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Immunology and Infection

आईजीजी और आईजीएम Autoantibodies का एक साथ जांच के लिए दो-रंग एंटीजन प्रोटीन की पीढ़ी

doi: 10.3791/54543 Published: September 15, 2016

Protocol

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1. गिराए एंटीजन और जनरेटिंग एंटीजन प्रोटीन

  1. 0.2 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए पीबीएस में एंटीजन पतला। 9 पिन के साथ एक microarrayer विन्यास के साथ दो प्रतियों में 162 अप करने के लिए अद्वितीय एंटीजन प्रिंट। प्रतिजन पुस्तकालय के रूप में सकारात्मक नियंत्रण में आईजीजी और आईजीएम एंटीजन को शामिल करें। केवल एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में पीबीएस शामिल करें।
  2. 384 में अच्छी तरह से स्रोत थाली करने के लिए प्रत्येक प्रतिजन के 20 μl जोड़ें। समूहों है कि printhead की स्थापना के आईने में स्रोत थाली करने के लिए एंटीजन जोड़ें (जैसे, एंटीजन 9 के समूह में जब 9 पिन मुद्रण के लिए उपयोग किया जाता है व्यवस्था)।
  3. -80 डिग्री सेल्सियस सरणियों मुद्रित करने के लिए तैयार है जब तक पर पन्नी और फ्रीज के साथ कवर स्रोत थाली।
  4. 3 एक्स 1 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी के साथ एक sonicating स्नान में उन्हें incubating द्वारा ठोस microarrayer पिन साफ ​​करें। रैक में रखें पिन सुखाने के लिए और फिर माइक्रोएरे printhead में पिन की व्यवस्था। 9 पिन के लिए, एक 3 एक्स 3 विन्यास का उपयोग करें।
  5. प्रिंट के लिए कार्यक्रम microarrayer printhead पर नंबर पिन की स्थापना से चलाने के लिए,स्लाइड्स की संख्या प्रत्येक स्लाइड पर मुद्रित करने के लिए, पैड की संख्या, और प्रत्येक प्रतिजन के लिए दोहराने स्पॉट की संख्या। आमतौर पर, 9 पिन, 70 स्लाइड्स, 2 पैड / स्लाइड, और प्रत्येक प्रतिजन के लिए 2 दोहराने स्पॉट का उपयोग करें। कार्यक्रम microarrayer एंटीजन के विभिन्न समूहों के बीच पानी में पिन sonicate करने के लिए।
  6. पिघलना स्रोत प्लेट और 100 x जी पर 1 मिनट के लिए तो सेंट्रीफ्यूज थाली। microarrayer में निर्दिष्ट स्थान में स्रोत प्लेट रखें। पन्नी की धारा कि एंटीजन के पहले समूह को कवर है मुद्रित करने के लिए निकालें।
  7. arrayer सतह और चलाने के प्रिंट कार्यक्रम पर अमुद्रित स्लाइड की व्यवस्था। सरणी मशीन के humidifier में निर्माण के साथ 60% - नमी के साथ आरटी पर प्रिंट स्लाइड 55 में arrayer पर निर्धारित किया है।
  8. एंटीजन के प्रत्येक समूह के बाद सभी स्लाइड्स पर मुद्रित किया जाता है, microarrayer थामने। (वाष्पीकरण को रोकने के लिए) एंटीजन कि सिर्फ पन्नी के साथ छपी थी कवर और उजागर एंटीजन के अगले समूह मुद्रित करने के लिए। प्रिंट कार्यक्रम जारी।
  9. के बाद सभी एंटीजन मुद्रित किया गया है, कवर स्रोत pl-80 डिग्री सेल्सियस पर पन्नी और फ्रीज का नया टुकड़ा के साथ खाया। स्लाइड बॉक्स और वैक्यूम मुहर में मुद्रित स्लाइड रखें। स्लाइड अगले दिन तक के लिए एक महीने के बाद में इस्तेमाल किया जा सकता है या।

