Spiral ganglion Neuron Explantation kultur och elektrofysiologi på Multi Elektrod matriser

Protocol

Djuromsorg och experiment genomfördes i enlighet med riktlinjerna i de schweiziska kommunerna (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Schweiz).

1. Förbered Lösningar för experiment

1. Förbered den extracellulära matrisen (ECM) beläggningslösning (se Material tabell, punkt 6): Tina ECM mix på is. Späd ECM mix 1:10 i basiskt odlingsmedium (utan neurotrofiska faktorer eller fetalt bovint serum (FBS)) och förvara på is.
2. Förbered odlingsmedium (se Material tabell, punkt 1): Förbered ett lager av Neurobasal medium som inte innehöll FBS eller brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Komplettera Neurobasal media med färska FBS (10%) och BDNF (5 ng / ml) strax före tillsats till cellodlingen.
3. Förbered extracellulära lösning (se Material tabell, punkt 2).

2. Tvättning och Sterilisering av MEA

(Figur 1E). Varje elektrod har en storlek på 40 x 40 ^ m ² med ett avstånd på 200 | j, m från centrum till centrum. Elektroderna är gjorda av platina. Elektroderna är anslutna till motsvarande kontakter av en krets tillverkad av indiumtennoxid. Denna krets är isolerad från en av fem ^ m skikt av SU-8. Se Material tabell för information om leverantören. Andra MEA layouter kan vara lämpliga för dessa experiment.

1. För nya MEA: Skölj dem genom nedsänkning i 70% etanol under 30 sek och tvätta med destillerat vatten för 30 sek. Arbetet i ett laminärt flöde huva.
2. Låt MEA torr under 30 minuter i ett dragskåp med laminärt flöde.
3. Lägg varje MEA till en individuell steril petriskål (35 mm x 10 mm) och förslut med folie. MEA kan lagras tills de användes.
4. För begagnade MEA: Inkubera MEA i en petriskål (35 mm x 10 mm) innehållande 1 ml enzymatisk solution (se Material tabell, punkt 6) O / N på orbitalskak vid RT för att avlägsna biologiskt material. Fortsätt sedan som i steg 2,1.
   OBS: Hantera MEA med omsorg med hjälp av pincett med gummiklädda tips.

3. Beredning av MEA för kultur Experiment

1. Avlägsna förseglingsfolien och lämna MEA i petriskålen (35 mm x 10 mm) för hela experimentet.
2. Belägga MEA med lösningen som beretts på 1,1: Använd en kall 200 mikroliter pipettspets (förvaras vid -20 ° C) för att pipettera 50 | il beläggningslösning till varje MEA, som täcker hela elektrodarean.
3. Tillåt MEA att belägga under 30 min till 1 h vid RT.
4. Ta bort beläggningslösningen med användning av en pipett. Tillsätt 100 pl odlingsmedium kompletterat med 10% FBS och 5 ng / ml BDNF och lämna det vid RT tills plätering vävnaden.
5. Placera 2 petriskålar innehållande de belagda MEA i en stor petriskål (94 mm x 16 mm) och en tredje liten petriskål innehållande 1,5ml Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för befuktning.
   OBS: Lägga till en liten petriskål (steg 3,5) innehållande PBS är avgörande för att avsevärt minimera avdunstning av odlingsmedium.

4. Spiralganglion Dissection

OBS: Brutto dissektion kan göras utanför laminärt flöde huva (steg från 4,1 till 4,4). För fina dissektion sterila förhållanden (laminärt flöde huva) är obligatoriska (från steg 4,5).

1. Avliva djuren (5-7 dagar gamla möss) efter dekapitering utan föregående bedövning.
2. Sterilisera huvudet genom sprutning med 70% etanol.
3. Genom att hålla huvudet, klippa av kopplingen mellan huden och skallen med en vass / skarp sax längs den sagittala linje.
4. Skär skallen sagittally och ta bort hjärnan med hjälp av vassa / trubbiga saxar.
5. Skär tids ben från skallen och placera dem i en petriskål med steril iskall Hanks balanserade saltlösning (HBSS).
6. Med användning av en dissectionsmikroskop, dissekera trum bulla med fin pincett och isolera innerörat.
7. Ta benet i hörselsnäckan, med fin pincett.
8. Avlägsna spiralligament och stria vascularis (SV) tillsammans genom att hålla med pincett den basala delen av spiralganglion (SG) och SV och långsamt avlindning av SV från basen -to-apex
9. Isolera organ Corti (OC), SG och modiolus (Figur 1A - C)
10. Separera OC från SG och modiolus genom att hålla med pincett basala delen av SG och OC och sakta koppla OC från basen till spetsen.
11. Klipp sido explants (200 till 500 mikrometer i diameter) från spiralganglion fortfarande sitter i modiolus (figur 1D) med hjälp av en pincett och en mikro skalpell.

