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Immunology and Infection

의 IgG 및 IgM의자가 항체의 동시 검출을위한 2 색 항원 마이크로 어레이의 생성

doi: 10.3791/54543 Published: September 15, 2016

Protocol

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1. 희석 항원 및 생성 항원 마이크로 어레이

  1. 0.2 mg / ml의 최종 농도로 PBS에 희석 항원. 9 핀과 미세 배열 구성과 중복에서 162까지 고유의 항원을 인쇄합니다. 항원 라이브러리로 양성 대조군에서의 IgG 및 IgM의 항원을 포함합니다. 단지 음성 대조군으로 PBS를 포함합니다.
  2. 384 잘 소스 판에 각 항원의 20 μl를 추가합니다. 프린트 헤드의 설치 미러 그룹의 소스 플레이트에 항원을 추가 (9 핀 인쇄에 사용하는 경우 등, (9)의 그룹이 항원을 준비).
  3. 배열을 인쇄 할 준비가 될 때까지 -80 ° C에서 박 및 동결와 커버 소스 판.
  4. 3 × 1 분 동안 탈 이온수와 초음파 처리 조에서이를 배양하여 고체 미세 배열 핀을 청소합니다. 랙에 배치 핀은 건조 후 마이크로 어레이 프린트 헤드의 핀을 배치합니다. 9 핀, 3 × 3 구성을 사용합니다.
  5. 프린트 헤드 번호 핀을 설정하여 실행 인쇄 프로그램 미세 배열,슬라이드의 수는 각 슬라이드에, 패드의 번호를 인쇄하고, 각 항원에 대한 복제 지점 수 있습니다. 일반적으로 9 핀, 70 슬라이드, 2 패드 / 슬라이드, 각 항원에 대한 2 복제 지점을 사용합니다. 프로그램 미세 배열은 항원의 다른 그룹 사이에 물에 핀을 초음파 처리합니다.
  6. 해동 소스 플레이트와 100 × g에서 1 분 후 원심 분리 판. 미세 배열의 지정된 자리에 소스 판을 놓습니다. 인쇄 할 항원의 첫 번째 그룹을 덮고 박의 부분을 제거합니다.
  7. Arrayer에 표면 및 실행 인쇄 프로그램에 인쇄되지 않은 슬라이드를 정렬합니다. 어레이 시스템의 가습기의 빌드 60 % - 습도 RT에서 인쇄 슬라이드 (55)에 Arrayer에에 설정합니다.
  8. 항원의 각 그룹은 모든 슬라이드 상에 인쇄 된 후, 미세 배열을 일시. 다만 호일로 인쇄 된 표지 항원 (증발을 방지하기 위해) 및 항원의 다음 그룹에 인쇄 될 발견. 인쇄 프로그램을 계속합니다.
  9. 모든 항원에 인쇄 한 후, 커버 소스 PL-80 ° C에서 박 및 동결의 새로운 조각을 먹었다. 슬라이드 상자와 진공 밀봉에 인쇄 된 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드 다음날를 사용하거나 최대 한 달 후에 할 수있다.

