Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

דור שני צבעים Antigen Microarrays לאיתור סימולטני של IgG ו- IgM נוגדנים עצמיים

doi: 10.3791/54543 Published: September 15, 2016

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אנטיגנים מדללים 1. יצירת Microarrays Antigen

  1. לדלל אנטיגנים ב PBS לריכוז סופי של 0.2 מ"ג / מ"ל. הדפס עד 162 אנטיגנים ייחודיים כפולים עם תצורת microarrayer עם 9 פינים. כלול אנטיגנים IgG ו IgM בספריית אנטיגן בקרות חיוביות כמו. כלול PBS רק כביקורת שלילית.
  2. הוסף 20 μl של כל אנטיגן 384 צלחת המקור הטובה. להוסיף אנטיגנים לצלחת מקור בקבוצות המשקפות את ההתקנה של ראש ההדפסה (למשל, לארגן אנטיגנים בקבוצות של 9 כאשר 9 פינים משמשים להדפסה).
  3. צלחת מקור מכסים בנייר כסף ולהקפיא ב -80 ° C עד מוכן להדפיס מערכים.
  4. נקה סיכות microarrayer מוצקות על ידי דוגר אותם באמבט sonicating עם מים ללא יונים עבור דק '3 x 1. סיכות מקום על המדף להתייבש ואז לארגן סיכות ראש ההדפסה microarray. במשך 9 סיכות, להשתמש בתצורת 3 x 3.
  5. תכנית microarrayer לדפוס מנוהלת על ידי הגדרת סיכות מספר על ראש הדפסה,מספר השקופיות להדפיס, מספר כריות על כל שקופית, ואת מספר הנקודות לשכפל לכל אנטיגן. בדרך כלל, השתמש 9 פינים, 70 מגלשות, 2 רפידות / שקופיות, ו -2 נקודות לשכפל לכל אנטיגן. microarrayer תוכנית כדי sonicate סיכות במים בין קבוצות שונות של אנטיגנים.
  6. צלחת מקור להפשיר ואז צלחת צנטריפוגות במשך 1 דקות ב 100 x ז. מניחים מקור צלחת במקום המיועד microarrayer. הסר את החלק של רדיד שמכסה קבוצת אנטיגנים הראשונה שיודפס.
  7. מסדרים שקופיות שלא הודפסו על משטח arrayer ותוכנית הדפסה לרוץ. הדפס שקופיות ב RT עם לחות להגדיר על arrayer ב 55 - 60% עם הגרסה ב- אדים של מכונה המערך.
  8. אחרי כל קבוצה של אנטיגנים מודפסת על כל השקופיות, להשהות את microarrayer. מכסה את אנטיגנים כי הודפסו רק בנייר כסף (כדי למנוע אידוי) ולחשוף את קבוצת אנטיגנים הבאה להדפסה. המשך תכנית להדפיס.
  9. אחרי הכל אנטיגנים הודפסו, מקור כיסוי plאכול עם חתיכת נייר ולהקפיא חדש ב -80 מעלות צלזיוס. מניח שקופיות מודפסות תיבת שקופיות חותמת ואקום. שקופיות ניתן להשתמש למחרת או עד חודש לאחר מכן.