5. Spiralganglion Explantation kultur på MEA

1. Placera två spiralganglion explantat intill elektroderna på MEA tidigare framställda med 100 il odlingsmedium.
2. Placera organ Corti approximativt 5 mm från elektrodarean.
3. Använd pincett för att fästa explantaten och organ Corti på MEA samtidigt som man undviker att skada vävnaden.
4. Placera MEA försiktigt in i inkubatorn och odling vid 37 ° C och 5% _CO2. Nästa dag, visuellt inspektera att explantaten har fäst på MEA.
   OBS: Om explantat inte har fäst O / N, kommer de sällan göra det under de närmaste dagarna. OC är placerad i anslutning till den kultur för trofisk / neurotrofisk stöd.
5. Tillsätt 100 | il av odlingsmedium innehållande 10% FBS och BDNF dagligen under 5 på varandra följande dagar.
6. På dag 6 tillsätt 2 ml av odlingsmedium innehållande 10% FBS och 5 ng / ml BDNF och kultur vävnaden under ytterligare 13 dagar.

6. elektrofysiologiska inspelningar att undersöka spontan och elektrod stimulering Beroende aktivitet

1. Tvätta MEA kultur med extracellulär sålution framställd i steg 1,3, vid RT.
2. Torka kontakterna med en vävnad och montera MEA på MEA installationen.
   OBS: För att hålla kulturen fuktigt under monteringen, tillsätt en liten droppe av extracellulärt lösning på kulturen.
3. Tillsätt 300 ul av extracellulär lösning och vänta 10 minuter före inspelning, för att tillåta systemet att stabilisera sig.
4. Rekord spontan aktivitet för 2 minuter från alla elektroder genom att trycka på skivan / förvärva knapp av programvaran och identifiera registreringselektroderna.
5. MEA elektrodstimulering: Välj amplitud / varaktighet / form av stimulans på lämplig mjukvara och gäller för flera elektroder i följd som beskrivs ^13. Välj elektroderna grundar sig på de uppvisar spontan aktivitet (som i steg 6,4). Spela in från alla de återstående elektroderna.
6. Att utesluta stimulans artefakt, stimulera från samma elektrod 10 gånger. Om odlingen svarar minst 8 av 10 gånger, kan det antas som ettpositiv respons på elektrod stimulering.
7. Att identifiera bakgrundsljud, tillämpa Tetrodotoxin (TTX) till cultureat en koncentration av 1 ^ M, för att blockera spänningskänsliga natriumkanaler och rekord för 2 min. Använd detta för att utföra spik upptäckt (7,1 och 7,2).

7. Dataanalys

OBS: Dataanalys har tidigare beskrivits i detalj i ⁶ och ^5. För detaljerna om programvara som används i denna studie se Material tabell, punkt 7.

1. Med hjälp av lämplig programvara upptäcka spontan aktivitet för varje elektrod som använder en detektor baserad på standardavvikelser och en efterföljande urskiljning. Detta förfarande beskrivs i ^sex. Aktivitet verkar så snabbt spänningstransienter (<5 ms).
2. Välj en tröskel som resulterar i någon aktivitet vid analysen av TTX behandlas samples.Adapt tröskelvärdet för varje experiment för att skilja mellan falskt positive och falskt negativa identifieringar.
3. Med användning av lämplig mjukvara observera den detekterade neuronal aktivitet hos varje elektrod som en raster plot i enlighet med standardförfaranden (se fig 2A - C).
4. Bestämma och visa den totala nätverksaktivitet genom att summera alla upptäckta händelser inom ett glidande fönster av 10 ms, skiftas av 1 ms steg.
5. Identifiera stimulering-inducerad aktivitet genom att visa rådata med lämplig analysmjukvara. Identifiera de enskilda spikar offline manuellt. Enstaka spikar visas så fort spänningstransienter, som inträffar efter stimulering artefakt (pilspets i figur 2E). Ett exempel visas i figur 2E.
6. Beroende på experimentet, analysera antalet svarande elektroder, tröskeln som krävs för att uppnå ett svar, antal aktionspotential per elektroder och andra parametrar av intresse ^5.