2. पतला सीरा के साथ एंटीजन प्रोटीन जांच

  1. स्लाइड ऊष्मायन कक्षों का उपयोग कर फ्रेम में रखें। प्रत्येक सरणी सतह को अवरुद्ध बफर (2.5% [/ खंड खंड] भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), 0.1% [/ खंड खंड] पीबीएस में बीच 20) के 700 μl जोड़ें।
  2. फ्रेम और जगह पर चिपकने वाली फिल्म गीले टिश्यू का एक टुकड़ा के साथ एक मोहरबंद कंटेनर में रखें। 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन एक घुमाव पर।
  3. अवरुद्ध बफर में 100: पतला सीरम नमूनों 1। महाप्राण सरणियों से अवरुद्ध समाधान और प्रत्येक सरणी सतह को पतला नमूना के 500 μl जोड़ें।
  4. चिपकने वाली फिल्म के साथ कवर और कमाल के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  5. बफर अवरुद्ध में माध्यमिक एंटीबॉडी पतला। मानव अध्ययन के लिए, 0.33 माइक्रोग्राम / एमएल और एक Cy5 के लिए एक Cy3 लेबल बकरी विरोधी मानव आईजीजी एंटीबॉडी पतला लेबल बकरी विरोधी हुमा0.25 माइक्रोग्राम / एमएल n करने के लिए आईजीएम एंटीबॉडी। माउस के अध्ययन के लिए, पतला एक Cy3 0.38 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर बकरी विरोधी माउस आईजीजी एंटीबॉडी लेबल और एक Cy5 0.7 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर बकरी विरोधी माउस आईजीएम एंटीबॉडी लेबल।
  6. सरणियों से महाप्राण नमूने और कुल्ला बफर (पीबीएस में 0.1% बीच 20) के साथ 4 बार कुल्ला सरणी सतहों। स्लाइड करने पर बफर और जल्दी से बंद झटका डालो।
  7. बफर अवरुद्ध कमाल के साथ आरटी पर प्रत्येक सरणी सतह धोने और 10 मिनट सेते के 700 μl जोड़ें। दोहराएँ धोने कदम दो बार।
  8. प्रत्येक स्लाइड सतह को पतला एंटीबॉडी के 500 μl जोड़ें और चिपकने वाली फिल्म के साथ कवर। कमाल के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए सेते हैं।
  9. स्लाइड से महाप्राण माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण और ऊपर के रूप में 4 बार कुल्ला। धो ऊपर के रूप में अवरुद्ध / कमजोर पड़ने बफर के 700 μl के साथ 3 बार स्लाइड।
  10. फ्रेम और धातु स्लाइड रैक में जगह है कि पीबीएस में डूब जाता है से स्लाइड्स निकालें। कक्षीय झटकों के साथ आरटी पर 20 मिनट सेते हैं। पीबीएस के नए कंटेनर में रखें और एक अन्य 20 मीटर सेतेझटकों के साथ में।
  11. विआयनीकृत पानी 15 सेकंड के कंटेनर में रखें स्लाइड रैक। पानी की एक नई कंटेनर में रैक जगह और एक और 15 सेकंड सेते हैं।
  12. सूखी स्लाइड, एक एलिसा प्लेट आरटी पर 5 मिनट के लिए 220 XG पर अपकेंद्रित्र और स्पिन में एडाप्टर पर जगह स्लाइड रैक के लिए।
  13. प्रकाश तंग बॉक्स में स्लाइड्स स्कैनिंग के लिए तैयार है जब तक रखें।

3. स्कैनिंग एंटीजन प्रोटीन और निर्यात डेटा

  1. स्कैन स्लाइड एक माइक्रोएरे स्कैनर कि Cy3 और Cy5 फ्लोरोसेंट संकेतों का पता लगाने कर सकते हैं का उपयोग कर। आदेश स्कैनर के photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) के स्तर को समायोजित करने के लिए, एक स्लाइड है कि केवल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ जांच की गई प्री-स्कैन।
    नोट: इस स्लाइड सकारात्मक (आईजीजी और आईजीएम) सहित उस पर छपी पूर्ण प्रतिजन पुस्तकालय के रूप में अच्छी तरह से नकारात्मक (पीबीएस) नियंत्रण होना चाहिए। पूर्व स्कैन एक कम संकल्प स्कैन इष्टतम पीएमटी सेटिंग खोजने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति देता है कि जल्दी है।
  2. पीएमटी मूल्यों इतना तय है कि मानव आईजीजी सुविधाओं (Cy3 चैनल पर) और गुंजनएक आईजीएम सुविधाओं (Cy5 चैनल पर) एक समान मंझला प्रतिदीप्ति तीव्रता शून्य पृष्ठभूमि (एमएफआई-बी) (आमतौर पर 40,000) है। पीएमटी का स्तर "हार्डवेयर" बटन दबाने से सेट कर रहे हैं। एक बार सेट, इन पीएमटी सेटिंग्स निरंतर रखने के लिए।
  3. "स्कैन" बटन दबाने से दो चैनलों पर प्रयोगात्मक स्लाइड स्कैन करें। प्रत्येक स्कैन के बाद स्लाइड छवियों (दोनों चैनलों) को बचाओ।
  4. स्लाइड लोड "फाइल" बटन का उपयोग करके माइक्रोएरे सॉफ्टवेयर में विश्लेषण किया जा सके।
  5. "फाइल" बटन का उपयोग करके जीन सरणी सूची (GAL) फ़ाइल लोड। लड़की फ़ाइल सरणी सुविधाओं की पहचान के साथ सरणी के लेआउट है।
  6. स्कैन छवि पर सरणी टेम्पलेट इतना है कि सरणियों सुविधाओं से यथासंभव टेम्पलेट मैच रखें।
  7. "संरेखित" बटन दबाने से टेम्पलेट के साथ सभी ब्लाकों में सुविधाओं संरेखित करें। कार्यक्रम आम तौर पर परिपत्र सुविधाओं की रूपरेखा मिल जाएगा, लेकिन कुछ मैनुअल समायोजन आवश्यक हो सकता है। ये समायोजन सुविधा मोड दर्ज करके बनाया जा सकता है। सॉफ्टवेयर तो एंटीजन से प्रत्येक के लिए एक एमएफआई-बी की गणना करेगा।
  8. एक पाठ फ़ाइल के रूप में इन परिणामों को निर्यात करने के लिए "फाइल" बटन का प्रयोग करें।