2. גשוש Microarrays Antigen עם מדולל סר

  1. מניח שקופיות לתוך מסגרות באמצעות תאי דגירה. הוסף 700 μl של חיץ חסימה (2.5% [כרך / כרך] נסיוב עגל העוברי (FCS), [כרך / כרך] 0.1% Tween 20 ב PBS) לכל משטח מערך.
  2. מניח סרט דבק מעל המסגרת ומניח במכל אטום עם פיסת הרקמה רטובה. דגירה O / N ב 4 ° C על כיסא נדנדה.
  3. לדלל דגימות סרום 1: 100 בחסימת המאגר. לשאוב פתרון לחסימת מערכים ולהוסיף 500 μl של מדגם בדילול לכל משטח המערך.
  4. מכסים עם סרט דבק דגירה במשך שעה 1 ב 4 ° C עם נדנדה.
  5. מדולל נוגדנים משני בחסימת המאגר. עבור מחקרים בבני אדם, לדלל נוגדן IgG Cy3 שכותרתו עז נגד אדם כדי 0.33 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו Cy5 שכותרתו עז נגד הומאn IgM נוגדנים 0.25 מיקרוגרם / מ"ל. עבור מחקרים העכבר, לדלל Cy3 שכותרתו עז נגד העכבר נוגדן IgG 0.38 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו Cy5 שכותרתו עז נגד העכבר נוגדן IgM 0.7 מיקרוגרם / מ"ל.
  6. לשאוב דגימות מערכים ולשטוף משטחי מערך 4 פעמים עם חיץ לשטוף (0.1% Tween 20 ב PBS). יוצקים חיץ על מנת מגלשות מכבה במהירות.
  7. הוסף 700 μl של חיץ חסימת לשטוף כל משטח מערך דגירה 10 דקות ב RT עם נדנדה. צעד חזור על לשטוף פעמיים נוספות.
  8. הוסף 500 μl של נוגדנים משני מדוללים לכל משטח שקופית ומכסה סרט דבק. דגירה 45 דקות ב 4 ° C עם נדנדה.
  9. לשאוב תערובת נוגדנים משני מן השקופיות ולשטוף 4 פעמים כנ"ל. לשטוף מחליק 3 פעמים עם 700 μl של חסימה / דילול חיץ כנ"ל.
  10. סר שקופיות ממסגרות ומניחים מתלים מתכת שקופית כי הוא שקוע PBS. דגירה 20 דקות ב RT עם רעד מסלולית. מניחים במיכל החדש של PBS ו דגירה עוד 20 מ 'ב עם רעד.
  11. מקום מתל שקופיות במכל של סעיף 15 מים ללא יונים. מניח מתל במכל מים חדש דגירה עוד 15 שניות.
  12. לשקופיות יבשות, מתל שקופית מקום על מתאם צלחת ELISA בצנטריפוגה ספין ב 220 XG במשך 5 דקות ב RT.
  13. מניח שקופיות בתיבת אור חזקה עד מוכן לסריקה.

3. Microarrays Antigen סריקה וייצוא נתונים

  1. שקופיות סריקה באמצעות סורק microarray שיכולים לזהות אותות ניאון Cy3 ו Cy5. על מנת להתאים את הצינור המכפיל (PMT) הרמות של הסורק, טרום לסרוק שקופיות אשר חקרו רק עם נוגדנים משני.
    הערה: שקופית זה צריכה לכלול את ספריית אנטיגן המלאה מודפסת עליו כולל חיובי (IgG ו IgM) כמו גם שלילי שולט (PBS). The-הסריקה מראש היא סריקה ברזולוציה נמוכה המאפשרת למשתמש לאתר במהירות את גדרות PMT האופטימליות.
  2. הגדר את ערכי PMT כך תכונות IgG אדם (בערוץ Cy3) ואת הזמזוםיש תכונות IgM (בערוץ Cy5) א עוצמת הקרינה מינוס רקע החציוני דומה (MFI-B) (בדרך כלל 40,000). רמות PMT נקבעות על ידי לחיצה על כפתור "חומרה". לאחר ההגדרה, לשמור הגדרות PMT אלה קבוע.
  3. סרוק את השקופיות הניסיוניות על שני הערוצים על ידי לחיצה על כפתור "סריקה". שמור את השקופיות (בשני הערוצים) לאחר כל סריקה.
  4. טען את השקופיות להיות מנותח לתוך התוכנה microarray באמצעות כפתור "קובץ".
  5. טען את רשימת מערך הגנים (GAL) הקובץ באמצעות כפתור "קובץ". קובץ GAL יש את הפריסה של המערך עם הזהויות של תכונות המערך.
  6. מניחים את התבנית מערך מעל התמונה הסרוקה כך תכונות מערכים להתאים את התבנית ככל האפשר.
  7. יישר תכונות בכל בלוקים עם התבנית על ידי לחיצה על הכפתור "align". התכנית תהיה בדרך כלל למצוא את קווי המתאר של התכונות העגולות אבל כמה התאמות ידניות ייתכן שתהיינה צורך. התאמות אלה יכולים להתבצע על ידי כניסה למצב תכונה. התוכנה אז תחשב MFI-B עבור כל אחד אנטיגנים.
  8. השתמש בלחצן "קובץ" לייצא את התוצאות הללו כקובץ טקסט.