8. vävnadsfixering och Immunohistochemistry

OBS! Färgning process kommer att förstöra MEA. Se Material tabell (punkt 4) för reagens.

1. Direkt efter inspelningen tvätta kulturerna med 37 ° C varmt PBS tre gånger. Kassera PBS och tillämpa 4% paraformaldehyd (PFA) (i PBS), som förvärmts till 37 ° C under 10 min.
   VARNING: PFA är giftig. Arbete i en kemisk huva med lämpligt skydd och kassera lösningen enligt riktlinjerna.
2. Tvätta kulturerna tre gånger med PBS och blockera med 2% bovint serumalbumin (BSA) i PBS (0,01% Triton-X100) under 2 h.
3. Lägga den första antikroppen (anti-βIII tubulin, TUJ antikropp) spädd i PBS (2% BSA och 0,01% Triton-X100) och lämna O / N vid 4 ° C. Tvätta odlingen tre gånger med PBS.
   OBS: Från och med nu hålla provet i mörker så ofta som möjligt för att minimera blekning av den sekundära fluorescensmärkt antikropp.
4. Tillsätt sekundär antikropp, utspädd i PBS (2% BSA end 0,01% Triton-X100) och inkubera under 1 till 2 h vid RT. Att färga kärnor lägga 1: 10000 DAPI (1 mg / ml lager) under 10 min.
5. Tvätta tre gånger med PBS och montera proven bakåt för att tunna täckglas (24 x 50 mm ²⁾ med användning av monteringsmedium (se Material tabell, punkt 4). Bild med en fluorescerande mikroskop med 5x och 20x förstoring.

Representative Results

Figur 1 sammanfattar förfarandet för vävnads isolering, förberedelse och kultur på MEA. Vi visar de olika stegen i vävnads dissektion att isolera spiralganglion (SG) från sensoriska epitel av organ Corti (OC) och stria vascularis (SV) och bifogas spiral ligament (Figur 1 A - C). Spiralganglien explantat (3-4 till antalet) är skurna med mikro-sax från ganglion, såsom schematiskt illustreras i figur 1D och placeras på MEA (figur 1E), över elektroden ockuperade området (2,2 mm ^2). OC är placerad i närhet, utsidan av elektrodytan. Tillväxten av kulturen kan följas över tid (figur 1G). En schematisk bild av protokollet visas i figur 1F. Elektrofysiologiska aktivitet kan detekteras efter 6 dagars odling, som ökar med förlängd kultur tid. vi recommend bedöma 18-dagarskulturer som producerar betydligt högre antal registreringselektroderna jämfört med tidigare tidpunkter ^5.

Figur 1. förberedelse Cellodling. (A) Färskt dissekerade mus innerörat. Vit streckad linje indikerar placeringen av snäckan, svart streckad linje indikerar vestibulära regionen. (B) Mouse innerörat efter avlägsnande av cochlea beniga väggen. Cochlea varv markeras med vita streckade linjer. (C) Spiralganglion (SG) och modiolus är det organ Corti (OC) och stria vascularis (SV) och spiral ligament visas efter dissekering. (D) Schematisk bild av SG och OC dissekering och förberedelser SG explantation {figur anpassad från ⁵ med godkännande från förlaget}. (E) Illustration av flerelektroduppsättningen som används i denna studie. omkodningelektroder är organiserade i ett rektangulärt rutnät i centrum och upptar en yta på 2,2 mm ^2. 4 jordelektroder och sidokontakter illustreras. (F) Schematisk bild av odlingsprotokollet. Inspelningar utförs på dag 18. (G) Representativa bilder (ljusa fält bilder) och system för SG explants på MEA övervakas i kulturen vid dag 1, 6 och 18. Skalstrecken = 400 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Spontan aktivitet kan upptäckas på MEA och visas som en raster tomt där varje rad av tomten utgör ett detekterat spik. Ett representativt exempel som visar spontan aktivitet detekteras från flera elektroder (olika färger i graferna) visas (figur 2A, 2B och 2C).