4. प्रोटीन का महत्व विश्लेषण के साथ विश्लेषण ऐरे डाटा (एसएएम)

  1. एक्सेल में अलग-अलग पाठ फ़ाइलों को लोड और कॉलम है कि Cy3 और Cy5 चैनलों के लिए एमएफआई-बी की पहचान।
  2. डुप्लीकेट सुविधाओं के लिए औसत की गणना।
  3. किसी भी नकारात्मक एमएफआई-B के लिए, की जगह 10 के साथ नकारात्मक संख्या लॉग आधार 2 की गणना के द्वारा 100 से कच्चे एमएफआई-बी विभाजन और उसके बाद से डेटा रूपांतरण।
  4. जैसा कि पहले 7 वर्णित प्रोटीन (एसएएम) का महत्व विश्लेषण के साथ लॉग तब्दील डेटा का विश्लेषण।
  5. दो समूहों (जैसे, स्वस्थ नियंत्रण बनाम रोगियों), लेबल एक समूह "1" और समूह का उपयोग कर एक अध्ययन के लिए "2." एंटीजन reactivities कि एस रहे हैं की पहचान करने के लिए सैम में एक दो वर्ग, अयुगल विश्लेषण का प्रयोग करेंignificantly दो समूहों के बीच अलग (क्यू मूल्य <0.05)।
  6. क्लस्टरिंग और गर्मी नक्शा पैदा सॉफ्टवेयर का प्रयोग प्रस्तुति 8 के लिए चित्र बनाने के लिए।