4. נתוני מערך ניתוח עם ניתוח המשמעות של Microarrays (SAM)

  1. לטעון קבצי טקסט בודדים לתוך Excel ולזהות את העמודות שיש MFI-B עבור ערוצי Cy3 ו Cy5.
  2. חישוב הממוצע עבור תכונות כפולות.
  3. עבור כל MFI-B שלילי, להחליף את המספר השלילי עם 10. Transform נתונים על ידי חלוקת MFI-B גלם ב -100 ולאחר מכן על ידי חישוב יומן בסיס 2.
  4. לנתח נתוני יומן הפך עם ניתוח המשמעות של Microarrays (SAM) כפי שתואר לעיל 7.
  5. עבור מחקר באמצעות שתי קבוצות (לדוג ', אמצעי לעומת מטופלים בריאים), התווית קבוצה אחת "1" לבין הקבוצה "2." השתמש ניתוח מזווג, השנייה בינוני SAM לזהות reactivities אנטיגנים כי הם יםignificantly שונה בין שתי הקבוצות (ערך q <0.05).
  6. השתמש מניב אשכולות וחום-מפת תוכנה כדי להפוך את תמונות עבור מצגת 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אנטיגנים מסודרים צלחת 384 היטב מודפסים על גבי שקופיות על ידי microarrayer רובוטית כפי שמוצג באיור 1. איור 2 מראה שקופיות להציב מסגרת עם תאי הדגירה שקופית סרק לאחר עיבוד. איור 3 מציג שקופיות בקרה חיובית ושלילית. השקופית השלילית חקרה רק עם נוגדנים משני וגלישת הבקרה החיובית היא חקרה עם סרום מחול עם זאבת אדמנתית מערכתית. באמצעות בנפרד שני נוגדנים משני שכותרתו, IgG ו- IgM reactivities ניתן להפריד על אותו משטח שקופיות. איור 4 מראה עוצמת הקרינה של נוגדנים IgM נגד דנ"א חד-גדילי (ssDNA) ו IgG נוגדנים נגד ריבוזומלי P (Ribo P) על פני רחב מגוון של דילולים בסרום. בסרום בקרה חיובי בניסוי זה מחול עם זאבת אדמנתית מערכתית עם תגובתיות ידוע נגד Ribo P היה בשימוש. ליןתגובות אוזן הם נצפו בערוץ IgM על כל הדילולים בסרום. התגובות לינארי הם נצפו בערוץ IgG עד MFI-B של 30,000 כ. לאחר מועד זה, התגובות מתחילות להרוות ועליית נוגדני Ribo P אינה מובילה גידול מקביל MFI-B. איור 5 מראה כיצד המערכים יכולים לשמש כדי לזהות גורם שגרוני בסרום אדם. במחקר זה, סרום מחול עם וסקוליטיס cryoglobulinemic עם גורם שגרוני מתועד (נוגדני IgM נגד IgG) של 167 IU / ml (הרגילה <11 IU / ml) היה בשימוש. באמצעות נוגדנים משני לבד, אין תגובתיות IgM נתפסת כנגד IgG כי הוא הבחין על גבי המערך. לעומת זאת, תגובתיות IgM המשמעותיות (MFI-B של כ -5,000) מזוהות נגד IgG כאשר הסליידר ומשש עם סרום מהחולה עם גורם מפרקים שגרוני. איור 6 מציג את הפיתוח של microarray אנטיגן שני צבעים לשימוש עם סרום עכבר. בנתון זה, ה עכבר IgMבבית הוא הבחין על גבי מערך מזוהה רק על ידי נוגדנים משני אנטי עכבר IgM, ו IgG עכבר כי הוא הבחין על גבי מערך מזוהה רק על ידי נוגדנים משני אנטי עכבר IgG. איור 7 מראה יישור של רשת תבנית על סרק תמונת מערך באמצעות תוכנת ניתוח microarray. לאחר תכונות מערך כבר מיושר עם הרשת, תכונות מערך ניתן לנתח כדי להשיג עוצמת הקרינה החציונית מינוס רקע עבור כל תכונה.