2. 희석 혈청과 항원 마이크로 어레이를 프로빙

  1. 배양 챔버를 사용하여 프레임으로 슬라이드를 놓습니다. 각 배열 표면에 차단 버퍼 (2.5 %의 [권 / 권] 태아 혈청 (FCS), PBS에 트윈 20 0.1 % [의 / 권 권])의 700 μl를 추가합니다.
  2. 젖은 조직의 조각 밀폐 용기에 프레임과 장소를 통해 접착 필름을 배치합니다. 로커에 4 ° C에서 O / N을 품어.
  3. 혈청 샘플 1을 희석 : (100) 버퍼를 차단에서. 대기음 배열에서 솔루션을 차단 및 각 배열 표면에 희석 한 시료 500 μl를 추가합니다.
  4. 접착 필름으로 덮고 락으로 4 ° C에서 1 시간 동안 배양한다.
  5. 버퍼를 차단에서 이차 항체를 희석. 인간 연구의 경우, 0.33 μg의 / ㎖ 및 Cy5에로 Cy3가 표지 된 염소 항 - 인간 IgG 항체가 희석 된 염소 항 - 구호 물자 표지0.25 μg의 / ㎖에 대한 IgM 항체 n은. 마우스 연구를 들면, Cy3에가 ㎖의 0.38 μg의 /에 염소에게 항 - 마우스 IgG 항체를 표지와 Cy5에가 / ㎖ 0.7 μg의에 염소 항 - 마우스 IgM의 항체를 표지 희석.
  6. 어레이에서 대기음 샘플 및 배열 표면을 세척 완충액 (PBS 중 0.1 % 트윈 20)로 4 회 헹군다. 슬라이드에 버퍼 빠르게 떨어져 가볍게 붓는다.
  7. 락과 RT에서 각 배열 표면을 씻어 10 분 부화 버퍼를 차단의 700 μl를 추가합니다. 반복 세척 단계를 두 번 더.
  8. 각 슬라이드 표면에 희석 차 항체의 500 μl를 추가하고 접착 필름 커버. 락과 4 ° C에서 45 분을 품어.
  9. 대기음 차 항체 슬라이드에서 혼합하고 위의 4 번 헹군다. 워시는 상기 차단 / 희석액 700 ㎕를 3 번​​ 슬라이드.
  10. PBS에 침지 금속 슬라이드 랙 프레임과 장소에서 슬라이드를 제거합니다. 궤도 흔들림와 실온에서 20 분을 품어. PBS의 새로운 용기에 놓고 다른 20m를 품다진탕한다.
  11. 탈 이온수 15 초 용기에 넣어 슬라이드 랙. 물이 새 컨테이너에 선반을 놓고 다른 15 초를 품어.
  12. 건조 슬라이드, RT에서 5 분 220 XG에 원심 분리기와 스핀에서 ELISA 플레이트 어댑터에 장소 슬라이드 랙.
  13. 스캔 할 준비가 될 때까지 빛을 꽉 상자에 슬라이드를 놓습니다.

3. 스캔 항원 마이크로 어레이 및 데이터 내보내기

  1. 를 Cy3 및 Cy5의 형광 신호를 검출 할 수있는 마이크로 어레이 스캐너를 사용하여 스캔 슬라이드. 스캐너의 광전자 증 배관 (PMT) 레벨을 조정하기 위해, 단지 이차 항체로 프로빙 하였다 슬라이드 사전 스캔.
    참고 :이 슬라이드 전체 양 (IgG에와 IgM의)를 포함하여 그것에 인쇄 항원 라이브러리뿐만 아니라 음 (PBS) 컨트롤이 있어야합니다. 프리 스캔 최적 PMT 설정을 찾기 위해 신속하게 사용자를 허용하는 낮은 해상도로 스캔한다.
  2. PMT를 값을 설정되도록합니다 (Cy3에 채널에서) 인간 IgG 기능과 잡음합니다 (Cy5에 채널)을 IgM의 기능은 비슷한 평균 형광 강도를 뺀 배경 (MFI-B) (일반적으로 40000)가 있습니다. PMT를 레벨은 "하드웨어"버튼을 누름으로써 설정된다. 일단 설정되면, 일정이 PMT 설정을 유지.
  3. 은 "스캔"버튼을 누름으로써 두 개의 채널에 대한 실험 슬라이드 스캔. 각 스캔 한 후 슬라이드 이미지 (두 채널 모두)를 저장합니다.
  4. 슬라이드를로드하는 "파일"버튼을 사용하여 마이크로 어레이 소프트웨어로 분석된다.
  5. "파일"버튼을 이용하여 유전자 배열 목록 (GAL) 파일을로드합니다. 는 GAL 파일 어레이 피처들의 신원을 가진 어레이의 레이아웃을 가진다.
  6. 배열 기능을 최대한 가깝게 템플릿을 일치하도록 스캔 한 이미지를 통해 배열 템플릿을 놓습니다.
  7. 은 "정렬"버튼을 눌러 템플릿으로 모든 블록의 기능을 맞 춥니 다. 프로그램은 일반적으로 원형의 기능의 개요를 확인할 수 있지만, 일부 수동 조정이 필요할 수있다. 이러한 조정 기능 모드를 입력 할 수있다. 소프트웨어는 각 항원에 대해 MFI-B를 계산한다.
  8. 텍스트 파일로 결과를 내보내려면 "파일"버튼을 사용합니다.

