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Immunology and Infection

Geração de duas cores Antigen Microarrays para a detecção simultânea de auto-anticorpos IgG e IgM

doi: 10.3791/54543 Published: September 15, 2016

Protocol

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1. diluindo Antígenos e gerando Antigen Microarrays

  1. Diluir antigénios em PBS para uma concentração final de 0,2 mg / ml. Imprimir até 162 antígenos únicos em duplicado com uma configuração microarrayer com 9 pinos. Incluem antigénios de IgG e IgM na biblioteca antigénio como controlos positivos. Incluem apenas PBS como controlo negativo.
  2. Adicionar 20 ul de cada antigénio para a placa de fonte de 384 poços. Adicionar antígenos para a placa de fonte em grupos que espelham a configuração da cabeça de impressão (por exemplo, organizar antígenos em grupos de 9, quando 9 pinos são utilizados para impressão).
  3. placa fonte Cubra com papel alumínio e congelar a -80 ° C até que esteja pronto para imprimir arrays.
  4. Limpar os pinos microarrayer sólidos, incubando-as num banho de ultra-sons com água desionizada durante 3 x 1 min. Coloque pinos no rack para secar e em seguida, organizar pinos no cabeçote microarray. Para 9 pinos, use uma configuração de 3 x 3.
  5. microarrayer Programa de impressão gerido pela definição do número de pinos na cabeça de impressão,número de lâminas de imprimir, o número de pastilhas em cada lâmina, e o número de pontos em replicado para cada antigénio. Normalmente, utilize 9 pinos, 70 slides, 2 almofadas / slides, e 2 pontos em replicado para cada antigénio. microarrayer programa para sonicate pinos na água entre diferentes grupos de antígenos.
  6. placa fonte descongelar e placa, em seguida, centrifuga-se durante 1 min a 100 x g. Coloque placa de fonte no local designado na microarrayer. Retirar a parte da folha que está cobrindo o primeiro grupo de antigénios a ser impresso.
  7. Organizar os slides não impressos na superfície arrayer e executar o programa de impressão. lâminas de impressão em temperatura ambiente com umidade definida no arrayer a 55 - 60% com a construção em umidificador da máquina matriz.
  8. Depois de cada grupo de antígenos é impresso em todos os slides, pause o microarrayer. Cobrir os antigénios que foram impressas apenas com uma folha (para evitar a evaporação) e descobrir o próximo grupo de antigénios a ser impresso. Continue programa de impressão.
  9. Depois de todos os antígenos foram impressas, fonte de cobertura de plcomeu com novo pedaço de papel alumínio e congelar a -80 ° C. Coloque slides impressos na caixa slide e selo de vácuo. As lâminas podem ser usados ​​no dia seguinte ou até um mês mais tarde.

2. Sondagem Antigen Microarrays com soro diluído

  1. Coloque slides em quadros usando câmaras de incubação. Adicionar 700 ul de tampão de bloqueio (2,5% [vol / vol] de soro de vitelo fetal (FCS), 0,1% [vol / vol] de Tween 20 em PBS) a cada superfície de matriz.
  2. Coloque película adesiva sobre o quadro e coloque em um recipiente fechado, com um pedaço de tecido molhado. Incubar O / N a 4 ° C num agitador rotativo.
  3. Diluir as amostras de soro de 1: 100 em tampão de bloqueio. Aspirar solução a partir de matrizes de bloqueio e adicionar 500 ul de amostra diluída a cada superfície de matriz.
  4. Cubra com filme adesivo e incubar durante 1 hora a 4 ° C com agitação.
  5. Diluir anticorpos secundários em tampão de bloqueio. Para os estudos humanos, dilui-se um anticorpo de IgG de cabra Cy3 anti-humano marcado para 0,33 ug / ml e marcado com Cy5 de um anticorpo de cabra anti-humaN anticorpo IgM para 0,25 ug / ml. Para os estudos de rato, dilui-se uma cabra marcado com Cy3 de anticorpo IgG anti-rato a 0,38 ug / mL e um anticorpo marcado com Cy5 anti-murganho de cabra IgM para 0,7 ug / ml.
  6. Aspirar as amostras a partir de matrizes e lavar superfícies de matriz 4 vezes com tampão de lavagem (0,1% de Tween 20 em PBS). Pour tampão para a slides e agite rapidamente.
  7. Adicionar 700 ul de tampão de bloqueio para lavar cada superfície de matriz e incubar 10 min à TA com agitação. etapa de lavagem Repita mais duas vezes.
  8. Adicionar 500 uL de anticorpo secundário diluído a cada superfície de deslizamento e cobrir com película adesiva. Incubar 45 min a 4 ° C com agitação.
  9. Aspirar mistura de anticorpo secundário a partir de lâminas e lavar 4 vezes como acima. Lave as lâminas 3 vezes com 700 ul de tampão de bloqueio / diluição como acima.
  10. Retirar as lâminas de quadros e coloque em porta-lâminas de metal que está imerso em PBS. Incubar 20 min a RT com agitação orbital. Coloque no novo recipiente de PBS e incubar mais 20 mcom agitação.
  11. Lugar porta-lâminas no recipiente de água deionizada 15 seg. Coloque em rack em um novo recipiente de água e incubar mais 15 seg.
  12. Para lâminas secas, lugar porta-lâminas em um adaptador de placa de ELISA em centrífuga e girar a 220 xg por 5 min a RT.
  13. Colocar as lâminas na caixa à prova de luz até que esteja pronto para a digitalização.

3. A digitalização Antigen Microarrays e exportação de dados

  1. Digitalizar slides usando um scanner de microarray que podem detectar sinais fluorescentes Cy3 e Cy5. A fim de ajustar os níveis de tubo fotomultiplicador (PMT) do scanner, pré-digitalizar um slide que só foi sondado com anticorpos secundários.
    Nota: Esta corrediça deve ter a biblioteca antigénio completo impresso nele incluindo positivo (IgG e IgM), bem como controlos negativos (PBS). A pré-digitalização é uma digitalização de baixa resolução que permite que o usuário rapidamente para encontrar as configurações ideais PMT.
  2. Defina os valores de PMT de modo que os recursos humanos IgG (no canal Cy3) e o zumbidouma características IgM (no canal Cy5) têm um semelhante mediana intensidade de fluorescência menos de fundo (MFI-B) (tipicamente 40.000). Os níveis PMT são definidos pressionando o botão "hardware". Uma vez definido, manter essas configurações PMT constante.
  3. Digitalizar os slides experimentais sobre os dois canais, premindo o botão "Scan". Salve as imagens de slides (ambos os canais) após cada digitalização.
  4. Coloque o slide a ser analisados ​​no software microarray usando o botão "file".
  5. Carregar o arquivo de lista de matriz gene (GAL) utilizando o botão "file". O arquivo GAL tem o layout da matriz com as identidades das características da matriz.
  6. Coloque o modelo de matriz sobre a imagem digitalizada para que as matrizes características corresponder ao modelo, tanto quanto possível.
  7. Alinhar recursos em todos os blocos com o modelo premindo o botão "align". O programa vai encontrar geralmente o contorno das características circulares, mas alguns ajustes manuais podem ser necessárias. Estes ajustes podem ser feitos através da introdução do modo de recurso. O software terá, então, calcular um MFI-B para cada um dos antigénios.
  8. Use o botão "Arquivo" para exportar estes resultados como um arquivo de texto.

4. Analisando dados matriz com análise da significância dos microarrays (SAM)

  1. Carregar arquivos de texto individuais em excel e identificar as colunas que têm MFI-B para os canais Cy3 e Cy5.
  2. Calcule a média dos recursos duplicados.
  3. Para qualquer negativo MFI-B, substitua o número negativo com 10. Transformar dados dividindo-primas MFI-B por 100 e, em seguida, calculando log de base 2.
  4. Analisar log de ​​dados transformados com análise da significância dos microarrays (SAM), como descrito anteriormente 7.
  5. Para um estudo com dois grupos (por exemplo, controles saudáveis ​​versus pacientes), etiqueta um grupo "1" e o grupo "2." Use uma de duas classes, a análise não emparelhado na SAM para identificar os antígenos reacções que são significantly diferente entre os dois grupos (valor q <0,05).
  6. Use um software de clustering e de geração de calor mapa para fazer imagens para a apresentação 8.

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Representative Results

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Os antigénios são dispostos em uma placa de 384 poços e impresso em lâminas por um microarrayer robótico como mostrado na Figura 1. A Figura 2 mostra as lâminas colocados num quadro com câmaras de incubação e uma corrediça digitalizada após o processamento. A Figura 3 mostra as lâminas de controlo positivas e negativas. O slide negativo apenas deve ser sondado com anticorpos secundários, ea lâmina de controlo positivo é sondada com soro de um paciente com lúpus eritematoso sistêmico. O uso de dois anticorpos secundários marcados separadamente, as reactividades de IgG e IgM podem ser separadas com a mesma superfície de deslizamento. A Figura 4 mostra a intensidade de fluorescência de anticorpos IgM contra o ADN de cadeia simples (ADNcs) e IgG de anticorpos contra a P ribossomal (Ribo P) ao longo de uma ampla gama de diluições do soro. Neste soro de controlo positivo experiência de um paciente com lúpus eritematoso sistêmico com reactividade conhecida contra Ribo P foi utilizado. Linrespostas de ouvido são observados no canal IgM sobre todas as diluições do soro. Respostas lineares são observados no canal de IgG-se a um MFI-B de cerca de 30.000. Após este ponto, as respostas começa a saturar e aumentos de anticorpo para Ribo P não conduzem a um aumento correspondente no IFM-B. A Figura 5 mostra como as matrizes podem ser usadas para detectar factor reumatóide no soro humano. Neste estudo, foi utilizado o soro de um paciente com vasculite crioglobulinêmica com um factor reumatóide documentada (anticorpos IgM contra IgG) de 167 UI / ml (normal <11 UI / ml). Usando anticorpos secundários sozinho, não reactividade IgM é visto contra a IgG que é visto na matriz. Em contraste, significativa reactividade IgM (IFM-B de, aproximadamente, 5000) é detectada contra IgG quando a corrediça é sondada com o soro do paciente com o factor reumatóide. A Figura 6 mostra o desenvolvimento de um antigénio de microarray de duas cores para utilização com soro de ratinho. Nesta figura, rato IgM them é manchado para a matriz só é detectada pelo anticorpo secundário anti-IgM de ratinho, e IgG de ratinho que é visto na matriz só é detectada pelo anticorpo secundário IgG anti-rato. A Figura 7 mostra o alinhamento de uma grade de molde numa digitalizada imagem matriz usando software de análise de microarray. Uma vez que as características da matriz foram alinhados com a grelha, as características da matriz podem ser analisados ​​para obter mediana intensidade de fluorescência menos de fundo para cada recurso.

figura 1
Figura 1. Geração de antigénio Microarrays. Os antigénios são primeiro colocados na placa de fonte. Na placa de fonte mostrado na figura, os antigénios estão dispostos em grupos de 9, correspondentes a disposição de 3 x 3, os pinos da cabeça de impressão. A placa de fonte é então colocado no microarrayer robótico e os antigénios são então manchados nas lâminas. Neste exemplo, 2-almofada de ar lâminas RÁPIDASe utilizado, permitindo matrizes idênticas de ser descoberto sobre as superfícies 2 de nitrocelulose. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Processamento do Antigen Microarrays. As lâminas são colocados em quadros rápido usando câmaras de incubação e são processadas através da adição de amostras e, em seguida anticorpos secundários. reactividades de antigénios são reveladas com um digitalizador capaz de detectar sinais fluorescentes. A imagem digitalizada de um slide Fast 2-pad é mostrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 <br /> Figura 3. Duas cores Antigen Microarrays otimizado para uso com Sera Humano. (A) IgG, IgM e IgG Fc são detectados na matriz sondado apenas com anticorpos secundários. Estes três antigénios são controlos positivos para mostrar a especificidade dos anticorpos secundários. a fluorescência vermelha (canal IgM) indica a ligação do anticorpo secundário anti-IgM humana. fluorescência verde (canal de IgG) indica a ligação do anticorpo secundário anti-IgG humano. O antigénio IgG Fc é branco devido à supersaturação. (B) Muitos mais reacções são detectados na matriz sondada com soro de controlo positivo de um paciente com lúpus eritematoso sistêmico com reactividade conhecida ao antígeno Ribo P. As caixas indicam os locais onde o DNA e Ribo P antigénios foram dispostas. (C) Quantificação das intensidades de fluorescência do soro de controlo positivo revela que a maioria das reactividades de anticorpos contra antigénios de ADN são de IgH isotipo. (D) Quantificação das intensidades de fluorescência do soro de controlo positivo revela que a maioria das reactividades de anticorpos contra antigénios de P são Ribo do isotipo IgG. características da matriz são vistos em duplicado e são cerca de 500 m de diâmetro. Os gráficos mostram média ± SD de recursos da matriz. dsDNA, DNA de cadeia dupla; ssDNA, DNA de cadeia simples; MFI-B, mediana intensidade menos fluorescência de fundo; Ribo P, ribosomal P. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. A intensidade de fluorescência vs soro Factor de diluição. (A) IFM-B ao longo de uma ampla gama de diluições de soro é mostrado para IgM e IgG contra ADNcs Ribo contra P. Para estesexperimentos, foi utilizado soro de controlo positivo com reatividade IgG conhecido contra Ribo P e ssDNA. IFM-B é saturado a um valor de aproximadamente 65.000. Transformação (B) Log2 dos dados de IFM-B revela respostas lineares em ambos os canais de IgG e IgM mais de uma vasta gama de reactividades de antigénio. Ao longo de um MFI-B de 30000, o sinal de IgG começa a saturar e perde linearidade. características da matriz foram vistos em 6 repetições. Os gráficos mostram média ± SD de recursos da matriz. ssDNA, DNA de cadeia simples; MFI-B, mediana intensidade menos fluorescência de fundo; Ribo P, ribosomal P. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Detecção de fator reumatóide com duas cores Antigen Microarrays. (B) Matriz sondada com soro de um paciente com vasculite crioglobulinêmica com um factor reumatóide alta. A característica de IgG é verde-amarela devido à ligação de IgM no soro do paciente a IgG imobilizada. Curiosamente, este paciente também tem anticorpos IgG contra IgM como a característica IgM aparece laranja. O paciente também tem uma história de doença cardíaca congênita e é anotado para ter alta reatividade à proteína troponina cardíaca C. (C) Quantificação da IgG e IgM apresenta na matriz sondado apenas com anticorpos secundários mostra que os anticorpos secundários não têm qualquer reactividade cruzada. (D) Quantificaçãoas características de IgG e IgM na matriz sondados com o soro do paciente confirma a presença de factor reumatóide. Os recursos são vistos em duplicado e são cerca de 500 m de diâmetro. Os gráficos mostram média ± SD de recursos da matriz. MFI-B, mediana intensidade de fluorescência menos de fundo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. Desenvolvimento de matrizes de duas cores ao perfil mouse anticorpos séricos. (A) Matriz sondado apenas com anticorpos secundários. a fluorescência vermelha indica a ligação do anticorpo secundário anti-ratinho de IgM. de fluorescência verde indica que a ligação do anticorpo secundário IgG anti-ratinho. A IgG de rato que é visto na matriz é detectada apenas pelo anti-mouse IgG anticorpo secundário, ea IgM de rato que é visto é detectada apenas pelo anticorpo secundário anti-ratinho IgM. As outras características nas matrizes que são detectados pelos anticorpos secundários são anticorpos de captura contra IgG de ratinho ou IgM de ratinho. (B) Matriz sondada com um anticorpo monoclonal de IgG de rato contra as etiquetas de histidina. Nesta matriz, o antigénio Ribo P (proteína recombinante marcada com His) é verde, indicando que apenas é detectada pelo anticorpo secundário IgG anti-ratinho. Isto é esperado uma vez que o anticorpo monoclonal é do isotipo IgG. O antigénio Ribo P não é detectado quando as matrizes são sondadas com anticorpos secundários sozinho (caixa de laranja). (C) Quantificação dos anticorpos IgG, IgM, e Ribo P apresenta na matriz sondada com um anticorpo monoclonal de IgG de rato contra as etiquetas de histidina. características da matriz são vistos em seis repetições e são cerca de 500 m de diâmetro. Os gráficos mostram média ± SD de recursos da matriz. MFI-B, mediana fluorescence intensidade de menos de fundo; Ribo P, ribosomal P. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7. Alinhamento de uma grade Template em uma matriz de imagem. Nesta imagem, uma grade modelo, que foi gerado a partir de um arquivo de gal, foi alinhado com um microarray antígeno previamente digitalizado. A matriz foi sondada com soro de um paciente com lúpus eritematoso sistêmico e um distúrbio de coagulação do sangue que tinha muitas reacções de auto-anticorpos. fluorescência verde representa ligação de anticorpos IgG e a fluorescência vermelha representa a ligação de anticorpos IgM. As características impressas por pinos sólidos são quase circular e são facilmente delineado pelo software microarray (GenePix). Uma vez que o alinhamento de grade é completa, o software pode calcular a intensidade de fluorescência média de menos de fundo (em ambos os canais Cy3 e Cy5) para cada uma das características da matriz. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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O protocolo aqui descrito permite a quantificação de auto-anticorpos, utilizando a técnica de microarray antigénio. microarrays Antigen oferecem várias vantagens sobre ELISA convencional na pesquisa de auto-anticorpos. Primeiro de tudo, uma variedade de antigénios, incluindo ácidos nucleicos, proteínas, peptídeos, e os lisados ​​celulares podem ser dispostas sobre as lâminas revestidas com nitrocelulose, permitindo, assim, para o rastreio multiplexado de auto-anticorpos. Além disso, apenas microgramas de antigénio são necessários para gerar as matrizes desde nanolitros de antígeno são vistos em cada slide. As matrizes também requerem muito pouca amostra do paciente, uma vez que apenas 5 ul de soro é necessária para sondar uma superfície de matriz a uma diluição de 1: 100 da amostra. Finalmente, as matrizes manchados em nitrocelulose foram mostrados para ser mais sensível do que o teste ELISA convencional para auto-anticorpos no rastreio 9.

Além da utilização de microarranjos de antigénios para o rastreio de auto-anticorpos, as matrizes podem ser utilizaçãod para detectar a reactividade contra as proteínas não-auto (por exemplo, as proteínas virais), para definir a especificidade dos anticorpos monoclonais, e para medir os níveis de anticorpos não-HLA em transplantes, como descrito anteriormente 9-12. microarrays de antigénio pode também ser usado para executar as experiências de mapeamento de epitopos onde detalhada péptidos que se sobrepõem de uma única proteína são dispostas sobre uma lâmina. Um estudo recente usou esta abordagem para definir epítopos da proteína U1-70K que são alvos de autoanticorpos no lúpus eritematoso sistêmico 13.

Usando o protocolo aqui descrito, a detecção de IgG e IgM reactividades é linear ao longo de uma ampla gama de diluições de soro. Estes estudos foram realizados utilizando soro de controlo positivo de um paciente com lúpus eritematoso sistêmico com reactividade conhecida ao antígeno P ribossomal e ssDNA. IgM reactividade de ADNcs é linear em diluições de soro de 1: 125-1: 32,000, correspondente à IMF-B de 17.000 a 50. reactividade de IgG deRibo P é linear em diluições de soro de 1: 4000 a 1: 512000, correspondente ao IMF-B de 32.000 a 200. A diluições inferiores a 1: 4.000 (e MFI-B maior do que 32000), a curva de detecção de achata reactividade IgG e já não é linear. No trabalho com receptores de transplante de coração, é rotineiramente soro diluído a 1: 100 como IFM-B para os antigénios raramente excede 10.000 neste diluição. Para os estudos com pacientes com doença auto-imune com anticorpos de elevado título, amostras de doentes pode necessitar de ser diluída adicionalmente para assegurar que a maioria das reacções de auto-anticorpos caem dentro da gama linear do ensaio.

Enquanto IFM-B pode ser útil comparar as reactividades de auto-anticorpos de pacientes entre os grupos, que também pode ser útil para converter este valor para uma medida mais quantitativa dos níveis de auto-anticorpos. Isto pode ser conseguido através da identificação de múltiplas diluições conhecidas de IgG purificada e IgM nas lâminas para gerar uma curva padrão. Usando esta curva, MFI-B podem em seguida ser transformada em um nível de auto-anticorpo para cada antigénio.

No protocolo aqui apresentado, foram utilizadas duas almofadas-lâminas revestidas com nitrocelulose. Por estas lâminas, duas matrizes idênticas, o que pode ser sondado com duas amostras de soro separado, são impressos em cada lâmina. Isto permite que duas amostras do mesmo doente (tal como pré e pós-tratamento) a ser comparado com a mesma lâmina, o que minimiza a variabilidade INTERSLIDE. Trinta e duas lâminas com 64 amostras de pacientes individuais são rotineiramente processadas ao mesmo tempo num só dia. A matriz mais atual é impresso com 9 pinos, permitindo a 162 antígenos a ser impresso em duplicado (cada pino imprime um subarray 36 característica que é igual a 18 antígenos impressos em duplicado).

Os microarrays antígeno gerados neste protocolo foram impressas com pinos microarrayer sólidos. Imprimindo com pinos sólidos é mais demorada do que a impressão com estilo pena pins desde o microarrayer deve voltar a mergulhar na placa de origem após cada time que os pinos de toque na superfície do slide. pinos sólidos foram usados ​​como eles produzem altamente reprodutíveis características da matriz, quase circulares (aproximadamente 500 um de diâmetro). Esses recursos podem ser facilmente detectados e delineada pelo software do scanner e ajustes manuais mínimos são necessários para quantificar as características da matriz. pinos sólidos também para permitir que os lisados ​​de células a ser impresso, que pode ser difícil para imprimir com Quill pinos devido à sua viscosidade mais elevada. Devido aos tempos de impressão longos envolvidos com pinos sólidos (por vezes 10-11 horas para imprimir 70 lâminas), antígenos que não estão sendo impressos na placa de origem são cobertas com papel alumínio para evitar a evaporação.

O protocolo aqui descrito apresenta um método para separar IgG e IgM reactividades sobre a mesma superfície de deslizamento. As matrizes foram otimizados para a tela para ambos os anticorpos humanos e de rato utilizando pares de anticorpos secundários marcados com fluoróforos diferentes. Crítica a esta abordagem de duas cores é identificar secoNdary anticorpos que são altamente específicos para a IgG ou IgM isotipos. Os anticorpos secundários que são usados ​​reconhecem a porção Fe de IgG ou IgM e não reagem de forma cruzada uns com os outros. A separação dos sinais de IgG e IgM é importante tendo em conta as diferentes funções destes anticorpos em respostas imunes. Por exemplo, a IgM é produzida a níveis mais elevados de células B1 e é, tipicamente, um marcador de uma resposta imunitária mais cedo. Por outro lado, a IgG é um marcador de uma resposta imune mais tarde, que se desenvolve como um resultado da mudança de classe 14. Ao detectar os sinais de IgG e IgM separadamente, também é possível identificar factores reumatóides IgM em amostras de pacientes (isto é, imunoglobulinas IgM que se ligam a IgG, o que foi visto na matriz). Ao detectar diferentes porções de anticorpos (por exemplo, Fc contra Fab), a ligação do factor reumatóide para diferentes epítopos de anticorpo IgG pode ser quantificada. Com a disponibilidade de scanners com mais de dois lasers, segundo adicionalanticorpos ary poderia ser adicionado ao par de anticorpos corrente secundária para identificar a ligação dos anticorpos IgA, IgD ou IgE. os anticorpos secundários, também poderia ser identificada que permitiria a identificação de subclasses de IgG distintos (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) ligados a antigénios em uma única matriz.

Em conclusão, a técnica antigénio micromatriz é uma tecnologia robusta permitindo a caracterização de elevada capacidade de auto-anticorpos no soro. Esta técnica é altamente personalizável e sensível. O sistema de detecção fluorescente à base foi optimizado para estudos humanos e de rato e permite a detecção simultânea de anticorpos IgG e IgM.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ribosomal P0 Diarect 14100 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG Jackson Immuno 009-000-003 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM Jackson Immuno 009-000-012 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG Sigma-Aldrich I5381 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM Biolegend 401601 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA Sigma-Aldrich D1626 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA Sigma-Aldrich D8899 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer Virtek VersArray Chipwriter Pro many types of arrayers are suitable
solid printing pins Arrayit Corporation SSP015
software for robotic microarrayer Virtek Chipwriter Pro 
FAST slides (2 Pad) GVS Northa America 10485317
FAST frame GVS Northa America 10486001
FAST incubation chambers (2 Pad) GVS Northa America 10486242
384 well plates Whatman 7701-5101
plate sealers VWR 60941-062
foil plate covers VWR 60941-124
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Fetal calf serum Invitrogen 12483020
Cy3 goat anti-human IgG Jackson Immuno 109-165-096 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM Jackson Immuno 109-175-129 use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG Jackson Immuno 115-165-071 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM Jackson Immuno 115-175-075 use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner Molecular Devices Axon 4200A
Microarray software Molecular Devices Genepix 6.1
Clustering software eisenlab.org Cluster 3.0
Heatmap software eisenlab.org Treeview 1.60
Microarray statistical software Stanford University SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)

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References

  1. Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
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  8. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14863-14868 (1998).
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Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).More

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).

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