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Representative Results

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एंटीजन एक रोबोट microarrayer से एक 384 अच्छी तरह से थाली में व्यवस्थित कर रहे हैं और मुद्रित स्लाइड पर चित्र 1 में दिखाया गया है। चित्रा 2 ऊष्मायन कक्षों और प्रसंस्करण के बाद एक स्कैन स्लाइड के साथ एक फ्रेम में रखा स्लाइड पता चलता है। चित्रा 3 सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण स्लाइड पता चलता है। नकारात्मक स्लाइड केवल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ जांच कर रहा है, और सकारात्मक नियंत्रण स्लाइड प्रणालीगत एक प्रकार का वृक्ष के साथ एक रोगी से सीरम के साथ जांच कर रहा है। दो अलग-अलग लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके, आईजीजी और आईजीएम reactivities ही स्लाइड सतह पर अलग किया जा सकता है। चित्रा 4 एकल असहाय डीएनए (ssDNA) और आईजीजी एक विस्तृत खत्म ribosomal पी (ribo पी) के खिलाफ एंटीबॉडी के खिलाफ आईजीएम एंटीबॉडी के प्रतिदीप्ति तीव्रता से पता चलता है सीरम dilutions की सीमा होती है। Ribo पी के खिलाफ ज्ञात जेट के साथ प्रणालीगत एक प्रकार का वृक्ष के साथ एक रोगी से इस प्रयोग के सकारात्मक नियंत्रण सीरम में इस्तेमाल किया गया था। लिनकान की प्रतिक्रियाएं सभी सीरम dilutions खत्म आईजीएम चैनल पर मनाया जाता है। रैखिक प्रतिक्रियाओं लगभग 30,000 की एक एमएफआई-बी के लिए ऊपर आईजीजी चैनल पर मनाया जाता है। इस बिंदु के बाद, प्रतिक्रियाओं को तर करने के लिए शुरू और ribo पी के एंटीबॉडी में बढ़ जाती है एमएफआई-बी में एक इसी वृद्धि करने के लिए नेतृत्व नहीं है। 5 शो चित्रा कैसे सरणियों मानव सीरम में रुमेटी कारक पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस अध्ययन में, एक दस्तावेज रुमेटी कारक के साथ cryoglobulinemic वेसकुलिटिस के साथ एक रोगी से सीरम 167 आइयू / एमएल (सामान्य <11 आइयू / एमएल) के (आईजीजी के खिलाफ आईजीएम एंटीबॉडी) का इस्तेमाल किया गया था। अकेले माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग, कोई आईजीएम जेट आईजीजी कि सरणी पर देखा जाता है के खिलाफ देखा जाता है। इसके विपरीत, महत्वपूर्ण आईजीएम जेट (लगभग 5,000 की एमएफआई-बी) आईजीजी के खिलाफ का पता चला है जब स्लाइड रुमेटी कारक के साथ रोगी से सीरम के साथ जांच कर रहा है। चित्रा 6 माउस सीरम के साथ प्रयोग के लिए एक दो रंग प्रतिजन माइक्रोएरे के विकास को दर्शाता है। इस चित्र में, माउस आईजीएम वेंपर सरणी पर देखा जाता है केवल विरोधी माउस आईजीएम माध्यमिक एंटीबॉडी, और माउस आईजीजी उस पर सरणी केवल विरोधी माउस आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी से पता चला है देखा है के द्वारा पता चला है। एक स्कैन पर आंकड़ा एक टेम्पलेट ग्रिड के 7 शो संरेखण सरणी छवि माइक्रोएरे विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग। एक बार जब सरणी सुविधाएँ ग्रिड के साथ गठबंधन किया गया है, सरणी सुविधाएँ मंझला प्रतिदीप्ति तीव्रता शून्य से प्रत्येक सुविधा के लिए पृष्ठभूमि प्राप्त करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1. एंटीजन प्रोटीन। प्रतिजनों की पीढ़ी पहले स्रोत थाली में रखा जाता है। चित्र में दिखाया गया स्रोत प्लेट में, एंटीजन 9 के समूहों में व्यवस्थित कर रहे हैं, मिलान printhead पिन के 3 एक्स 3 लेआउट। स्रोत थाली तो रोबोट microarrayer में रखा गया है और एंटीजन तो स्लाइड पर देखा जाता है। इस उदाहरण में, 2-पैड फास्ट स्लाइड की गिरफ्तारीई इस्तेमाल किया, समान सरणियों के लिए अनुमति देता है पर 2 nitrocellulose सतहों देखा जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. एंटीजन प्रोटीन। स्लाइड्स के प्रसंस्करण ऊष्मायन कक्षों का उपयोग कर तेजी से फ्रेम में रखा जाता है और नमूने माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ने और फिर से कार्रवाई कर रहे हैं। एंटीजन reactivities एक स्कैनर फ्लोरोसेंट संकेतों का पता लगाने में सक्षम के साथ पता चला रहे हैं। एक 2-पैड तेजी से स्लाइड की स्कैन की गई छवि में दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन <br /> चित्रा 3. दो रंग मानव सीरा साथ प्रयोग के लिए एंटीजन प्रोटीन अनुकूलित। (ए) आईजीजी, आईजीएम और आईजीजी एफसी सरणी केवल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ जांच पर पता चला रहे हैं। ये तीन एंटीजन माध्यमिक एंटीबॉडी की विशिष्टता दिखाने के लिए सकारात्मक नियंत्रण कर रहे हैं। लाल प्रतिदीप्ति (आईजीएम चैनल) विरोधी मानव आईजीएम माध्यमिक एंटीबॉडी के बंधन को इंगित करता है। हरी प्रतिदीप्ति (आईजीजी चैनल) विरोधी मानव आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी के बंधन को इंगित करता है। आईजीजी एफसी प्रतिजन oversaturation के कारण सफेद है। (बी) के बहुत से अधिक reactivities सरणी ribo पी प्रतिजन के लिए जाना जाता जेट के साथ प्रणालीगत एक प्रकार का वृक्ष के साथ एक रोगी से सकारात्मक नियंत्रण सीरम के साथ जांच पर पता चला रहे हैं। बक्से स्थानों जहां डीएनए और ribo पी एंटीजन arrayed दिया है संकेत मिलता है। (सी) सकारात्मक नियंत्रण सीरम में प्रतिदीप्ति तीव्रता की मात्रा का पता चलता है कि डीएनए एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी reactivities के बहुमत के पुलिस महानिरीक्षक के हैंएम निर्धारण। (डी) सकारात्मक नियंत्रण सीरम में प्रतिदीप्ति तीव्रता की मात्रा का पता चलता है कि ribo पी एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी reactivities के बहुमत आईजीजी निर्धारण के हैं। सरणी सुविधाएँ दो प्रतियों में देखा और व्यास में लगभग 500 माइक्रोन कर रहे हैं। रेखांकन दिखाने मतलब ± सरणी सुविधाओं के लिए एसडी। dsDNA, डबल असहाय डीएनए; ssDNA, एकल असहाय डीएनए; एमएफआई-बी, मंझला प्रतिदीप्ति तीव्रता शून्य पृष्ठभूमि; Ribo पी, पी ribosomal यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. प्रतिदीप्ति तीव्रता बनाम सीरम कमजोर पड़ने कारक। (ए) सीरम dilutions की एक विस्तृत श्रृंखला पर एमएफआई-बी इन के लिए ssDNA और आईजीजी के खिलाफ आईजीएम के लिए दिखाया गया है ribo पी के खिलाफप्रयोगों, ribo पी और ssDNA के खिलाफ जाना जाता आईजीजी जेट के साथ सकारात्मक नियंत्रण सीरम का इस्तेमाल किया गया था। एमएफआई-बी लगभग 65,000 के एक मूल्य पर संतृप्त है। एमएफआई-बी डेटा का (बी) log2 परिवर्तन प्रतिजन reactivities की एक विस्तृत श्रृंखला पर दोनों आईजीजी और आईजीएम चैनलों पर रैखिक प्रतिक्रियाओं का पता चलता है। 