Protocol
Dyrepleje og eksperimenter blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i de schweiziske lokale myndigheder (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Schweiz).
1. Forbered Løsninger til eksperimenter
- Forbered den ekstracellulære matrix (ECM) belægning opløsning (se Material tabel, punkt 6): Thaw ECM mix på is. Fortynd ECM mix 01:10 i grundlæggende dyrkningsmedium (uden neurotrofiske faktorer eller kalvefosterserum (FBS)), og opbevar på is.
- Forbered dyrkningsmediet (se Material tabel, punkt 1): Forbered et lager af Neurobasal medium, der ikke indeholder FBS eller Brain neurotrofisk faktor (BDNF). Supplere neurobasalt medier med friske FBS (10%) og BDNF (5 ng / ml) lige før tilsætning til cellekulturen.
- Forbered den ekstracellulære opløsning (se Material tabel, punkt 2).
2. Vask og Sterilisation af multilaterale miljøaftaler
(figur 1E). Hver elektrode har en størrelse på 40 x 40 um 2 med en afstand på 200 um fra center til center. Elektroderne er fremstillet af platin. Elektroderne er forbundet til de tilsvarende kontakter ved et kredsløb fremstillet af indiumtinoxid. Dette kredsløb er isoleret med en 5 um lag af SU-8. Se Materiale tabel for oplysninger om udbyderen. Andre MEA layouts kan være egnet til disse eksperimenter.
- For nye MEA: Skyl dem ved at nedsænke i 70% ethanol i 30 sekunder og skylles med destilleret vand i 30 sek. Arbejde i en laminær strømning.
- Lad MEA tørre i 30 minutter i en laminær strømning.
- Sæt hver MEA i en individuel steril petriskål (35 mm x 10 mm), og forsegle med folie. MEA'erne kan opbevares indtil anvendelse.
- For brugte MEA: inkuberes MEA i en petriskål (35 mm x 10 mm), der indeholder 1 ml enzymatisk solution (se Materialer tabel, punkt 6) O / N på orbitalryster ved stuetemperatur for at fjerne biologisk materiale. Derefter fortsættes som i trin 2.1.
BEMÆRK: Håndter multilaterale miljøaftaler med omhu med pincet med gummi-dækket tips.
3. Udarbejdelse af multilaterale miljøaftaler for Kultur Eksperimenter
- Fjern tætningsfolien og forlade MEA i petriskålen (35 mm x 10 mm) til hele eksperimentet.
- Smør MMA med den løsning, udarbejdet i 1.1: Brug en kold 200 pi pipettespids (opbevares ved -20 ° C) til pipetteres 50 ul belægning løsning til hver MEA, der dækker hele elektrode området.
- Tillad MEA'er at belægge i 30 minutter til 1 time ved stuetemperatur.
- Fjern overtræksopløsningen med en pipette. Påfør 100 ul dyrkningsmedium suppleret med 10% FBS og 5 ng / ml BDNF og lade det blive ved RT indtil plating vævet.
- Placer 2 petriskåle, der indeholder de belagte multilaterale miljøaftaler i en stor petriskål (94 mm x 16 mm) og tilføje en tredje lille petriskål indeholdende 1,5ml phosphatbufret saltvand (PBS) til befugtning.
BEMÆRK: Tilføjelse af en lille petriskål (trin 3.5) indeholdende PBS er afgørende for væsentligt minimere fordampning af dyrkningsmedium.
4. Spiral Ganglion Dissection
BEMÆRK: Brutto dissektion kan gøres uden for laminar flow hætte (Trin 4.1 til 4.4). For fine dissektion sterile forhold (laminar flow hætte) er obligatoriske (fra trin 4.5).
- Aflive dyr (5-7 dage gamle mus) ved halshugning uden forudgående bedøvelse.
- Sterilisere hovedet ved sprøjtning med 70% ethanol.
- Ved at holde hovedet, klippe forbindelsen mellem huden og kraniet med en skarp / skarp saks langs sagittale linie.
- Skær kraniet sagittalt og fjern hjernen ved hjælp af skarpe / stumpe saks.
