo necessario per ottenere una risposta (Figura 3B). Abbiamo analizzato per 30-35 coppie di elettrodi indipendenti, in 6 differenti esperimenti, la soglia di corrente necessaria per ottenere una risposta. elettrodi nero Pt risultati significativamente migliori che mostra una soglia di 31.09 μ a +/- 2.4 rispetto agli elettrodi grigio Pt 47.57 μ a +/- 1,97.
Figura 3. Confronto di grigio vs elettrodi Nero Pt. Due tipi di elettrodi (grigio e nero Pt) sono stati confrontati fianco a fianco con 12 culture MEA indipendenti, 6 per ogni tipo MEA. (A) Il numero totale di reelettrodi spondenti per esperimento è mostrato. (B) soglia di ampiezza di ottenere una risposta, misurato con 30-35 coppie di elettrodi indipendenti in 6 esperimenti indipendenti MEA è mostrato. I dati sono mostrati come media +/- SD. (Student t test p <0.001) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Il protocollo qui descritto mostra come la cultura espianti SGN sulla MEA e valutare l'attività SGN da registrazioni non invasive extracellulari. Questa piattaforma e il protocollo che abbiamo recentemente sviluppato 5 consentire l'identificazione di nuovi protocolli di stimolazione e materiali per elettrodi con conseguente fabbisogno di energia ridotto per attivare SGN, con un potenziale interesse per l'ulteriore implementazione di impianti cocleari e altri neuro-protesi. Alcune precauzioni nella procedura presentati sono fondamentali per la realizzazione di esperimenti accurati e riproducibili.
dissezione attento del ganglio spirale e ulteriore manipolazione del tessuto primario richiede particolare cautela. Questi esperimenti sono stati condotti utilizzando topi C57 / BL6 tra 5 e 7 giorni di età. Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando ratti Wistar nella stessa fascia di età, (dati non mostrati). Crediamo che questa sia l'età migliore per la messa dissezione come l'osso cocleare è ancora morbido itough per una facile rimozione dalla pinza, e il ganglio spirale e organo del Corti possono essere facilmente separati senza rompersi processi dendriti o SGN somas. Al epoche precedenti il tessuto è troppo morbido e le possibilità di strappare il SGN somas insieme con l'organo di Corti è maggiore, mentre nelle fasi successive, l'indurimento della capsula ossea della coclea aumenta il rischio di danneggiare il tessuto mentre dissezione. Corretto isolamento del SG e taglio attento degli espianti è critica. Questi dovrebbero essere nella gamma di 200-500 micron di dimensioni per massimizzare fissaggio su una superficie MEA e di avere sufficiente numero di SG somas negli espianti, da cui neuriti saranno ricrescere. Per aumentare il sostegno neurotrofico nei primi giorni della cultura, fresco BDNF si aggiunge ogni giorno e l'organo del Corti è collocato in co-coltura.
La velocità di dissezione è importante. Tutti i passaggi devono essere eseguiti rapidamente e con soluzioni fredde di ghiaccio per minimizzare il deterioramento del tessuto. Iltempo che intercorre tra l'eutanasia e l'immissione l'espianto sul MEA deve essere compresa tra 10-15 minuti ed è cruciale per le culture di successo. Avere tutti gli strumenti pronti, per evitare ritardi nella placcatura cultura.
Tutte le fasi, compresa la dissezione fine, la manutenzione della cultura e la preparazione del mezzo e le attrezzature vengono eseguite in condizioni sterili. Quando rivestimento del MEA con la soluzione ECM è importante scongelare in ghiaccio e di utilizzare punte delle pipette ghiacciate e medie ghiacciata come i gel miscela ECM a temperature più elevate. Quando si posizionano gli espianti su MEA, innanzitutto aggiungere il supporto per le zone degli elettrodi, poi posizionare gli espianti. Se si aggiunge il mezzo in una seconda fase, espianti tendono a staccarsi dalla MEA dovuta allo sforzo di taglio. Poiché piccoli volumi di mezzo sono applicati alla cultura nelle prime 5 giorni, evaporazione del terreno di coltura deve essere minimizzato. Pertanto si consiglia vivamente di creare una camera umidificata utilizzando piccole capsule di Petri, contenenti PBS in stretta Proximlità ai MEA.
Gli esperimenti qui descritti sono stati effettuati utilizzando disponibili in commercio elettrodi MEA con specifiche dimensioni degli elettrodi, materiali di rivestimento e la distanza degli elettrodi intra (come descritto al punto 2, nota). Le condizioni di coltura sono state ottimizzate qui per massimizzare la copertura neuronale del disegno specifico griglia dell'elettrodo. È possibile che altre configurazioni di elettrodi spaziatura, geometrie e superfici possono richiedere diversi rivestimenti o densità cellulari. Questi passaggi possono richiedere guasti iniziale per ottenere colture ad alta densità.
Per quanto riguarda le registrazioni elettrofisiologiche, prima di iniziare le registrazioni la coltura è trasferito da terreno di coltura a 37 ° C ad una soluzione extracellulare a RT. Per evitare registrazioni instabili, attendere circa 10 minuti per consentire la coltura di stabilizzarsi. Quando stimolando la cultura, particolare deve essere usata cautela nella scelta dello stimolocome grandi ampiezze (> 3 V) e durate possono causare danni alla cultura. Per un riferimento per quanto riguarda le forme di impulsi di stimolazione e la durata vedi riferimento 5.