איור 1
דור באיור 1. של Antigen Microarrays. אנטיגנים ממוקמים ראשון בצלחת המקור. בצלחת המקור שמוצגת באיור, אנטיגנים מסודרים בקבוצות של 9, התאמת פריסת 3 x 3 של סיכות ראש ההדפסה. צלחת המקור מכן תוצב microarrayer רובוטית ואת אנטיגנים הוא ואז הבחינו על השקופיות. בדוגמה זו, 2-pad שקופיות FAST arהדואר בשימוש, ומאפשר טיפול מערכים זהים להיות הבחין על 2 משטחי nitrocellulose. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
עיבוד איור 2. של Antigen Microarrays. השקופיות ממוקמים במסגרות FAST באמצעות תאי הדגירה מעובדים על ידי הוספת דגימות ואז נוגדנים משני. reactivities Antigen מתגלים עם סורק מסוגל לאתר אותות ניאון. התמונה הסרוקה של שקופית 2-pad FAST מוצגת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3 <br /> איור 3. שני צבעים אופטימליים Microarrays Antigen לשימוש עם האדם סרה. (א) IgG, IgM, ו IgG Fc מזוהים על המערך חקר רק עם נוגדנים משני. אנטיגנים השלושה אלה הם שולטים חיוביים להראות את הספציפיות של הנוגדנים משני. קרינה אדומה (ערוץ IgM) מציינת מחייב של הנוגדנים משני IgM אנטי אנושיים. קרינת גרין (ערוץ IgG) מציינת מחייב של הנוגדנים משני IgG אנטי אנושיים. האנטיגן IgG Fc הוא לבן בשל oversaturation. (ב) רב יותר reactivities מזוהה על המערך ומשש עם סרום בקרה חיובי מחול עם זאבת אדמנתית מערכתית עם תגובתיות ידוע לאנטיגן Ribo P. תיבות לציין את המקומות שבהם אנטיגנים דנ"א Ribo P כבר ערוכים. (C) כימות של עוצמות הקרינה בנסיוב בקרה חיובית מגלה כי הרוב המכריע של reactivities נוגדנים נגד אנטיגנים DNA הם של איגM אלוטיפ. (ד) כימות של עוצמות הקרינה בנסיוב בקרה חיובית מגלה כי הרוב המכריע של reactivities נוגדנים נגד אנטיגנים Ribo P הם של אלוטיפ IgG. תכונות מערך הם הבחינו בשני עותקים והם כ 500 מיקרומטר קוטר. הגרפים מציגים את ממוצע ± סטיית תקן עבור תכונות המערך. dsDNA, DNA גדילי כפול; ssDNA, גדילי הדנ"א יחיד; MFI-B, עוצמת הקרינה החציונית מינוס רקע; Ribo P, ריבוזומלי פ אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
עוצמת הקרינה איור 4. לעומת סרום דילול פקטור. (א) MFI-B על פני טווח רחב של דילולים בסרום מוצג עבור IgM נגד ssDNA ו IgG נגד Ribo פ עבור אלהניסויים, סרום שליטה חיובית עם תגובתיות ידוע IgG נגד Ribo P ו ssDNA היה בשימוש. MFI-B רווי לפי שווי של כ 65,000. (ב) שינוי log2 של נתוני MFI-B מגלה תגובות ליניארי בשני ערוצי IgG ו IgM פני טווח רחב של reactivities אנטיגן. במשך MFI-B של 30,000, אות IgG מתחילה להרוות מאבד ליניאריות. תכונות מערך נצפו 6 משכפל. הגרפים מציגים את ממוצע ± סטיית תקן עבור תכונות המערך. ssDNA, גדילי הדנ"א יחיד; MFI-B, עוצמת הקרינה החציונית מינוס רקע; Ribo P, ריבוזומלי פ אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איתור איור 5. של פקטור שגרוני עם Microarrays Antigen שני צבעים. (ב) מערך ומשש עם סרום מחול עם וסקוליטיס cryoglobulinemic עם גורם שגרוני גבוה. תכונת IgG היא ירוקה-צהובה בשל מחייב של IgM בנסיוב של החולה משותק IgG. מעניין, החולה הזה יש גם נוגדני IgG נגד IgM כמאפיין IgM מופיע כתום. החולה גם יש היסטוריה של מחלת לב מולדת, והוא ציין שיש