30,000 के एक एमएफआई-बी से अधिक, आईजीजी संकेत तर करने के लिए शुरू होता है और linearity हारता। सरणी सुविधाएँ 6 प्रतिकृति में देखा गया था। रेखांकन दिखाने मतलब ± सरणी सुविधाओं के लिए एसडी। ssDNA, एकल असहाय डीएनए; एमएफआई-बी, मंझला प्रतिदीप्ति तीव्रता शून्य पृष्ठभूमि; Ribo पी, पी ribosomal यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. दो रंग एंटीजन प्रोटीन के साथ रुमेटी फैक्टर की जांच। (बी) सरणी एक उच्च रुमेटी कारक के साथ cryoglobulinemic वेसकुलिटिस के साथ एक रोगी से सीरम के साथ जांच की। आईजीजी सुविधा की वजह से मरीज के सीरम में आईजीएम के बंधन आईजीजी स्थिर करने के लिए हरी-पीला है। दिलचस्प है, यह रोगी के रूप में भी आईजीएम सुविधा नारंगी प्रकट होता है आईजीएम के खिलाफ आईजीजी है। रोगी भी जन्मजात हृदय रोग का एक इतिहास है और आईजीजी और आईजीएम सरणी केवल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ जांच पर सुविधाओं से पता चलता है कि माध्यमिक एंटीबॉडी की जरूरत नहीं है के हृदय प्रोटीन ट्रोपोनिन सी (सी) मात्रा को उच्च जेट राशि के लिए विख्यात है किसी भी crossreactivity। (डी) मात्रासरणी रोगी सीरम के साथ जांच पर आईजीजी और आईजीएम सुविधाओं के रुमेटी कारक की उपस्थिति की पुष्टि। विशेषताएं दो प्रतियों में देखा और व्यास में लगभग 500 माइक्रोन कर रहे हैं। रेखांकन दिखाने मतलब ± सरणी सुविधाओं के लिए एसडी। एमएफआई-बी, मंझला प्रतिदीप्ति तीव्रता शून्य पृष्ठभूमि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 दो रंग सारणियों का विकास प्रोफाइल करने के लिए माउस सीरम एंटीबॉडी। (ए) सरणी केवल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ जांच की। लाल प्रतिदीप्ति विरोधी माउस आईजीएम माध्यमिक एंटीबॉडी के बंधन को इंगित करता है। हरी प्रतिदीप्ति विरोधी माउस आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी के बंधन को इंगित करता है। माउस आईजीजी कि सरणी पर देखा जाता है केवल विरोधी समझौता ज्ञापन से पता चला हैएसई आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी, और माउस आईजीएम कि देखा है केवल विरोधी माउस आईजीएम माध्यमिक एंटीबॉडी से पता चला है। सरणियों कि माध्यमिक एंटीबॉडी से पता चला रहे हैं पर अन्य सुविधाओं माउस आईजीजी या माउस आईजीएम के खिलाफ कब्जा एंटीबॉडी कर रहे हैं। (बी) सरणी हिस्टडीन टैग के खिलाफ एक माउस आईजीजी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ जांच की। इस सरणी पर, ribo पी प्रतिजन (उनकी टैग प्रोटीन पुनः संयोजक) का संकेत है कि यह केवल विरोधी माउस आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी से पता चला है, हरा है। यह देखते हुए कि मोनोक्लोनल एंटीबॉडी आईजीजी निर्धारण की है उम्मीद है। Ribo पी प्रतिजन का पता चला है नहीं जब सरणियों अकेले माध्यमिक एंटीबॉडी (नारंगी बॉक्स) के साथ जांच कर रहे हैं। (सी) आईजीजी, आईजीएम की मात्रा, और ribo पी सरणी हिस्टडीन टैग के खिलाफ एक माउस आईजीजी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ जांच पर पेश करता है। सरणी सुविधाएँ छह प्रतिकृति में देखा और व्यास में लगभग 500 माइक्रोन कर रहे हैं। रेखांकन दिखाने मतलब ± सरणी सुविधाओं के लिए एसडी। एमएफआई-बी, मंझला स्त्रावतीव्रता शून्य पृष्ठभूमि escence; Ribo पी, पी ribosomal यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7. एक खाका ग्रिड के संरेखण एक सरणी छवि पर। इस स्क्रीनशॉट में, एक टेम्पलेट ग्रिड, जो एक लड़की फ़ाइल से उत्पन्न किया गया था, एक पहले से स्कैन प्रतिजन माइक्रोएरे के साथ गठबंधन किया था। सरणी प्रणालीगत एक प्रकार का वृक्ष और एक रक्त के थक्के विकार है जो कई स्वप्रतिपिण्ड reactivities था के साथ एक रोगी से सीरम के साथ जांच की गई थी। हरी प्रतिदीप्ति आईजीजी के बंधन का प्रतिनिधित्व करता है और लाल प्रतिदीप्ति आईजीएम एंटीबॉडी के बंधन का प्रतिनिधित्व करता है। ठोस पिन से मुद्रित सुविधाओं लगभग गोल कर रहे हैं और आसानी से माइक्रोएरे सॉफ्टवेयर (GenePix) द्वारा रेखांकित कर रहे हैं। एक बार जब ग्रिड संरेखण पूरा हो गया है, softwarई सरणी सुविधाओं में से प्रत्येक के लिए औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता शून्य पृष्ठभूमि (दोनों Cy3 और Cy5 चैनलों पर) की गणना कर सकते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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यहां वर्णित प्रोटोकॉल प्रतिजन माइक्रोएरे तकनीक का उपयोग कर स्वप्रतिपिंडों की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है। एंटीजन प्रोटीन स्वप्रतिपिंडों के लिए स्क्रीनिंग में पारंपरिक एलिसा पर कई लाभ प्रदान करते हैं। सबसे पहले, न्यूक्लिक एसिड, प्रोटीन, पेप्टाइड्स, और सेल lysates सहित एंटीजन की एक किस्म nitrocellulose लेपित स्लाइड पर arrayed जा सकता है, इस प्रकार स्वप्रतिपिंडों की मल्टिप्लेक्स स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, प्रतिजन का केवल माइक्रोग्राम सरणियों उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हैं के बाद से प्रतिजन की nanoliters प्रत्येक स्लाइड पर देखा जाता है। 100 नमूना कमजोर पड़ने: सरणियों के रूप में भी सीरम का केवल 5 μl एक 1 पर एक सरणी सतह की जांच करने की जरूरत है, बहुत कम रोगी के नमूने की आवश्यकता है। अंत में, सरणियों देखा nitrocellulose पर स्वप्रतिपिंडों 9 के लिए स्क्रीनिंग में पारंपरिक एलिसा तुलना में अधिक संवेदनशील होना दिखाया गया है।