- Skær de tidsmæssige knogler fra kraniet og placere dem i en petriskål indeholdende steril iskold Hanks balancerede saltopløsning (HBSS).
- Ved hjælp af en dissection mikroskop, dissekere tympaniske bulla hjælp fine pincet og isolere det indre øre.
- Fjern knoglen i cochlea, ved hjælp fine tænger.
- Fjern spiral ledbånd og stria vascularis (SV) sammen ved at holde med pincet den basale del af spiral ganglion (SG) og SV og langsomt afvikling SV fra bunden til-spids
- Isoler organ Corti (OC), SG og modiolus (figur 1A - C)
- Adskil OC fra SG og modiolus ved at holde med pincet den basale del af SG og OC og langsomt afvikling af OC fra bunden mod spidsen.
- Cut laterale eksplantater (200 til 500 um i diameter) fra spiral ganglion stadig sidder fast på modiolus (figur 1 D) ved anvendelse af en pincet og en mikro skalpel.
5. Spiral Ganglion Eksplantering Kultur på multilaterale miljøaftaler
- Placer to spiralganglieneuroner eksplantater næste til elektroderne på MEA tidligere fremstillede med 100 pi dyrkningsmedium.
- Placer organ Corti cirka 5 mm væk fra elektroden området.
- Brug pincet til pin eksplantaterne og organ Corti på MEA samtidig undgå at beskadige vævet.
- Placer MMA forsigtigt ind i inkubatoren og dyrkning ved 37 ° C og 5% CO2. Den næste dag, visuelt inspicere at eksplantaterne har fastgjort til MEA.
BEMÆRK: Hvis eksplantaterne ikke har knyttet O / N, vil de sjældent gøre det i løbet af de næste dage. The OC er placeret ved siden af kultur for trofiske / neurotrofisk support. - Tilsæt 100 pi dyrkningsmedium indeholdende 10% FBS og BDNF dagligt i 5 på hinanden følgende dage.
- På dag 6 tilsættes 2 ml dyrkningsmedium indeholdende 10% FBS og 5 ng / ml BDNF og kultur vævet i yderligere 13 dage.
6. Elektrofysiologiske Optagelser at undersøge spontan og elektrode Stimulation Afhængig aktivitet
- Vask MEA kultur med ekstracellulær sålution fremstillet i trin 1.3, ved stuetemperatur.
- Tør kontakterne med en væv og montere MEA på MEA setup.
BEMÆRK: For at holde kulturen fugtigt under monteringen, tilsættes en lille dråbe af ekstracellulær løsning til kulturen. - Tilføj 300 pi ekstracellulær løsning og vente i 10 min før optagelse, så systemet kan stabilisere sig.
- Optag spontane aktivitet i 2 min fra alle elektroder ved at trykke på optage / erhverve knap af softwaren og identificere optagelse elektroder.
- MEA elektrode stimulation: Vælg amplituden / varighed / form af stimulus på den relevante software og gælder for flere elektroder fortløbende som beskrevet 13. Vælg elektroderne baseret på dem, der viser spontan aktivitet (som i trin 6.4). Optag fra alle de resterende elektroder.
- For at udelukke stimulering artefakt, stimulere fra samme elektrode 10 gange. Hvis dyrkningen reagerer mindst 8 ud af 10 gange, kan det antages som enpositiv respons ved elektrode-induceret stimulering.
- At identificere baggrundsstøj, anvende Tetrodotoxin (TTX) til cultureat en koncentration på 1 uM, at blokere spændingsafhængige natriumkanaler og optage i 2 min. Brug dette til at udføre spike detektion (7.1 og 7.2).
7. Dataanalyse
BEMÆRK: Dataanalyse er tidligere blevet beskrevet i detaljer i 6 og 5. For detaljerne om software anvendt i denne undersøgelse se Materialer tabel, punkt 7.
- Anvendelse af det passende software detektere spontan aktivitet for hver elektrode, der anvender en detektor baseret på standardafvigelser og en efterfølgende diskriminator. Denne procedure er beskrevet i 6. Aktivitet vises som hurtige spændingstransienter (<5 ms).