마이크로 어레이의 의미 분석 4. 분석 배열 데이터 (SAM)

  1. 엑셀로 개별 텍스트 파일을로드하고를 Cy3와 Cy5에 채널 MFI-B가 열을 식별합니다.
  2. 중복 기능의 평균을 계산합니다.
  3. 어떤 부정적인 MFI-B의 경우, (10)와 음수 로그베이스 (2)를 계산하여 다음 100 원 MFI-B를 나누고하여 데이터를 변환 대체합니다.
  4. 이전에 7 설명한 바와 같이 마이크로 어레이 (SAM)의 의미 분석과 로그 변환 된 데이터를 분석 할 수 있습니다.
  5. 두 그룹 (예를 들어, 건강한 대조군 대 명), 하나의 그룹 라벨 「1」및 그룹을 이용하여 연구를위한 "2" 의있는 항원의 반응성을 식별하기 위해 SAM의 두 클래스 짝이 분석을 사용하여두 군간 ignificantly 다른 (Q 값 <0.05).
  6. 프리젠 테이션 8 이미지를 만들기 위해 클러스터링 및 열 맵 생성 소프트웨어를 사용합니다.

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Representative Results

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도 1에 나타낸 바와 같이 항원 로봇 미세 배열로 슬라이드 상에 384 웰 플레이트에 배치되어 인쇄된다. 2는 배양 챔버와 처리 후의 스캔 슬라이드 프레임에 배치 된 슬라이드를 나타낸다. (3) 양성 및 음성 대조군 슬라이드를 나타낸다. 네가티브 슬라이드은 이차 항체로 프로빙하고, 양성 대조군 슬라이드 전신성 홍 반성 루푸스 환자의 혈청으로 프로브된다. 두 별도로 표지 이차 항체를 이용하여 IgG를 및 IgM의 반응성이 동일한 슬라이드 표면에서 분리 될 수있다. (4)도 단일 가닥 DNA (ssDNA를) 및 IgG를 다양한 위에 리보솜 P (Ribo를 P)에 대한 항체에 대한 IgM의 항체의 형광 강도를 나타낸다 혈청 희석의 범위. P Ribo에 대해 알려진 반응성 전신성 홍 반성 루푸스 환자에서 실험 양성 대조군 혈청을 사용 하였다. 린이어 반응은 모든 혈청 희석 통해 IgM의 채널 관찰된다. 선형 응답은 약 30,000의 MFI-B까지의 IgG 채널에서 관찰된다. 이 시점 후에, 반응은 포화 시작 Ribo를 P 항체 증가는 MFI-B에 대응하는 증가로 이어지지 않는다. 어레이 인간 혈청 류마티스 인자를 검출하는 방법을도 5도. 이 연구에서, 기록 류마티스 인자 cryoglobulinemic 혈관염 환자에서 혈청 (통상 <11 IU / ㎖) 167 IU / ㎖ (IgG의 대 IgM의 항체)를 사용 하였다. 혼자 차 항체를 사용하여, IgM의 반응성은 배열에 발견 된 IgG에 대해 보이지 않는다. 슬라이드가 류마티스 인자를 가진 환자에서 혈청 프로빙시 반대로 중요한 IgM의 반응성 (약 5000 MFI-B)의 IgG에 대하여 검출된다. 6 마우스 혈청과 함께 사용할 수있는 2 색 항원 마이크로 어레이의 발전을 나타낸다. 이 그림에서, 마우스 대한 IgM 일어레이 상에 발견된다에서만 배열 만 항 마우스 IgG 이차 항체에 의해 검출되는 상 발견되는 항 - 마우스 IgM의 이차 항체와 마우스 IgG에 의해 검출된다. 스캔의 템플릿 격자 7은 정렬 도표 마이크로 어레이 분석 소프트웨어를 이용하여 어레이 이미지. 배열 기능은 그리드 정렬 되었으면 배열 기능이 각 기능에 대한 중간 형광 세기를 뺀 배경을 얻기 위해 분석 될 수있다.