(Figur 2D), är 5 svarande elektroder (röda traces) och icke-svarande elektroder (blå traces) visas i figur 2E. För dessa experiment en elektrod användes för stimulering och alla andra elektroder för inspelning. Enstaka aktionspotentialer dök 1 ms efter stimulering artefakt (svart pil huvudet). MEA kan immun i slutet av förfarandet för att bedöma omfattningen av de neuronala processerna över elektrodarean. Elektroden indikeras i grönt i figur 2F användes för stimulering, och elektroderna som anges i rött användes för att registrera svar (Figur 2E).

Figur 2. Data inspelningar på MEA. (A </ Strong>) Spår av originalinspelningar av sex av 63 elektroder som visar spontan aktivitet. (B) Raster tomt av de sex elektroderna i figur 2A efter spik upptäckt. Varje stapel representerar en aktionspotential. (C) Raster tomt inklusive alla elektroder (som i A och B) Aktiviteten registrerades från 63 elektroder (kanaler nummer 0-63) för 2 min. (D) En bifasisk stimulus med total varaktighet på 80 ^ sek och amplitud av 80 | iA användes för stimulering av kultur från en elektrod (E58 i figur 2F). (E) Ett representativt exempel på rådata spår som erhållits efter stimulering från elektroden 58 visar aktionspotentialer (röda traces) eller utan svar (blå traces) efter stimulering (svart pil-huvud). (F) Spiralganglion kultur på MEA immunostained för den neuronala markören TUJ (grön) vid slutet av experimentet för att visualisera neuro nal täckning av elektrodområdet {figur anpassad från ⁵ med godkännande från förlaget}. Elektrod 58 används för stimulering indikeras i grönt, är svarande elektroder markerade med rött. Skala bar = 50 um. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.

Slutligen ger MEA setup för att studera möjliga elektrod ytmodifiering som kan öka inspelningskänslighet. Två kommersiellt tillgängliga MEA elektroder användes i denna studie med två olika platinaytor: Grå Platinum (Grey PT), som består av en 150 nm tjockt Pt-skikt (impedans: 400 kQ / 1 kHz) och svart platina, (svart, Pt), erhålles genom elektrokemisk avsättning av Pt vid slutet av mikrotillverkningsprocess (impedans: 20 kQ / 1 kHz). Se Material tabell (punkt 6) för mer information.

ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Sex oberoende MEA experiment utfördes per elektrodtyp Black Pt MEA möjliggör detektion av nervaktivitet på ett större antal elektroder per MEA (figur 3A) och en minskning av. stimulans amplitud som krävs för att framkalla ett svar (Figur 3B). Vi analyserade för 30-35 oberoende elektrodparen i 6 olika experiment, den nuvarande tröskeln som krävs för att uppnå ett svar. Svart Pt elektroder presterade signifikant bättre visar en tröskel på 31,09 μ A +/- 2,4 jämfört med Grey Pt elektroder 47,57 μ A +/- 1,97.

Figur 3. Jämförelse av Grey vs Black Pt elektroder. Två typer av elektroder (grå och svart PT) jämfördes sida vid sida med hjälp av 12 oberoende MEA kulturer, sex på varje MEA typ. (A) Det totala antalet rerande elektroder per experiment visas. (B) Amplitud tröskelvärde för att framkalla ett svar, mätt med användning av 30-35 oberoende elektrodparen i 6 oberoende MEA experiment visas. Data visas som medelvärde +/- SD. (Student t-test p <0,001) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Protokollet som beskrivs här visar hur kulturen SGN explants på MEA och bedöma SGN aktivitet genom extracellulära icke-invasiva inspelningar. Denna plattform och protokoll vi har nyligen utvecklat ⁵ möjliggöra identifiering av nya stimuleringsprotokoll och elektrodmaterial vilket resulterar i minskade energikrav för att aktivera SGN, med potentiellt intresse för fortsatta genomförandet av hörselimplantat och andra neuro-proteser. Flera försiktighetsåtgärder i den presenterade förfarandet är grundläggande för att utföra exakta och reproducerbara experiment.