תגובתיות גבוהה אל טרופונין חלבון לב ג (ג) כימות של IgG ו- IgM התכונות על המערך חקר רק עם נוגדנים משני מראה כי נוגדנים משני אין כל crossreactivity. (ד) כימותמתכונות IgG ו IgM על המערך ומשש עם סרום החולה מאשר את נוכחותו של גורם מפרקים שגרוני. תכונות הם הבחינו בשני עותקים והם כ 500 מיקרומטר קוטר. הגרפים מציגים את ממוצע ± סטיית תקן עבור תכונות המערך. MFI-B, עוצמת הקרינה החציונית מינוס ברקע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. פיתוח מערכי שני צבעים לפרופיל עכבר סרום נוגדנים. (א) מערך חקר רק עם נוגדנים משני. קרינה אדומה מציינת מחייב של הנוגדנים משני אנטי העכבר IgM. קרינה ירוקה מציינת מחייב של הנוגדנים משני אנטי העכבר IgG. IgG העכבר כי הוא הבחין על גבי המערך מזוהה רק על ידי-mou אנטיse IgG נוגדנים משני, והעכבר IgM כי הוא הבחין מזוהה רק על ידי נוגדנים משני אנטי עכבר IgM. התכונות האחרות על המערכים כי מזוהה על ידי הנוגדנים משני הן נוגדנים לכידים נגד IgG עכבר או עכבר IgM. (ב) מערך ומשש עם נוגדנים חד שבטיים עכבר IgG נגד תגי היסטידין. על מערך זה, האנטיגן Ribo P (רקומביננטי חלבון שלו מתויג) הוא ירוק, המציין כי הוא מזוהה רק על ידי נוגדנים משני אנטי עכבר IgG. זה צפוי בהתחשב בעובדה נוגדן מונוקלונאלי הוא של אלוטיפ IgG. האנטיגן Ribo P הוא לא זוהה כאשר שמערכים ומישש עם נוגדנים משני לבד (תיבת כתום). (ג) כימות של IgG, IgM, ו Ribo P תכונות על מערך ומישש עם נוגדן חד-שבטי IgG עכבר נגד תגי היסטידין. תכונות מערך הם הבחינו בשישה משכפל והם כ 500 מיקרומטר קוטר. הגרפים מציגים את ממוצע ± סטיית תקן עבור תכונות המערך. MFI-B, חציון פלואורידescence עוצם מינוס רקע; Ribo P, ריבוזומלי פ אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7. מערך של גריד תבנית על תמונת Array. ב מסך זה, רשת תבנית, אשר נוצרה מתוך קובץ גל, היה מתואם עם microarray אנטיגן סרק בעבר. המערך עבר מבחנים עם סרום מחול עם זאבת אדמנתית מערכתית פגיעה במערכת קרישה אשר הייתה הרבה reactivities רקם. קרינה ירוקה מייצגת מחייב של נוגדני IgG קרינה אדומה מייצגת מחייב של נוגדני IgM. התכונות מודפסות על ידי סיכות מוצקות הם כמעט מעגלות מתואר בקלות על ידי תוכנת microarray (GenePix). לאחר יישור הרשת יושלם, softwarדואר יכול לחשב את עוצמת הקרינה החציונית מינוס רקע (משני הערוצים Cy3 ו Cy5) עבור כל אחת מהתכונות המערך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר כימות של נוגדנים עצמיים באמצעות טכניקת microarray אנטיגן. microarrays Antigen להציע מספר יתרונות על פני קונבנציונאלי ELISA ב בדיקות סקר לאיתור נוגדנים עצמיים. קודם כל, מגוון רחב של אנטיגנים כולל חומצות גרעין, חלבונים, פפטידים, ו lysates תא ניתן ערוך על השקופיות צופה nitrocellulose, ובכך מאפשר להקרנה מרובבת של נוגדנים עצמיים. בנוסף, רק מיקרוגרם של אנטיגן נחוץ על מנת ליצור את המערכים מאז nanoliters של אנטיגן הם הבחינו על כל שקופית. המערכים גם דורשים מדגם מטופלים מעט מאוד, כמו שרק 5 μl של בסרום יש צורך לחקור משטח מערך ביחס של 1: דילול מדגם 100. לבסוף, מערכים הבחינו על nitrocellulose הוכחו להיות רגיש יותר קונבנציונלי ELISA בהקרנה עבור נוגדנים עצמיים 9.