- Vælg en tærskel, der resulterer i nogen aktivitet, når man analyserer TTX behandlet samples.Adapt tærskelværdien for hvert forsøg at skelne mellem falsk positive og falsk negative registreringer.
- Anvendelse af passende software observere den detekterede neuronal aktivitet af hver elektrode som en raster plot ifølge standardprocedurer (se figur 2A - C).
- Bestem og vise det samlede netværk aktivitet som summen op alle registrerede hændelser inden for et glidende vindue på 10 ms, forskydes med 1 ms trin.
- Detect stimulation-induceret aktivitet ved at vise de rå data ved hjælp af passende analyse software. Identificer de enkelte spikes offline manuelt. Enkelte pigge vises som hurtige spændingstransienter, der indtræffer efter stimulering artefakt (pil hovedet i figur 2E). Et eksempel er vist i figur 2E.
- Afhængigt af forsøget, analysere antallet af responderende elektroder, tærsklen for at opnå en reaktion, antal handling potentiale pr elektroder og andre parametre af interesse 5.
8. vævsfiksering og Immunohistochemistry
BEMÆRK: farvning proces vil ødelægge MEA. Se Materiale Table (punkt 4) til reagenser.
- Direkte efter optagelsen vaske kulturerne med 37 ° C varme PBS tre gange. Kassér PBS og anvende 4% paraformaldehyd (PFA) (i PBS), forvarmet til 37 ° C i 10 minutter.
ADVARSEL: PFA er giftigt. Arbejde i en kemisk hætte med passende beskyttelse og discard løsning i henhold til retningslinjerne. - Vask kulturerne tre gange med PBS og blokere med 2% bovint serumalbumin (BSA) i PBS (0,01% Triton-X100) i 2 timer.
- Tilføj det første antistof (Anti-βIII tubulin, Tuj antistof) fortyndet i PBS (2% BSA og 0,01% Triton-X100) og henstår O / N ved 4 ° C. Vask kulturen tre gange med PBS.
BEMÆRK: Fra nu af holde prøven i mørke så ofte som muligt for at minimere blegning af sekundære fluorescerende-mærket antistof. - Tilføj det sekundære antistof, fortyndet i PBS (2% BSA end 0,01% Triton-X100) og inkuberes i 1 til 2 timer ved stuetemperatur. At farve kerner tilsættes 1: 10.000 DAPI (1 mg / ml stamopløsning) i 10 minutter.
- Vaskes tre gange med PBS og montere prøverne baglæns for tynde dækglas (24 x 50 mm 2) ved hjælp af montering medium (se Materialer tabel, punkt 4). Billede ved hjælp af en fluorescerende mikroskop med 5x og 20x forstørrelse.
Representative Results
Figur 1 opsummerer proceduren for væv isolation, forberedelse og kultur på MEA. Vi viser de på hinanden følgende trin væv dissektion for at isolere spiral ganglion (SG) fra det sensoriske epithel af orglet af Corti (OC) og stria vascularis (SV) og vedlagt spiral ligament (Figur 1 A - C). Spiralganglieneuroner eksplantater (3-4 i antal) skæres med mikrosakse fra ganglion som skematisk illustreret i figur 1 D og anbragt på MEA (figur 1E), over elektroden besatte område (2,2 mm2). The OC er placeret i nærheden, uden af elektroden overflade. Væksten af kulturen kan overvåges over tid (figur 1G). En skematisk diagram af protokollen er vist i figur 1F. Elektrofysiologisk aktivitet kan påvises efter 6 dages dyrkning, som øges med forlænget dyrkningstid. Vi recommend vurdere 18 dages kulturer, som producerer betydeligt højere antal optagelse elektroder i forhold til tidligere tidspunkter 5.