Noggrann dissektion av spiralganglion och vidare hantering av den primära vävnad kräver särskild försiktighet. Dessa experiment har utförts med hjälp av C57 / BL6 möss mellan 5 och 7 dagar gammal. Liknande resultat erhölls med användning av Wistar-råttor i samma åldersgrupp, (data visas ej). Vi tror att detta är den bästa åldern för fina dissekering som cochlea ben är fortfarande mjukt svgrundlig för enkel borttagning av pincett, och spiralganglion och organ Corti kan lätt separeras utan att brista Dendrite processer eller SGN SOMAS. Vid tidigare åldrar vävnaden är alltför mjuk och chanserna att rippa SGN SOMAS tillsammans med organ Corti är högre, medan i ett senare skede, ökar risken för att skada vävnaden medan dissekera härdningen av beniga kapsel snäckan. Korrekt isolering av SG samt noggrann skärning av explantaten är kritisk. Dessa bör vara i intervallet 200-500 | j, m i storlek för att maximera fastsättning på MEA ytan och att ha tillräckligt antal SG SOMAS i explantaten, från vilka neuriter kommer att regenerera. För att öka neurotrophic stöd i de första dagarna av kultur, färsk BDNF sätts dagligen och organ Corti placeras i samodling.

Hastigheten på dissektion är också viktigt. Alla steg bör utföras snabbt och använda iskalla lösningar för att minimera vävnads försämring. Detid mellan eutanasi och placera explantatet på MEA bör vara mellan 10-15 min och är avgörande för framgångsrik kulturer. Har alla verktyg redo, för att undvika förseningar i kultur plätering.

Alla steg, bland annat fina dissektion, underhåll av kultur och förberedelse av medelstora och utrustning utförs under sterila förhållanden. Då man belägger MEA med ECM-lösning är det viktigt att tina den på is och att använda iskalla pipettspetsar och is-kallt medium såsom de ECM mix geler vid högre temperaturer. När du placerar explantaten på MEA, först lägga på medellång till elektrodområdena, därefter placera explants. Om mediet tillsätts i ett andra steg, explantat tenderar att lossna från MEA på grund av skjuvning stress. Eftersom små volymer av mediet appliceras till odlingen i första 5 dagarna, har avdunstning av odlingsmediet som skall minimeras. Därför är det starkt rekommenderat att skapa en fuktad kammare med hjälp av små petriskålar innehållande PBS i nära Proximga att de MEA.

De experiment som beskrivs här utfördes med användning av kommersiellt tillgängliga MEA elektroder med specifika elektroddimensioner, beläggningsmaterial och inom elektrodavståndet (som beskrivs i punkt 2, Note). Odlingsbetingelserna har optimerats här för att maximera neuronal täckning av den specifika elektrodgaller utformning. Det är möjligt att andra konfigurationer av elektrodmellanrummet, geometrier och ytor kan kräva olika beläggningar eller celltätheter. Dessa steg kan kräva inledande felsökning för att uppnå hög densitet kulturer.

Beträffande de elektrofysiologiska inspelningar, innan inspelningarna kulturen överförs från odlingsmedium vid 37 ° C till extracellulär lösning vid RT. För att undvika instabila inspelningar, vänta cirka 10 minuter för att låta kulturen stabilisera sig. När stimulera kulturen, bör särskild försiktighet iakttas vid val av stimulanssom stora amplituder (> 3 V) och varaktigheter kan orsaka skada till odlingen. För en referens om stimuleringspulsformer och varaktighet se referens ^5.

För datainsamling och bearbetning av hemlagad hårdvara (inspelning kammare, anslutningar till förstärkare och förstärkare) användes och specifika analysprogram valdes (se Material tabell, punkt 7). Men andra kommersiella MEA uppställningar och andra mjukvarupaket lämpar sig även för dessa operationer. Vi har tidigare bedömt svaren från våra kulturer på 3 olika tidpunkter och visade en ökad aktivitet med förlängd kultur tid ^5. Här föreslår vi 18 dagar in vitro för inspelningar. MEA system som möjliggör kontinuerlig inspelningar i sterila, fuktade kammare, kan underlätta identifieringen av de optimala tidpunkterna för varje odlings typ.