בנוסף באמצעות מערכי אנטיגן למסך נוגדנים עצמיים, המערכים ניתן להשתמשד כדי לאתר תגובתיות נגד חלבונים שאינם עצמית (למשל, חלבונים נגיפיים), להגדיר את הספציפיות של נוגדנים חד שבטיים, כדי למדוד את רמות הנוגדנים הלא HLA בהשתלות כפי שתואר לעיל 9-12. microarrays Antigen יכול לשמש גם כדי לבצע ניסויי מיפוי epitope המפורט שבו פפטידים חופפים של חלבון יחיד מסודרים לשקופית. מחקר שנערך לאחרונה השתמש בגישה זו כדי להגדיר אפיטופים של חלבון U1-70K כי הם מטרות של נוגדנים עצמיים ב זאבת אדמנתית מערכתית 13.

באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן, זיהוי של IgG ו- IgM reactivities הוא ליניארי על פני טווח רחב של דילולים בסרום. מחקרים אלו בוצעו תוך שימוש בסרום בקרה חיובי מחול עם זאבת אדמנתית מערכתית עם תגובתיות ידוע לאנטיגן ריבוזומלי P ו ssDNA. IgM בתגובתיות ssDNA הוא ליניארי ב דילולים בסרום של 1: 125 עד 1: 32,000, המתאים MFI-B של 17,000 עד 50. IgG בתגובתיותRibo P הוא ליניארי ב דילולים בסרום של 1: 4000 עד 1: 512,000, מתאים MFI-B של 32,000 עד 200. בשעת דילולים נמוכים מ -1: 4000 (ו MFI-B יותר מ -32,000), עקומת זיהוי של משטחת תגובתיות IgG והוא כבר לא ליניארי. בעבודה עם מושתלי לב, סרום הוא מדולל באופן שגרתי עד 1: 100 כמו MFI-B עבור אנטיגנים לעתים רחוקות עולה 10,000 בדילול זה. עבור מחקרים עם חולי מחלה אוטואימונית עם נוגדנים עצמיים כייל גבוה, דגימות חולות ייתכן שתהיינה צורך מדולל יותר כדי להבטיח כי הרוב המכריע של reactivities רקם לנפול בטווח ליניארי של assay.