प्रतिजन प्रोटीन का उपयोग कर स्वप्रतिपिंडों के लिए स्क्रीन के अलावा, सारणियों का उपयोग हो सकता हैघ गैर आत्म प्रोटीन (जैसे, वायरल प्रोटीन) के खिलाफ जेट पता लगाने के लिए, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की विशिष्टता को परिभाषित करने के लिए, और जैसा कि पहले 9-12 वर्णित प्रत्यारोपण में गैर-एचएलए एंटीबॉडी के स्तर को मापने के लिए। एंटीजन प्रोटीन भी विस्तृत मिलान मानचित्रण प्रयोगों जहां एक ही प्रोटीन की ओवरलैपिंग पेप्टाइड्स एक स्लाइड पर arrayed रहे प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हाल ही में एक अध्ययन है कि प्रणालीगत एक प्रकार का वृक्ष 13 में स्वप्रतिपिंडों का लक्ष्य कर रहे हैं U1-70K प्रोटीन की epitopes परिभाषित करने के लिए इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, आईजीजी और आईजीएम reactivities का पता लगाने के सीरम dilutions की एक विस्तृत श्रृंखला पर रैखिक है। इन अध्ययनों ribosomal पी प्रतिजन और ssDNA करने के लिए जाना जाता जेट के साथ प्रणालीगत एक प्रकार का वृक्ष के साथ एक रोगी से सकारात्मक नियंत्रण सीरम का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया। , 32,000 करने के लिए 17,000 50 को आईजीजी जेट की एमएफआई-बी के लिए इसी: 125 1: ssDNA के लिए आईजीएम जेट 1 के सीरम dilutions पर रैखिक है, 512000 200 के लिए 32,000 से एमएफआई-बी के लिए इसी 1 की तुलना में कम से कम dilutions: 1 के लिए 4000: ribo पी 1 के सीरम dilutions पर रैखिक है 4000 (एमएफआई और बी 32,000 से अधिक), आईजीजी जेट दुबला बना देती है का पता लगाने के वक्र और अब रैखिक है। हृदय प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं के साथ काम में, सीरम को नियमित करने के लिए 1 पतला है: 100 के रूप में एंटीजन के लिए एमएफआई-बी शायद ही कभी इस कमजोर पड़ने पर 10,000 से अधिक है। उच्च अनुमापांक स्वप्रतिपिंडों साथ autoimmune रोग के साथ रोगियों के साथ पढ़ाई के लिए, रोगी के नमूने सुनिश्चित करने के लिए कि स्वप्रतिपिण्ड reactivities के बहुमत परख के रैखिक सीमा के भीतर गिर आगे पतला होना पड़ सकता है।