Figur 1. Cellekultur forberedelse. (A) Frisk dissekeret muse indre øre. Hvid stiplede linje angiver placeringen af cochlea, sort stiplede linje indikerer vestibulære region. (B) Mouse indre øre efter fjernelse af cochlear benede væg. Cochlear vindinger er angivet med hvide punkterede linier. (C) Den Spiral ganglion (SG) og modiolus, er det organ Corti (OC) og stria vascularis (SV) og spiral Ligament vist efter dissektion. (D) Skematisk af SG og OC dissektion og SG eksplantat forberedelse {figur tilpasset fra 5 med godkendelse fra udgiveren}. (E) Illustration af multi elektrode-array anvendes i denne undersøgelse. omkodningelektroder er organiseret i et rektangulært gitter i midten og dækker et areal på 2,2 mm2. 4 jordelektroder og side kontakter er illustreret. (F) Skematisk af kulturen protokollen. Optagelser udføres på dag 18. (G) Repræsentative billeder (lyse felt billeder) og ordninger af SG eksplantater på MEA overvåget i kultur på dag 1, 6 og 18. Scale barer = 400 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Spontan aktivitet kan detekteres på MEA og vist som en raster plot, hvor hver linje af plottet repræsenterer en detekteret spike. Et repræsentativt eksempel viser spontan aktivitet påvist fra flere elektroder (forskellige farver i graferne) er vist (figur 2A, 2B og 2C).
(figur 2D), er 5 reagerer elektroder (røde spor) og ikke-reagere elektroder (blå spor) vist i figur 2E. Til disse eksperimenter en elektrode blev anvendt til stimulering og alle de andre elektroder til optagelse. Enkelt aktionspotentialer optrådte 1 ms efter stimulering artefakt (sort pil hoved). MEA kan immunfarvet ved afslutningen af proceduren for at vurdere dækningen af de neuronale processer over elektrodearealet. Elektroden angivet med grøn i figur 2F blev anvendt til stimulering, og elektroderne er angivet i rød, blev anvendt til at registrere responser (Figur 2E).
Figur 2. data optagelser på MEA. (A </ Strong>) Spor af originale optagelser af seks ud af 63 elektroder viser spontan aktivitet. (B) Raster plot af de seks elektroder i figur 2A efter spike detektion. Hver bjælke repræsenterer en handling potentiale. (C) Raster plot herunder alle elektroder (som i A og B) Aktivitet registreres fra 63 elektroder (kanal nummer 0-63) i 2 minutter. (D) En tofaset stimulering med samlet varighed på 80 mikrosekunder og amplitude på 80 uA blev anvendt til stimulering af kulturen fra den ene elektrode (E58 i figur 2F). (E) Repræsentant eksempel på rå data spor opnået efter stimulering fra elektroden 58 viser aktionspotentialer (røde spor) eller uden svar (blå spor) efter stimulation (sort pil-hoved). (F) Spiral ganglion kultur på MEA immunfarvet for neuronal markør Tuj (grøn) i slutningen af forsøget for at visualisere neuro nal dækning af elektroden området {figur tilpasset fra 5 med godkendelse fra udgiveren}. Elektrode 58 anvendes til stimulering vises i grøn farve, responderer elektroder angivet med rødt. Scale bar = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Endelig MEA opsætning giver mulighed for at studere mulige elektrode overflade modifikation, som kan øge optagelsen følsomhed. To kommercielt tilgængelige MEA elektroder blev anvendt i denne undersøgelse med to forskellige platin overflader: Grå Platinum (Grey Pt), der består af et 150 nm tykt Pt lag (impedans: 400 kQ / 1 kHz) og Black Platinum, (Black, Pt), opnået ved elektrokemisk aflejring af Pt ved afslutningen af den mikro-fremstillingsprocessen (impedans: 20 kQ / 1 KHz). Se Materialer Table (punkt 6) for yderligere oplysninger.
ent "fo: holde-together.within-side =" 1 "> blev udført seks uafhængige MEA eksperimenter pr elektrode typen Black Pt MEA tillader påvisning af neuronal aktivitet på et større antal elektroder pr MEA (figur 3A) og reduktion af. stimulus amplitude nødvendig for at fremkalde en reaktion (figur 3B). Vi analyserede i 30-35 uafhængige elektrodepar, i 6 forskellige eksperimenter, den nuværende grænse er nødvendig for at opnå en reaktion. Sort Pt elektroder væsentligt bedre viser en tærskel på 31.09 μ a +/- 2,4 i forhold til Grey Pt elektroder 47,57 μ A +/- 1,97.