Per l'acquisizione dei dati e l'elaborazione hardware fatto in casa (camera di registrazione, collegamenti con gli amplificatori e gli amplificatori) sono stati utilizzati e programmi di analisi specifici sono stati selezionati (vedi tabella Materiale, punto 7). Tuttavia, altre configurazioni MEA commerciali e altri pacchetti software sono adatti anche per queste operazioni. Abbiamo già valutato le risposte delle nostre culture a 3 punti di tempo diversi e ha mostrato un aumento di attività con il tempo prolungato cultura 5. Qui vi proponiamo 18 giorni in vitro per le registrazioni. sistemi MEA che consentono di registrazioni continue in sterili, camere umidificati, potrebbero facilitare l'identificazione dei punti di tempo ottimali per ogni tipo di cultura.
Un grave inconveniente di questo saggio biologico è l'elevata variazione di tegli numero di elettrodi per coltura che mostrano le risposte alla stimolazione. Questo tasso di risposte alla stimolazione dipende principalmente da quattro fattori: la densità dei neuriti nella cultura, i contatti tra le neuriti e gli elettrodi, il diametro dei neuriti o fasci neuriti, e l'impedenza degli elettrodi. Per quanto riguarda la densità neurite, solo neuriti che crescono su almeno due elettrodi possono essere usate per esperimenti di stimolazione. Il contatto tra neuriti ed elettrodi dipende dal tessuto circostante che può da un lato isolare i neuriti dall'elettrodo, e quindi peggiorare il contatto oppure, d'altra parte, isolare le neuriti e l'elettrodo dal bagno circostante e quindi migliorare il contatto. densità dei tessuti, nonché le dimensioni neurite, sono definite dalla espianto utilizzato e le condizioni di coltura. colture neuronali dissociate sono stati testati con successo ma densità neuronale in queste culture è molto più bassa, risultando in un numero ridotto di recoelettrodi rding. Pertanto, la coltura cellulare deve essere adattato alla specifica domanda scientifica da esaminare.
Infine, l'impedenza degli elettrodi è dato principalmente dalla dimensione e la superficie degli elettrodi. Materiali, creando una grande superficie, come nero di platino, come mostrato in figura 3, diminuendo l'impedenza degli elettrodi può anche migliorare l'accoppiamento tra elettrodi e neuriti 7-9.
Le strategie per migliorare il tasso di successo della stimolazione comprende quindi l'ottimizzazione delle condizioni di coltura, l'aumento del numero di elettrodi totale o densità elettrodi e la modulazione della superficie dell'elettrodo 10.
Fino ad ora, la caratterizzazione elettrofisiologica dei neuroni SG era stata eseguita utilizzando tecniche di patch clamp. Questo permette di registrazioni intracellulari di potenziali d'azione e l'analisi dettagliata delle correnti ioniche intracellulari daneuroni singoli. Presentiamo qui un saggio biologico in vitro che possono essere utilizzati per studiare i profili di attività dei neuroni gangliari spirale analizzando attività spontanea o risposte alla stimolazione extracellulare di molti neuroni contemporaneamente. Inoltre, l'interazione tra elettrodo e neuroni gangliari spirale può essere studiato ed ottimizzato per applicazione di materiali modificati o nuovi. Infine, anche se non illustrata, la piattaforma può essere utilizzato in combinazione con un elettrodo esterno, montato su un micromanipolatore come recentemente dimostrato dal nostro gruppo 5, al fine di studiare la relazione tra la distanza dell'attività dell'elettrodo e cultura stimolante. Tutti questi aspetti innovativi consentono di mimetismo delle caratteristiche chiave dei elettrodi impianto cocleare può portare alla progettazione di dispositivi protesici innovativi.
Il nostro modello è molto utile in strumento vitro per studiare le strategie per migliorare l'efficacia della stimolazione dei neuroni uditivi e ulteriori opLa tecnologia CI mizzare. Una volta che la tecnica è padroneggiata, si potrebbe immaginare screening per la modifica di un certo numero di variabili: a) diverse popolazioni neuronali, b) diversi materiali elettrodici / taglia / impedenze c) effettuare esperimenti cronici per testare Tossicità materiale o elettrodi di stimolazione indotta, che potrebbe far luce sui protocolli di stimolazione più sicuri e più efficaci di schiere di elettrodi in vivo.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Ruth Rubli presso il Dipartimento di Fisiologia dell'Università di Berna, in Svizzera per il prezioso aiuto tecnico con gli esperimenti. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal programma UE-FP7-NMP (convenzione di sovvenzione senza 281.056; progetto NANOCI - www.nanoci.org.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| culture medium | |||
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | 24 ml (for 25 ml) |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | 250 μl (for 25 ml) |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | 250 μl (for 25 ml) |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 500 μl (for 25 ml) |
| FBS | GIBCO | 10099-141 | 10% (for 25 ml) |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025/CF | final 5 ng/ml (for 25 ml) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| extracellular solution (pH 7.4) | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 4 mM | ||
| MgCl2 | 1 mM | ||
| CaCl2 | 2 mM | ||
| HEPES | 5 mM | ||
| Na-pyruvate | 2 mM | ||
| Glucose | 5 mM | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blocking solution | |||
| PBS | Invitrogen | 10010023 | |
| BSA | Sigma | A4503-50G | 2% |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | 0.01% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| TuJ | R&D Systems | MAB1195 | dil 1:200 |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
| Fluoreshild | Sigma | F6057 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plastic/tools | |||
| Petri dish 35 mm | Huberlab | 7.627 102 | |
| Petri dish 94 mm | Huberlab | 7.633 180 | |
| Dumont #5 tweezer | WPI | 14098 | |
| Dumont #55 tweezer | WPI | 14099 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Enzymatic solution: Terg-a-Zyme | Sigma | Z273287-11KG | |
| Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM | Corning | 356230 | |
| MEA electrodes | Qwane Biosciences | (Lausanne, Switzerland) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Labview | National Instruments | Switzerland | |
| IgorPro | WaveMetrics | Lake Oswega, USA |
References
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