En stor nackdel med denna bioanalys är den höga variationen i tHan antal elektroder per kultur som visar svar på stimulering. Denna hastighet av svar på stimulering beror huvudsakligen på fyra faktorer: densiteten hos neuriter i kulturen, kontakterna mellan neuriter och elektroderna, diametern hos neuriter eller neuriter knippen, och impedansen hos elektroderna. När det gäller neurite densitet, kan endast neurites som växer över åtminstone två elektroder användas för stimuleringsexperiment. Kontakten mellan neuriter och elektroder beror på den omgivande vävnad som kan å ena sidan isolera neuriter från elektroden, och därmed förvärra den kontakt, eller, å andra sidan, isolera neuriterna och elektroden från den omgivande badet och därmed förbättra kontakten. Vävnadsdensitet, samt neurite storlek, definieras av explantatet som används och odlingsbetingelserna. Dissocierade neuronala kulturer har också testats med framgång men neuronal densitet i dessa kulturer är mycket lägre, vilket resulterar i ett minskat antal recording elektroder. Därför cellkulturen bör anpassas till den specifika vetenskapliga frågor som måste lösas.

Slutligen är impedansen av elektroderna huvudsakligen ges av storleken och ytan av elektroderna. Material, vilket skapar en stor yta, såsom svart platina, såsom visas i figur 3, vilket minskar impedansen hos elektroderna kan också förbättra kopplingen mellan elektroder och neuriter ^7-9.

Strategier för att förbättra resultaten av stimulering inkluderar därför optimering av odlingsbetingelser, en ökning av det totala antalet elektroder eller elektroder densitet och moduleringen av elektrodytan ^10.

Hittills hade elektrofysiologisk karakterisering av SG neuroner utförts med användning av patch clamp-tekniker. Detta gör det möjligt för intracellulära inspelningar av aktionspotentialer och detaljerad analys av intracellulära jonströmmar frånenkel neuroner. Här presenterar vi en in vitro-bioanalys som kan användas för att studera aktivitetsprofiler av spiral ganglieneuroner genom att analysera spontana aktiviteten eller svar på extracellulär stimulering av många neuroner samtidigt. Dessutom kan studeras samspelet mellan elektroden och spiralganglion nervceller och optimeras genom tillämpning av modifierade eller nya material. Slutligen, även om det inte visas här, denna plattform kan användas i kombination med en yttre elektrod, monterad på en mikromanipulator som nyligen visat av vår grupp ^5, för att studera förhållandet mellan avståndet av den stimulerande elektroden och kultur-aktivitet. Alla dessa nya aspekterna möjliggöra imitera viktiga funktioner i CI elektroderna kan leda till utformning av nya protesanordningar.

Vår modell är en mycket användbar in vitro verktyg för att undersöka strategier för att förbättra effekten av stimulering av hörsel nervceller och ytterligare optimize CI-teknik. När tekniken behärskas, kan man föreställa sig screening för modifiering av ett antal variabler: a) olika neuronala populationer, b) olika elektrodmaterial / storlek / impedans c) utföra kronisk experiment för att testa material toxicitet eller elektrod-stimulering inducerad toxicitet, som kan belysa säkrare och mer effektiva stimuleringsprotokoll från in vivo elektrodgrupperna.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
culture medium
Neurobasal medium	Invitrogen	21103-049	24 ml (for 25 ml)
HEPES	Invitrogen	15630-080	250 μl (for 25 ml)
Glutamax	Invitrogen	35050-061	250 μl (for 25 ml)
B27	Invitrogen	17504-044	500 μl (for 25 ml)
FBS	GIBCO	10099-141	10% (for 25 ml)
BDNF	R&D Systems	248-BD-025/CF	final 5 ng/ml (for 25 ml)
Name	Company	Catalog Number	Comments
extracellular solution (pH 7.4)
NaCl			145 mM
KCl			4 mM
MgCl2			1 mM
CaCl2			2 mM
HEPES			5 mM
Na-pyruvate			2 mM
Glucose			5 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
blocking solution
PBS	Invitrogen	10010023
BSA	Sigma	A4503-50G	2%
Triton X-100	Sigma	X100	0.01%
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining solutions
TuJ	R&D Systems	MAB1195	dil 1:200
DAPI	Sigma	D9542
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4%
Fluoreshild	Sigma	F6057
Name	Company	Catalog Number	Comments
plastic/tools
Petri dish 35 mm	Huberlab	7.627 102
Petri dish 94 mm	Huberlab	7.633 180
Dumont #5 tweezer	WPI	14098
Dumont #55 tweezer	WPI	14099
Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Enzymatic solution: Terg-a-Zyme	Sigma	Z273287-11KG
Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM	Corning	356230
MEA electrodes	Qwane Biosciences		(Lausanne, Switzerland)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Labview	National Instruments		Switzerland
IgorPro	WaveMetrics		Lake Oswega, USA