एमएफआई-बी के रोगियों के समूहों के बीच स्वप्रतिपिण्ड reactivities तुलना करने के लिए उपयोगी हो सकता है, यह भी स्वप्रतिपिण्ड स्तर के एक और मात्रात्मक उपाय में इस मूल्य में परिवर्तित करने के लिए उपयोगी हो सकता है। इस स्लाइड पर शुद्ध आईजीजी और आईजीएम के कई नाम से जाना जाता dilutions खोलना एक मानक वक्र उत्पन्न करने के द्वारा पूरा किया जा सकता है। इस वक्र का प्रयोग, एमएफआई-बी तो पार हो सकता हैप्रत्येक प्रतिजन के लिए एक स्वप्रतिपिण्ड स्तर में गठन किया था।

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, 2-पैड nitrocellulose लेपित स्लाइड इस्तेमाल किया गया। इन स्लाइड पर, दो समान सरणियों, जो दो अलग सीरम नमूनों के साथ जांच की जा सकती है, प्रत्येक स्लाइड पर मुद्रित कर रहे हैं। यह वही रोगी (जैसे पहले और बाद के इलाज के रूप में) से दो नमूने एक ही स्लाइड, जो interslide परिवर्तनशीलता को कम करता है पर तुलना करने के लिए अनुमति देता है। 64 रोगी व्यक्ति के नमूनों के साथ बत्तीस स्लाइड नियमित रूप से एक दिन में एक ही समय में कार्रवाई कर रहे हैं। सबसे वर्तमान सरणी, 9 पिन के साथ मुद्रित किया जाता है 162 एंटीजन की अनुमति के लिए दो प्रतियों में मुद्रित करने के लिए (प्रत्येक पिन एक 36 फीचर subarray जो 18 एंटीजन दो प्रतियों में मुद्रित बराबर प्रिंट)।