בעוד MFI-B יכול להיות שימושי כדי להשוות reactivities רקם בין קבוצות חולות, זה יכול להיות גם שימושי כדי להמיר ערך זה לתוך מדד כמוני יותר של רמות נוגדנים. ניתן להשיג זאת על ידי איתור דילולים ידועים מרובים של מטוהרי IgG ו IgM על השקופיות כדי ליצור עקומה סטנדרטית. באמצעות עקומה זו, MFI-B אז יכול להיות טרנסנוצר לתוך רמת נוגדן עבור כל אנטיגן.

בפרוטוקול המובא כאן, 2-pad מצופה nitrocellulose שקופיות שימשו. בשקופיות הבאות, שני מערכים זהים, אשר יכול להיות נחקרים עם שתי דגימות סרום נפרדות, מודפסים על כל שקופית. זה מאפשר שתי דגימות מאותו המטופל (כגון קדם וטיפול פוסט) כדי להשוות על אותו השקופיות, אשר ממזערת השתנות interslide. שלושים ושתיים שקופיות עם 64 דגימות החולה האינדיבידואלי מעובדים באופן שגרתי בעת ובעונה אחת ביום אחד. המערך הנוכחי ביותר מודפס עם 9 פינים, המאפשר 162 אנטיגנים שיודפס בשני עותקים (כל סיכה מדפיסה subarray 36 תכונה אשר שווה 18 אנטיגנים מודפסים בשני עותקים).

Microarrays אנטיגן שנוצר בפרוטוקול זה הודפס עם סיכות microarrayer מוצקות. הדפסה עם סיכות מוצקות יותר זמן רב יותר מהדפסה עם סיכות בסגנון נוצה מאז microarrayer חייב מחדש מטבל לתוך צלחת המקור לאחר כל tIME כי הסיכות לגעת במשטח השקופיות. פינים מלאים שימשו שהם מייצרים, תכונות מערך מעגלי מאוד לשחזור כמעט (כ 500 מיקרומטר קוטר). תכונות אלה ניתן לאתר בקלות שהתוו בתוכנת הסורק, והתאמות ידניות מינימאליות נדרשות לכמת את תכונות המערך. פינים מלאים גם לאפשר lysates תא מיועד להדפסה, אשר עשוי להיות קשה להדפיס עם סיכות נוצה בשל הצמיגות הגבוהה יותר שלהם. בשל פעמי ההדפסה הארוכות מעורבות עם סיכות מוצקות (לפעמים 10 - 11 שעות כדי להדפיס 70 שקופיות), אנטיגנים כי אינם מודפסים בצלחת המקור מכוסים בנייר כסף כדי למנוע אידוי.

הפרוטוקול המתואר כאן מציג שיטה להפריד IgG ו IgM reactivities על אותו משטח שקופיות. מערכי מוטבו למסך הוא נוגדנים אנושיים ועכבר באמצעות זוגות של נוגדנים משני שכותרתו עם fluorophores השונה. קריטי גישה דו-צבע זה הוא זיהוי secoנוגדנים ndary והמתאימים ביותר עבור isotypes או IgG או IgM. הנוגדנים משני המשמשים להכיר חלק Fc של IgG או IgM ואינו צולב להגיב אחד עם השני. הפרדת אותות IgG ו IgM חשוב בהתחשב הפונקציות השונות של נוגדנים אלה תגובות חיסוניות. לדוגמא, IgM מיוצר ברמות גבוהות יותר על ידי תאי B1 והיא בדרך כלל כסמן של תגובה חיסונית מוקדם. מצד השני, IgG הוא סמן של תגובה חיסונית מאוחר יותר, מפתחת כתוצאת כיתת מיתוג 14. על ידי גילוי אותות IgG ו IgM בנפרד, אפשר גם לזהות גורמים שגרוניים IgM בדגימות מטופל (כלומר, נוגדני IgM אשר נקלטים על ידי IgG כי כבר הבחינו על גבי המערך). על ידי איתור חלקים שונים של נוגדנים (למשל, Fc לעומת Fab), מחייב של גורם שגרוני כדי אפיטופים נוגדן IgG שונים ניתן לכמת. עם הזמינות של סורקים עם יותר משני לייזרים, שני נוסףנוגדנים האר"י ניתן להוסיף את צמד נוגדנים משני הנוכחי לזהות מחייב של IgA, נוגדנים IGD או IgE. נוגדנים משני גם ניתן היה לזהות שתאפשר זיהוי של subclasses IgG נפרד (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) כבול אנטיגנים על מערך יחיד.