그림 1
항원 마이크로 어레이. 항원의 그림 1 세대 먼저 소스 접시에 배치된다. 도면에 도시 된 소스 접시, 항원 헤드 핀의 3 × 3 배열과 일치하는,도 9의 그룹에 배치된다. 소스 플레이트는 로봇 미세 배열에 배치되고, 항원은 슬라이드 상에 발견된다. 이 예에서이 패드 FAST 슬라이드 아칸소동일한 배열을 허용 사용되는 전자는 2 니트로 셀룰로오스 표면에 발견 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
항원 마이크로 어레이. 슬라이드 그림 2. 처리 배양 챔버를 사용하여 FAST 프레임에 배치 된 후 이차 항체를 샘플을 추가하고 처리합니다. 항원 반응성 형광 신호를 검출 할 수있는 스캐너로 드러난다. 2 패드 FAST 슬라이드 스캔 한 이미지가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 <BR /> 그림 3. 인간의 세라와 함께 사용하기위한 2 색 항원 마이크로 어레이 최적화. (A)의 IgG, IgM의 및 IgG의 된 Fc은 이차 항체와 프로브 어레이에서 감지됩니다. 이 세 가지 항원 보조 항체의 특이성을 보여주는 긍정적 인 컨트롤입니다. 적색 형광 (IgM의 채널)은 항 - 인간 IgM의 차 항체의 결합을 나타낸다. 녹색 형광 (IgG의 채널) 항 인간 IgG 이차 항체의 결합을 나타낸다. 의 IgG의 Fc 항원은 과포화로 인해 흰색입니다. (B) 더 많은 반응성은 Ribo를 P 항원에 알려진 반응성이 전신성 홍 반성 루푸스 환자에서 양성 대조군 혈청 프로브 어레이에서 감지됩니다. 상자는 DNA 및 Ribo를 P 항원이 배열 된 위치를 나타낸다. (C) 양성 대조군 혈청에서 형광 농도의 정량 DNA 항원에 대한 항체 반응성의 대부분은 IG의 것으로 밝혀M 동형. (D) 양성 대조군 혈청에서 형광 농도의 정량 Ribo를 P 항원에 대한 항체 반응성의 대부분은 IgG의 이소 타입의 것을 알 수있다. 배열 기능 중복에 발견하고 약 500 μm의 직경입니다 있습니다. 그래프 배열 기능에 대한 평균 ± SD를 표시합니다. dsDNA, 이중 가닥 DNA; ssDNA를, 단일 가닥 DNA; MFI-B, 중간 형광 세기를 뺀 배경; 리보 P는 리보솜 P.는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
혈청 희석 팩터 대도 4 형광 강도. (A) 혈청 희석액의 넓은 범위 MFI-B이 들어 Ribo에 대해 P. ssDNA를 및 IgM의 IgG에 대해 도시되어있다실험은, Ribo를 P와 ssDNA를 상대로 알려진 IgG의 반응성과 양성 대조군 혈청을 사용 하였다. MFI-B는. 약 65,000의 값으로 포화 MFI-B 데이터 (B) LOG2 변환은 항원 반응성 넓은 범위의 양의 IgG 및 IgM의 채널에서의 선형 반응을 계시한다. 30,000의 MFI-B 동안, IgG의 신호가 포화되기 시작과 선형성을 푼다. 배열 기능 6 복제에 발견되었다. 그래프 배열 기능에 대한 평균 ± SD를 표시합니다. ssDNA를, 단일 가닥 DNA; MFI-B, 중간 형광 세기를 뺀 배경; 리보 P는 리보솜 P.는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
2 색 항원 마이크로 어레이와 류마티스 인자의 그림 5. 감지. (B) 배열입니다. IgG의 기능으로 인해 IgG를 고정화하는 환자의 혈청에서 IgM의 결합에 녹색 - 노란색이다. IgM의 기능이 주황색으로 표시되는 흥미롭게도,이 환자는 IgM의 대한의 IgG 항체를 보유하고 있습니다. 환자는 선천성 심장 질환의 역사를 가지고 있으며 IgG의 및 IgM의는 이차 항체와 프로브 어레이의 특징은 이차 항체가없는 것을 알 수의 심장 단백질 트로포 닌 C. (C) 정량 높은 반응성을 가지고 주목 어떤 교차 반응성. (D) 부량환자 혈청 프로브 어레이의의 IgG 및 IgM의 기능 류마티스 인자의 존재를 확인한다. 기능 중복에 발견하고 약 500 μm의 직경입니다 있습니다. 그래프 배열 기능에 대한 평균 ± SD를 표시합니다. MFI-B, 평균 형광 강도를 뺀 배경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
2 색의 배열 그림 6. 개발 마우스 혈청 항체 프로필한다. (A) 배열 이차 항체 만 프로브. 붉은 형광은 항 - 마우스 IgM의 이차 항체의 결합을 나타냅니다. 녹색 형광 항 마우스 IgG 이차 항체의 결합을 나타낸다. 어레이 상에 발견 된 마우스의 IgG는 항 각서 의해 검출SE IgG를 이차 항체 만이 항 - 마우스 IgM의 차 항체에 의해 검출된다 발견 된 마우스 IgM의. 이차 항체에 의해 검출 된 배열에 다른 기능은 마우스 IgG를 마우스 IgM의에 대한 포획 항체이다. 히스티딘 태그에 대한 마우스 IgG 단일 클론 항체로 프로브 (B) 배열입니다. 이 배열에서, P Ribo를 항원 (그 태깅 된 단백질을 재조합)는 단지 항 마우스 IgG 이차 항체에 의해 검출되었음을 나타내는 녹색이다. 이는 단일 클론 항체는 IgG의 이소 타입이다 주어진 것으로 예상된다. Ribo를 P 항원은 배열이 혼자 차 항체 (오렌지 박스)와 프로브 때. 검출의 IgG, IgM의의 (C) 정량 및 Ribo를 P는 히스티딘 태그에 대한 마우스 IgG의 모노클로 날 항체로 프로브 어레이에서 기능하지 않습니다. 배열 기능은 여섯 복제에 발견하고 약 500 μm의 직경입니다 있습니다. 그래프 배열 기능에 대한 평균 ± SD를 표시합니다. MFI-B, 메디안 불소강도 마이너스 배경을 escence; 리보 P는 리보솜 P.는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
배열 이미지 위에 그림 7. 정렬 템플릿 그리드가.이 스크린 샷에서, 여자 파일에서 생성 된 템플릿 그리드는, 이전에 스캔 한 항원 마이크로 어레이에 정렬했다. 이 배열은, 전신성 홍 반성 루푸스, 많은자가 항체 반응성을 가진 혈액 응고 질환이있는 환자로부터의 혈청으로 프로빙 하였다. 녹색 형광의 IgG 항체의 결합을 나타내며, 빨간색 형광 대한 IgM 항체의 결합을 나타냅니다. 고체 핀에 의해 인쇄 기능은 거의 원형 쉽게 마이크로 어레이 소프트웨어 (제품, GenePix)에 의해 설명되어 있습니다. 격자의 정렬이 완료되면 softwar전자 배열의 각 기능에 대한 평균 형광 강도 마이너스 (모두를 Cy3와 Cy5에 채널) 배경을 계산할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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여기에 설명 된 프로토콜 항원 마이크로 어레이 기술을 이용하여자가 항체의 정량을 허용한다. 항원 마이크로 어레이는자가 항체 선별에 기존의 ELISA에 비해 여러 가지 장점을 제공한다. 우선, 핵산, 단백질, 펩티드, 및 세포 용 해물을 포함하는 다양한 항원에 따라서 다중화자가 항체 스크리닝을 허용 니트로 셀룰로스 - 코팅 된 슬라이드 상에 배치 될 수있다. 항원 나노 리터 각 슬라이드에 발견되기 때문에, 또, 항원의 마이크로 그램의 어레이를 생성 할 필요가있다. 100 샘플 희석 혈청의 5 μL가 1 배열 표면을 조사하는 데 필요한대로 배열은 매우 작은 환자 샘플을 필요로한다. 마지막으로, 배열은 니트로 셀룰로오스에자가 항체 9 검사에서 기존의 ELISA보다 더 민감한 것으로 나타났다 발견했다.

자가 항체에 대한 항원 스크리닝 마이크로 어레이를 사용하는 것 외에도, 상기 배열은 사용 될 수D는 단일 클론 항체의 특이성을 정의하고, 이전에 설명 된 바와 같이 이식 9-12 아닌 HLA 항체의 수준을 측정하는 비 자기 단백질 (예, 바이러스 단백질)에 대한 반응성을 검출한다. 항원 마이크로 어레이는 단일 단백질의 중첩 펩타이드 슬라이드 상에 배열 된 에피토프 맵핑 상세한 실험을 수행 할 수있다. 최근의 연구는 전신성 홍 반성 루푸스 (13)의자가 항체의 표적 인 U1-70K 단백질의 에피토프를 정의하려면이 방법을 사용했다.

여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여,의 IgG 및 IgM의 반응성을 검출 혈청 희석액의 넓은 범위에 걸쳐 선형 적이다. 이 연구는 리보솜의 P 항원과 ssDNA를에 알려진 반응성이 전신성 홍 반성 루푸스 환자에서 양성 대조군 혈청을 사용하여 수행 하였다. 17,000 50 IgG의 반응성의 MFI-B에에 해당하는 32,000 : 125 1 : ssDNA를에 IgM의 반응성 1의 혈청 희석에서 선형4000 (및 MFI-B 32000보다 크다)의 IgG 반응성 병합 검출 곡선 : 1 이하 희석액에서 200 32,000 MFI-B에 해당하는 512,000 : 1-4000 : 리보 P는 하나의 혈청 희석액에 선형 더 이상 선형 없습니다. 심장 이식 수혜자와 연구에서 혈청 일상적 1로 희석된다 항원에 대한 MFI-B는 거의이 희석 10,000를 초과하지 100로. 고역가자가 항체와 면역 질환을 가진 환자의 연구를 들어, 환자의 시료자가 항체 반응성의 대부분이 분석의 선형 범위 내에 있도록 상기 희석 될 필요가있다.

MFI-B는 환자 그룹간에자가 항체 반응성을 비교하는 것이 유용 할 수 있지만, 또한,자가 항체 수준보다 양적 측정 값으로,이 값을 변환하기 위해 유용 할 수있다. 이것은 표준 곡선을 생성하기 위해 상기 슬라이드 상에 정제의 IgG 및 IgM의 여러 공지 희석 스폿 팅에 의해 달성 될 수있다. 이 곡선을 사용하여, MFI-B는 트랜스 일 수있다각 항원에 대한자가 항체 수준으로 형성.

여기에 제시된 프로토콜,이 패드 니트로 셀룰로스 - 코팅 된 슬라이드를 사용 하였다. 이 슬라이드에서 두 개의 분리 된 혈청 샘플을 탐색 할 수있는 두 개의 동일한 배열은 각 슬라이드에 인쇄됩니다. 이 (예 : 사전 및 사후 처리 등) 같은 환자에서이 샘플 interslide 변동성을 최소화 동일한 슬라이드에 비교 될 수 있습니다. 64 개의 개별 환자 샘플 서른 두 슬라이드 일상적 하루에 동시에 처리된다. 가장 최근의 배열 (162) 항원을 허용, 9 핀 인쇄는 (각 핀 중복 인쇄 (18) 항원과 동일 36 기능 부분 배열을 인쇄) 중복 인쇄합니다.

이 프로토콜에서 생성 된 항원 마이크로 어레이 고체 미세 배열 핀들로 인쇄 하였다. 고체 핀으로 인쇄하면 미세 배열은 각 t 후 소스 판에 딥을 다시해야하기 때문에 퀼 스타일의 핀 인쇄보다 소요 시간이 더있다핀이 상기 슬라이드면 닿 IME. 그들은 (직경이 약 500 μm의) 높은 재현성 거의 원형 배열 기능을 생성 고체 핀을 사용 하였다. 이러한 기능은 쉽게 감지 스캐너 소프트웨어에 의해 설명, 최소한의 수동 조정은 배열 기능을 정량화하는 데 필요한 수 있습니다. 고정 핀은 그들의 높은 점도 퀼 핀 인쇄 어려울 수있는 인쇄 될 세포 용 해물을 허용. 때문에 고체 핀과 관련된 긴 인쇄 번 - 소스 판에 인쇄되지 않는 항원은 증발을 방지하기 위해 호일로 덮여있다 (때로는 10 시간, 11 (70)의 슬라이드를 인쇄하기 위해).

여기에 설명 된 프로토콜이 동일한 슬라이드 표면의 IgG 및 IgM의 반응성을 분리하는 방법을 제공한다. 배열은 서로 다른 형광으로 표지 된 이차 항체의 쌍을 사용하여 두 인간 및 마우스 항체 화면에 최적화되어있다. 이 2 색 접근법은 긴급 세코 식별되고높은 하나의 IgG 또는 IgM의 아이소 타입에 대한 특정 ndary 항체. 사용되는 이차 항체의 IgG 또는 IgM의의 Fc 부분을 인식하고, 서로 가교 반응하지 않는다. IgG에 및 IgM의 신호들을 분리하는 것은 면역 반응에서 이들 항체의 다른 기능을 부여 중요하다. 예를 들어, IgM의 B1은 세포에 의해 높은 수준으로 생산 전형적 초기 면역 반응의 마커이다. 한편, IgG의 클래스 14의 전환의 결과로서 개발 이후 면역 반응의 표지이다. 별도의 IgG 및 IgM의 신호를 검출함으로써, 환자 샘플 IgM의 류마티스 인자를 확인하는 것도 가능하다 (즉, 어레이 상에 발견 된 IgG에 결합 IgM의 면역 글로불린). 항체의 다른 부분을 스폿 팅함으로써 (예를 들어, 팹 비교 된 Fc)는 다른 IgG의 항체 에피토프에 류마티스 성 인자의 결합을 정량 할 수있다. 두 개 이상의 레이저와 스캐너의 가용성과, 추가로 제진 항체의 IgA, IgD의 또는의 IgE 항체의 결합을 식별하는 현재의 이차 항체 쌍에 추가 될 수있다. 이차 항체는 단일 배열에 항원에 결합 된 별도의 IgG 서브 클래스 (의 IgG1, IgG2, Ig​​G3, IgG4를)의 식별을 허용하는 것을 확인 할 수있다.

결론적으로, 항원 마이크로 어레이 기술은 혈청자가 항체의 높은 처리량 특성을 가능하게하는 강력한 기술이다. 이 기술은 고도로 사용자 정의 및 구분합니다. 형광 계 검출 시스템은 인간 및 마우스 모두 연구에 최적화의 IgG 및 IgM의 항체의 동시적인 검출을 가능하게하고있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ribosomal P0 Diarect 14100 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG Jackson Immuno 009-000-003 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM Jackson Immuno 009-000-012 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG Sigma-Aldrich I5381 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM Biolegend 401601 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA Sigma-Aldrich D1626 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA Sigma-Aldrich D8899 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer Virtek VersArray Chipwriter Pro many types of arrayers are suitable
solid printing pins Arrayit Corporation SSP015
software for robotic microarrayer Virtek Chipwriter Pro 
FAST slides (2 Pad) GVS Northa America 10485317
FAST frame GVS Northa America 10486001
FAST incubation chambers (2 Pad) GVS Northa America 10486242
384 well plates Whatman 7701-5101
plate sealers VWR 60941-062
foil plate covers VWR 60941-124
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Fetal calf serum Invitrogen 12483020
Cy3 goat anti-human IgG Jackson Immuno 109-165-096 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM Jackson Immuno 109-175-129 use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG Jackson Immuno 115-165-071 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM Jackson Immuno 115-175-075 use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner Molecular Devices Axon 4200A
Microarray software Molecular Devices Genepix 6.1
Clustering software eisenlab.org Cluster 3.0
Heatmap software eisenlab.org Treeview 1.60
Microarray statistical software Stanford University SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
  2. Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention. Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).
  3. Robinson, W. H., et al. Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses. Nature. medicine. 8, 295-301 (2002).
  4. Quintana, F. J., et al. Antigen microarrays identify unique serum autoantibody signatures in clinical and pathologic subtypes of multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18889-18894 (2008).
  5. Hueber, W., et al. Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 52, 2645-2655 (2005).
  6. Price, J. V., et al. Protein microarray analysis reveals BAFF-binding autoantibodies in systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 123, 5135-5145 (2013).
  7. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5116-5121 (2001).
  8. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14863-14868 (1998).
  9. Chruscinski, A., et al. Generation of Antigen Microarrays to Screen for Autoantibodies in Heart Failure and Heart Transplantation. PloS one. 11, e0151224 (2016).
  10. Price, J. V., et al. Characterization of influenza vaccine immunogenicity using influenza antigen microarrays. PloS one. 8, e64555 (2013).
  11. Singh, H., et al. Reactivity profiles of broadly neutralizing anti-HIV-1 antibodies are distinct from those of pathogenic autoantibodies. Aids. 25, 1247-1257 (2011).
  12. Porcheray, F., et al. Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses. Transplantation. 89, 1239-1246 (2010).
  13. Haddon, D. J., et al. Mapping epitopes of U1-70K autoantibodies at single-amino acid resolution. Autoimmunity. 48, 513-523 (2015).
  14. Schroeder, H. W. Jr, Cavacini, L. Structure and function of immunoglobulins. J Allergy Clin Immunol. 125, S41-S52 (2010).
의 IgG 및 IgM의자가 항체의 동시 검출을위한 2 색 항원 마이크로 어레이의 생성
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Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).More

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).

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