प्रतिजन इस प्रोटोकॉल में उत्पन्न प्रोटीन ठोस microarrayer पिन के साथ मुद्रित किया गया। ठोस पिन के साथ मुद्रण अधिक समय कलम शैली पिन के साथ मुद्रण के बाद से microarrayer प्रत्येक टी के बाद स्रोत थाली में फिर से डुबकी चाहिए की तुलना में काफ़ी हैIME कि पिन स्पर्श स्लाइड सतह। ठोस पिन का इस्तेमाल किया गया के रूप में वे अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, लगभग परिपत्र सरणी सुविधाएँ (व्यास में लगभग 500 माइक्रोन) का उत्पादन। इन सुविधाओं को आसानी से पता लगाया जा सकता है और स्कैनर सॉफ्टवेयर द्वारा उल्लिखित, और कम से कम मैनुअल समायोजन सरणी सुविधाएँ यों की जरूरत है। ठोस पिन भी सेल lysates के लिए अनुमति मुद्रित करने के लिए, अपनी उच्च चिपचिपाहट के कारण कलम पिन के साथ मुद्रित करने के लिए मुश्किल हो सकता है। ठोस पिन के साथ शामिल लांग मुद्रण समय की वजह से (कभी कभी 10 - 11 घंटा के 70 स्लाइड्स मुद्रित करने के लिए), एंटीजन कि स्रोत थाली में मुद्रित नहीं किया जा रहा है वाष्पीकरण को रोकने के लिए पन्नी के साथ कवर कर रहे हैं।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक ही स्लाइड सतह पर आईजीजी और आईजीएम reactivities अलग करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। सरणियों दोनों मानव और माउस अलग fluorophores के साथ लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के जोड़े का उपयोग एंटीबॉडी के लिए स्क्रीन के लिए अनुकूलित किया गया है। इस दो रंग दृष्टिकोण के लिए महत्वपूर्ण Seco की पहचान हैndary एंटीबॉडी कि अत्यधिक या तो आईजीजी आईजीएम या isotypes के लिए विशिष्ट हैं। माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता आईजीजी या आईजीएम के एफसी भाग को समझते हैं और एक दूसरे के साथ नहीं पार प्रतिक्रिया करते हैं। अलग आईजीजी और आईजीएम संकेतों प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में ये एंटीबॉडी के विभिन्न कार्यों को देखते हुए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, आईजीएम बी 1 कोशिकाओं द्वारा उच्च स्तर पर उत्पादन किया है और आम तौर पर एक प्रारंभिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के एक मार्कर है। दूसरी ओर, आईजीजी बाद में एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है, जो 14 वर्ग परिवर्तन का एक परिणाम के रूप में विकसित की एक मार्कर है। आईजीजी और आईजीएम संकेतों अलग से पता लगाकर, यह भी रोगी के नमूने में आईजीएम रुमेटी कारकों की पहचान करना संभव है (यानी, आईजीएम इम्युनोग्लोबुलिन कि आईजीजी करने के लिए बाध्य है कि सरणी पर देखा गया है)। एंटीबॉडी के विभिन्न भागों को खोलना (जैसे, एफसी फैब बनाम), विभिन्न आईजीजी एंटीबॉडी epitopes को रुमेटी कारक के बंधन मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। दो से अधिक लेज़रों के साथ स्कैनर की उपलब्धता के साथ, अतिरिक्त दूसराआरे एंटीबॉडी आईजी ऐ, आईजीडी या IgE एंटीबॉडी के बंधन को पहचानने के लिए वर्तमान माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ी को जोड़ा जा सकता है। माध्यमिक एंटीबॉडी भी पहचाना जा सकता है कि अलग आईजीजी उपवर्गों (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) एक एकल सरणी पर एंटीजन के लिए बाध्य की पहचान के लिए अनुमति होगी।

अंत में, प्रतिजन माइक्रोएरे तकनीक के लिए एक मजबूत सीरम स्वप्रतिपिंडों के उच्च throughput लक्षण वर्णन के लिए अनुमति तकनीक है। इस तकनीक को उच्च अनुकूलन और संवेदनशील है। फ्लोरोसेंट आधारित पहचान प्रणाली दोनों मानव और माउस के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया गया है और आईजीजी और आईजीएम एंटीबॉडी के एक साथ पता लगाने के लिए अनुमति देता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ribosomal P0 Diarect 14100 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG Jackson Immuno 009-000-003 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM Jackson Immuno 009-000-012 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG Sigma-Aldrich I5381 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM Biolegend 401601 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA Sigma-Aldrich D1626 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA Sigma-Aldrich D8899 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer Virtek VersArray Chipwriter Pro many types of arrayers are suitable
solid printing pins Arrayit Corporation SSP015
software for robotic microarrayer Virtek Chipwriter Pro 
FAST slides (2 Pad) GVS Northa America 10485317
FAST frame GVS Northa America 10486001
FAST incubation chambers (2 Pad) GVS Northa America 10486242
384 well plates Whatman 7701-5101
plate sealers VWR 60941-062
foil plate covers VWR 60941-124
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Fetal calf serum Invitrogen 12483020
Cy3 goat anti-human IgG Jackson Immuno 109-165-096 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM Jackson Immuno 109-175-129 use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG Jackson Immuno 115-165-071 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM Jackson Immuno 115-175-075 use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner Molecular Devices Axon 4200A
Microarray software Molecular Devices Genepix 6.1
Clustering software eisenlab.org Cluster 3.0
Heatmap software eisenlab.org Treeview 1.60
Microarray statistical software Stanford University SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)

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References

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आईजीजी और आईजीएम Autoantibodies का एक साथ जांच के लिए दो-रंग एंटीजन प्रोटीन की पीढ़ी
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Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).More

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).

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