Figur 3. Sammenligning af Grey vs Black Pt elektroder. To typer elektroder (grå og sorte Pt) blev sammenlignet side om side under anvendelse af 12 uafhængige MEA kulturer, 6 på hver MEA type. (A) Det samlede antal af rerende elektroder pr eksperiment er vist. (B) Amplitude tærskel for at fremkalde en reaktion, målt ved anvendelse af 30-35 uafhængige elektrodepar i 6 uafhængige MEA eksperimenter er vist. Data er vist som gennemsnit +/- SD. (Student t-test p <0,001) Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Protokollen beskrevet her viser, hvordan man kultur SGN eksplantater på MEA og vurdere SGN aktivitet ved ekstracellulære non-invasive optagelser. Denne platform og protokollen, vi har for nylig udviklet 5 lette identifikation af nye stimulation protokoller og elektrode materialer resulterer i reducerede energibehov for at aktivere SGN, med potentiel interesse for den videre gennemførelse af cochlear implantater og andre neuro-proteser. Flere forholdsregler i den præsenterede procedure er grundlæggende for udførelsen af nøjagtige og reproducerbare eksperimenter.
Omhyggelig dissektion af spiralen ganglion og videre håndtering af den primære væv kræver særlig forsigtighed. er blevet udført disse eksperimenter under anvendelse C57 / BL6-mus mellem 5 og 7 dage gammel. Lignende resultater blev opnået under anvendelse af Wistar-rotter i samme aldersgruppe, (data ikke vist). Vi mener, at dette er den bedste alder for fine dissektion som cochlear knogle er stadig blød dadybdegående for nem fjernelse af pincet, og den spiral ganglion og organ Corti let kan adskilles uden brud dendritceller processer eller SGN SOMA. I en tidligere alder vævet er for blød og chancerne for at rippe SGN SOMA sammen med cortiske organ er højere, mens på senere trin, hærdning af den benede kapsel af cochlea øger risikoen for at beskadige vævet, mens dissekere. Korrekt isolering af SG samt omhyggelig afskæring af eksplantaterne er kritisk. Disse bør være i området fra 200-500 um i størrelse til at maksimere binding til MEA overflade og til at have tilstrækkeligt antal SG SOMA i eksplantaterne, hvorfra neuritter vil regrow. At øge neurotrofisk støtte i de første dage af kultur, er frisk BDNF tilføjet dagligt og orglet af Corti er placeret i co-kultur.
Hastigheden af dissektion er også vigtig. bør alle trin udføres hurtigt og under anvendelse iskolde opløsninger for at minimere forringelse væv. Dettid mellem eutanasi og placere eksplantatet på MEA bør være mellem 10-15 min og er afgørende for vellykket kulturer. Har alle værktøjer klar, for at undgå forsinkelser i kultur plating.
Alle foranstaltninger, herunder fine dissektion, vedligeholdelse af kulturen og forberedelse af mellemstore og udstyr udføres under sterile forhold. Når coating af MEA med ECM løsning er det vigtigt at tø det på is og bruge iskold pipettespidser og iskoldt medium som ECM mix geler ved højere temperaturer. Ved placering eksplantaterne på multilaterale miljøaftaler, først tilføje mellemlang til elektrodestoffet efterfølgende placere eksplantaterne. Hvis der tilsættes mediet i et andet trin, eksplantater tendens til at løsne sig fra MEA grund forskydningsspænding. Fordi små volumener af medium anvendes til kulturen i første 5 dage, fordampning af dyrkningsmediet skal minimeres. Derfor er det stærkt anbefales at skabe et fugtigt kammer ved hjælp af små petriskåle indeholdende PBS i tæt Proximity til MEA'er.
De her beskrevne eksperimenter blev udført ved hjælp af kommercielt tilgængelige MEA elektroder med specifikke elektrode dimensioner, belægningsmaterialer og intra afstand elektrode (som beskrevet i punkt 2, Note). Dyrkningsbetingelserne er optimeret her for at maksimere neuronal dækning af den specifikke elektrode gitter design. Det er muligt, at andre konfigurationer af elektrodeafstanden, geometrier og overflader kan kræve forskellige belægninger eller celledensiteter. Disse trin kan kræve indledende fejlmelding for at opnå kulturer med høj densitet.
Hvad angår de elektrofysiologiske optagelser, før start optagelserne kulturen overføres fra dyrkningsmedium ved 37 ° C til ekstracellulær opløsning ved stuetemperatur. For at undgå ustabile optagelser, vente i ca. 10 minutter for at tillade kulturen at stabilisere sig. Når stimulere kulturen, bør særlig forsigtighed anvendes i valg af stimulussom store amplituder (> 3 V) og varigheder kan forårsage skade på kulturen. For en reference om stimulation puls former og varighed se reference 5.
For dataindsamlings- og behandlingsudstyr hjemmelavet hardware (indspilning kammer, forbindelser til forstærkerne og forstærkere) blev anvendt og specifikke analyse programmer blev valgt (se Material tabel, punkt 7). andre kommercielle MEA opsætninger og andre software pakker er imidlertid velegnet som godt for disse operationer. Vi har tidligere vurderet svarene fra vores kulturer på 3 forskellige tidspunkter og viste en øget aktivitet med langvarig kultur tid 5. Her foreslår vi 18 dage in vitro til optagelser. MEA systemer muliggør kontinuerlige optagelser i sterile, fugtige kamre, kunne lette identifikationen af de optimale tidspunkter for hver kultur type.
En væsentlig ulempe ved denne bioassay er den høje variation i than antal elektroder pr kultur, der viser respons på stimulering. Denne hastighed af reaktionerne på stimulering afhænger hovedsagelig af fire faktorer: densiteten af neuritter i kulturen, kontakterne mellem neuritter og elektroderne, diameteren af neuritter eller bundter neuritter, og impedansen af elektroderne. Med hensyn til neurit densitet, kan kun neuritter, der vokser over mindst to elektroder anvendes til stimulering eksperimenter. Kontakten mellem neuritter og elektroder afhænger af det omgivende væv, der kan på den ene side isolere neuritter fra elektroden, og dermed forværre kontakt, eller, på den anden side, isolere neuritter og elektroden fra det omgivende bad og således forbedre kontakten. Vævstæthed, samt neurit størrelse, er defineret af den anvendte eksplantatet og dyrkningsbetingelserne. Dissocierede neuronale kulturer er også blevet testet med succes, men neuronal tæthed i disse kulturer er meget lavere, hvilket resulterer i et reduceret antal recording elektroder. cellekulturen bør derfor tilpasses til den specifikke videnskabelige spørgsmål, der skal løses.
Endelig er impedansen af elektroderne hovedsagelig givet ved størrelsen og overfladen af elektroderne. Materialer og skaber en stor overflade, såsom sort platin, som vist i figur 3, begrænse den impedans af elektroderne kan også forbedre koblingen mellem elektroder og neuritter 7-9.
Strategier til forbedring af succesraten for stimulation omfatter derfor optimering af dyrkningsbetingelserne, stigningen i det samlede antal elektroder eller elektroder tæthed og modulationen af elektrodeoverfladen 10.
Hidtil havde elektrofysiologisk karakterisering af SG neuroner blevet udført under anvendelse af patch clamp-teknikker. Dette giver mulighed for intracellulære optagelser af aktionspotentialer og detaljeret analyse af intracellulære ionstrømme frasingle neuroner. Her præsenterer vi et in vitro bioassay, der kan bruges til at studere aktivitetsprofiler af spiralganglieneuroner neuroner ved at analysere spontan aktivitet eller reaktioner på ekstracellulær stimulering af mange neuroner samtidigt. Derudover kan vekselvirkningen mellem elektroden og spiralganglieneuroner neuroner undersøges og optimeres ved anvendelse af modificerede eller nye materialer. Endelig, hvis der ikke er vist her, denne platform kan anvendes i kombination med en ekstern elektrode, der er monteret på en mikromanipulator som for nylig vist ved vores gruppe 5, for at undersøge forholdet mellem afstanden af den stimulerende elektrode og kultur aktivitet. Alle disse hidtil ukendte aspekter tillade efterligning af de vigtigste funktioner af cochlear implant elektroder kan føre til udformning af hidtil ukendte proteseindretninger.
Vores model er et meget nyttigt in vitro værktøj til at undersøge strategier til forbedring af effektiviteten af stimuleringen af auditive neuroner og yderligere optimize CI-teknologi. Når teknikken er mestret, kunne man forestille screening for ændring af en række variabler: a) forskellige neuronale populationer, b) forskellige elektrode materialer / størrelse / impedanser c) udføre kroniske eksperimenter for at teste materiale toksicitet eller elektrode-stimulation induceret toksicitet, som kunne kaste lys over mere sikre og mere effektive stimulation protokoller ved in vivo elektrode arrays.
Acknowledgments
Forfatterne takker Ruth Rubli ved Fysiologi Institut ved universitetet i Bern, Schweiz til værdifuld teknisk hjælp til forsøgene. Dette arbejde blev støttet delvist af EU-FP7-NMP-programmet (tilskudsaftale nr 281.056; -projektet NANOCI - www.nanoci.org.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| culture medium | |||
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | 24 ml (for 25 ml) |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | 250 μl (for 25 ml) |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | 250 μl (for 25 ml) |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 500 μl (for 25 ml) |
| FBS | GIBCO | 10099-141 | 10% (for 25 ml) |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025/CF | final 5 ng/ml (for 25 ml) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| extracellular solution (pH 7.4) | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 4 mM | ||
| MgCl2 | 1 mM | ||
| CaCl2 | 2 mM | ||
| HEPES | 5 mM | ||
| Na-pyruvate | 2 mM | ||
| Glucose | 5 mM | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blocking solution | |||
| PBS | Invitrogen | 10010023 | |
| BSA | Sigma | A4503-50G | 2% |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | 0.01% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| TuJ | R&D Systems | MAB1195 | dil 1:200 |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
| Fluoreshild | Sigma | F6057 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plastic/tools | |||
| Petri dish 35 mm | Huberlab | 7.627 102 | |
| Petri dish 94 mm | Huberlab | 7.633 180 | |
| Dumont #5 tweezer | WPI | 14098 | |
| Dumont #55 tweezer | WPI | 14099 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Enzymatic solution: Terg-a-Zyme | Sigma | Z273287-11KG | |
| Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM | Corning | 356230 | |
| MEA electrodes | Qwane Biosciences | (Lausanne, Switzerland) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Labview | National Instruments | Switzerland | |
| IgorPro | WaveMetrics | Lake Oswega, USA |
References
- O'Donoghue, G. Cochlear implants--science, serendipity, and success. N Engl J Med. 369 (13), 1190-1193 (2013).
- Shepherd, R. K., Hatsushika, S., Clark, G. M. Electrical stimulation of the auditory nerve: the effect of electrode position on neural excitation. Hear Res. 66 (1), 108-120 (1993).
- Tykocinski, M., et al. Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays. Am J Otol. 21 (2), 205-211 (2000).
- Wilson, B. S., Dorman, M. F. Cochlear implants: current designs and future possibilities. J Rehabil Res Dev. 45 (5), 695-730 (2008).
- Hahnewald, S., et al. Response profiles of murine spiral ganglion neurons on multi-electrode arrays. J. Neural Eng. 13, (2015).
- Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).
- Heim, M., Yvert, B., Kuhn, A. Nanostructuration strategies to enhance microelectrode array (MEA) performance for neuronal recording and stimulation. J Physiol Paris. 106 (3-4), 137-145 (2012).
- Kim, R., Nam, Y. Novel platinum black electroplating technique improving mechanical stability. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 184-187 (2013).
- Cellot, G., et al. Carbon nanotubes might improve neuronal performance by favouring electrical shortcuts. Nat Nanotechnol. 4 (2), 126-133 (2009).
- Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nat Nano. 8 (2), 83-94 (2013).