לסיכום, טכניקת microarray אנטיגן היא טכנולוגיה חזקה המאפשרת אפיון התפוקה הגבוהה של נוגדנים עצמיים בסרום. טכניקה זו היא להתאמה אישית ורגישה. מערכת זיהוי מבוסס פלורסנט כבר מותאמת הן מחקרים בבני אדם ועכבר ומאפשרת זיהוי סימולטני של נוגדנים מסוג IgG ו IgM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ribosomal P0 Diarect 14100 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG Jackson Immuno 009-000-003 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM Jackson Immuno 009-000-012 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG Sigma-Aldrich I5381 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM Biolegend 401601 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA Sigma-Aldrich D1626 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA Sigma-Aldrich D8899 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer Virtek VersArray Chipwriter Pro many types of arrayers are suitable
solid printing pins Arrayit Corporation SSP015
software for robotic microarrayer Virtek Chipwriter Pro 
FAST slides (2 Pad) GVS Northa America 10485317
FAST frame GVS Northa America 10486001
FAST incubation chambers (2 Pad) GVS Northa America 10486242
384 well plates Whatman 7701-5101
plate sealers VWR 60941-062
foil plate covers VWR 60941-124
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Fetal calf serum Invitrogen 12483020
Cy3 goat anti-human IgG Jackson Immuno 109-165-096 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM Jackson Immuno 109-175-129 use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG Jackson Immuno 115-165-071 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM Jackson Immuno 115-175-075 use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner Molecular Devices Axon 4200A
Microarray software Molecular Devices Genepix 6.1
Clustering software eisenlab.org Cluster 3.0
Heatmap software eisenlab.org Treeview 1.60
Microarray statistical software Stanford University SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
  2. Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention. Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).
  3. Robinson, W. H., et al. Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses. Nature. medicine. 8, 295-301 (2002).
  4. Quintana, F. J., et al. Antigen microarrays identify unique serum autoantibody signatures in clinical and pathologic subtypes of multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18889-18894 (2008).
  5. Hueber, W., et al. Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 52, 2645-2655 (2005).
  6. Price, J. V., et al. Protein microarray analysis reveals BAFF-binding autoantibodies in systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 123, 5135-5145 (2013).
  7. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5116-5121 (2001).
  8. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14863-14868 (1998).
  9. Chruscinski, A., et al. Generation of Antigen Microarrays to Screen for Autoantibodies in Heart Failure and Heart Transplantation. PloS one. 11, e0151224 (2016).
  10. Price, J. V., et al. Characterization of influenza vaccine immunogenicity using influenza antigen microarrays. PloS one. 8, e64555 (2013).
  11. Singh, H., et al. Reactivity profiles of broadly neutralizing anti-HIV-1 antibodies are distinct from those of pathogenic autoantibodies. Aids. 25, 1247-1257 (2011).
  12. Porcheray, F., et al. Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses. Transplantation. 89, 1239-1246 (2010).
  13. Haddon, D. J., et al. Mapping epitopes of U1-70K autoantibodies at single-amino acid resolution. Autoimmunity. 48, 513-523 (2015).
  14. Schroeder, H. W. Jr, Cavacini, L. Structure and function of immunoglobulins. J Allergy Clin Immunol. 125, S41-S52 (2010).
דור שני צבעים Antigen Microarrays לאיתור סימולטני של IgG ו- IgM נוגדנים עצמיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).More

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter