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Immunology and Infection

Generación de dos colores con antígeno microarrays para la detección simultánea de autoanticuerpos IgG e IgM

doi: 10.3791/54543 Published: September 15, 2016

Protocol

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1. La dilución de antígenos y la generación de antígeno Microarrays

  1. Diluir antígenos en PBS a una concentración final de 0,2 mg / ml. Imprimir hasta 162 antígenos únicos en duplicado con una configuración microarrayer con 9 pines. Incluyen antígenos de IgG e IgM en la biblioteca de antígeno como controles positivos. Incluir PBS únicamente como un control negativo.
  2. Añadir 20 l de cada antígeno a la placa de fuente de 384 pocillos. Añadir antígenos a la placa de fuente en grupos que reflejan la configuración del cabezal de impresión (por ejemplo, organizar antígenos en grupos de 9 cuando se utilizan para la impresión de 9 pines).
  3. placa de fuente de la cubierta con papel aluminio y congelar a -80 ° C hasta que esté listo para imprimir matrices.
  4. Limpiar pasadores microarrayer sólidos mediante su incubación en un baño de sonicación con agua desionizada durante 3 x 1 min. Coloque pines en rejilla para que se seque y luego ordenar alfileres en la cabeza de impresión de microarrays. Por 9 pines, utilice una configuración de 3 x 3.
  5. microarrayer programa para ejecutar la impresión mediante el establecimiento de botones número de cabezal de impresión,número de diapositivas para imprimir, el número de pastillas en cada diapositiva, y el número de manchas idénticas para cada antígeno. Por lo general, el uso de 9 pines, 70 toboganes, 2 almohadillas / deslizante, y 2 puntos idénticas para cada antígeno. microarrayer programa para sonicar pasadores en el agua entre los diferentes grupos de antígenos.
  6. placa de fuente de deshielo y la placa después centrifugar durante 1 min a 100 x g. Coloque la placa de origen en lugar designado en microarrayer. Retire la sección de papel de aluminio que cubre el primer grupo de antígenos para ser impreso.
  7. Organizar las diapositivas impresas en la superficie arrayer y ejecución del programa de impresión. Imprimir diapositivas a temperatura ambiente con humedad establecido en el arrayer al 55 - 60% con la estructura en humidificador de la máquina matriz.
  8. Después de cada grupo de antígenos se imprime en todas las diapositivas, hacer una pausa en la microarrayer. Cubrir los antígenos que se acaban de imprimir con papel de aluminio (para evitar la evaporación) y descubrir el siguiente grupo de antígenos que se desea imprimir. Continuar programa de impresión.
  9. Después de que se impriman todas antígenos, fuente cubierta de plcomió con el nuevo trozo de papel de aluminio y se congelan a -80 ° C. Coloque las diapositivas impresas en la caja portaobjetos y sellado al vacío. Las diapositivas se puede usar al día siguiente o hasta un mes después.

2. Sondeo de antígeno diluido con micromatrices Sera

  1. Colocar los portaobjetos en tramas utilizando cámaras de incubación. Añadir 700 l de tampón de bloqueo (2,5% [vol / vol] de suero de ternera fetal (FCS), 0,1% [vol / vol] de Tween 20 en PBS) a cada superficie de la matriz.
  2. Coloque película adhesiva sobre el marco y colocar en un recipiente sellado con un trozo de tejido húmedo. Incubar O / N a 4 ° C en un agitador.
  3. Diluir las muestras de suero 1: 100 en tampón de bloqueo. Aspirar la solución de bloqueo de las matrices y añadir 500 l de muestra diluida a cada superficie de la matriz.
  4. Cubrir con film adhesivo y se incuba durante 1 hora a 4 ° C con agitación.
  5. Diluir los anticuerpos secundarios en tampón de bloqueo. Para los estudios en humanos, se diluye un anticuerpo de cabra IgG Cy3 anti-humana marcada a 0,33 g / ml y un Cy5 etiquetados de cabra anti-human anticuerpo IgM a 0,25 g / ml. Para los estudios del ratón, diluir una Cy3 marcado anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón a 0,38 g / ml y un anticuerpo marcado con Cy5 anti-IgM de ratón de cabra a 0,7 g / ml.
  6. muestras de aspirado de matrices y enjuagar las superficies de matriz 4 veces con tampón de lavado (0,1% Tween 20 en PBS). Vierta en tampón de diapositivas y con un tirón rápidamente.
  7. Añadir 700 l de tampón de bloqueo para lavar cada superficie de la matriz e incubar 10 minutos a temperatura ambiente con agitación. Repita el paso de lavado dos veces más.
  8. Añadir 500 l de anticuerpo secundario diluido a cada superficie de deslizamiento y cubrir con film adhesivo. Incubar 45 min a 4 ° C con agitación.
  9. Aspirar mezcla secundaria de anticuerpos a partir de diapositivas y enjuague 4 veces más arriba. Lavar los portaobjetos 3 veces con 700 l de tampón de bloqueo / dilución que el anterior.
  10. Retirar los portaobjetos de marcos y lugar en la parrilla corrediza de metal que se encuentra inmersa en PBS. Incubar 20 min a RT con agitación orbital. Colocar en nuevo contenedor de PBS y se incuba otros 20 mcon agitación.
  11. rejilla deslizante depositarlo en un recipiente de agua desionizada 15 seg. Coloque la parrilla en un nuevo recipiente con agua y se incuba otros 15 seg.
  12. Para secar los portaobjetos, coloque el estante deslizante en un adaptador de placa de ELISA en centrífuga y centrifugado a 220 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  13. Colocar los portaobjetos en la caja hermética a la luz hasta que esté listo para escanear.

3. Escaneo antígeno Microarrays y exportación de datos

  1. diapositivas de escaneo mediante un escáner de microarrays que puede detectar señales fluorescentes Cy3 y Cy5. Con el fin de ajustar los niveles de tubo fotomultiplicador (PMT) del scanner, pre-escanear una diapositiva que sólo se sondeó con anticuerpos secundarios.
    Nota: Esta diapositiva debe tener la biblioteca antígeno completo impreso en ella incluyendo positivo (IgG e IgM), así como controles negativos (PBS). El pre-scan es una exploración de baja resolución, que permite al usuario encontrar rápidamente a los ajustes óptimos PMT.
  2. Establecer los valores de PMT para que las funciones humanas IgG (en el canal de Cy3) y el zumbidouna características IgM (en el canal Cy5) tienen una intensidad media de fluorescencia similares, menos de fondo (IMF-B) (típicamente 40.000). Los niveles de PMT se ajusta pulsando el botón de "hardware". Una vez establecido, mantener estos ajustes PMT constante.
  3. Escanear las diapositivas experimentales en los dos canales pulsando el botón "Scan". Guardar las imágenes de diapositivas (ambos canales) después de cada escaneo.
  4. Cargar la diapositiva a analizar en el software de microarrays utilizando el botón "archivo".
  5. Cargar el archivo de lista de conjunto de genes (GAL) utilizando el botón "archivo". El archivo GAL tiene el diseño de la matriz con la identidad de las características de la matriz.
  6. Colocar la plantilla de matriz sobre la imagen escaneada de manera que las matrices de características coinciden con la plantilla lo más estrechamente posible.
  7. Alinear características en todos los bloques con la plantilla pulsando el botón "align". El programa general, encontrar el resumen de las características circulares pero algunos ajustes manuales, puede ser necesario. Estos ajustes se pueden hacer entrando al modo de función. El software calculará entonces un MFI-B para cada uno de los antígenos.
  8. Utilice el botón "archivo" para exportar estos resultados como un archivo de texto.

4. Análisis de datos de matriz con el análisis de la importancia microarrays (SAM)

  1. Cargar archivos de texto individuales en Excel e identificar las columnas que tienen MFI-B para los canales de Cy3 y Cy5.
  2. Calcular la media de las funciones duplicadas.
  3. Para cualquier negativa MFI-B, reemplace el número negativo con 10. Transformar los datos en bruto dividiendo MFI-B por 100 y después mediante el cálculo de logaritmo en base 2.
  4. Analizar los datos transformados logarítmicamente con el análisis de la importancia microarrays (SAM) como se ha descrito previamente 7.
  5. Para un estudio con dos grupos (por ejemplo, controles sanos frente a pacientes), la etiqueta de un grupo "1" y el grupo "2." Utilice una de dos clases, el análisis no apareado en el SAM para identificar los antígenos que son reactividades significantly diferente entre los dos grupos (valor q <0,05).
  6. Utilice el software de clustering y de generación de calor de ruta para hacer imágenes para su presentación 8.

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Representative Results

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Los antígenos están dispuestos en una placa de 384 pocillos y se imprimen en portaobjetos por un microarrayer robótico, como se muestra en la Figura 1. La figura 2 muestra las diapositivas colocados en un marco con cámaras de incubación y una diapositiva explorada después del procesamiento. La figura 3 muestra portaobjetos de control positivo y negativo. La corredera negativo solamente se sondea con anticuerpos secundarios, y el control positivo se sonda con suero de un paciente con lupus eritematoso sistémico. Mediante el uso de dos anticuerpos secundarios marcados por separado, IgG e IgM reactividades pueden ser separadas en la misma superficie de deslizamiento. La figura 4 muestra la intensidad de fluorescencia de anticuerpos IgM contra ADN de cadena sencilla (ssDNA) y IgG anticuerpos contra ribosomal P (Ribo P) en un amplio gama de diluciones de suero. En este experimento el suero control positivo de un paciente con lupus eritematoso sistémico con la reactividad conocida de las Ribo P se utilizó. Linlas respuestas del oído se observan en el canal de IgM sobre todas las soluciones de suero. respuestas lineales se observan en el canal de IgG hasta un MFI-B de aproximadamente 30.000. Después de este punto, las respuestas comienzan a saturar y los aumentos de anticuerpo a Ribo P no conducen a un aumento correspondiente en MFI-B. La Figura 5 muestra cómo las matrices se pueden utilizar para detectar el factor reumatoide en suero humano. En este estudio, se utilizó suero de un paciente con vasculitis crioglobulinémica con un factor reumatoide documentado (anticuerpos IgM contra IgG) de 167 UI / ml (normal <11 IU / ml). El uso de anticuerpos secundarios por sí sola, no tiene reactividad IgM se ve en contra de la IgG que se vio en la matriz. Por el contrario, se detecta significativa reactividad IgM (MFI-B de aproximadamente 5.000) contra IgG cuando la corredera se sondea con suero del paciente con factor reumatoide. La figura 6 muestra el desarrollo de un microarray antígeno de dos colores para su uso con suero de ratón. En esta figura, IgM de ratón THa se detecta en el array sólo es detectada por el anticuerpo secundario anti-ratón IgM y IgG de ratón que se vio en el array sólo es detectada por el anticuerpo secundario anti-IgG de ratón. La figura 7 muestra la alineación de una rejilla de la plantilla en un escaneado imagen matriz usando el software de análisis de microarrays. Una vez que las características de la matriz se han alineado con la red, las características de la matriz pueden ser analizados para obtener la intensidad de fluorescencia media de menos de fondo para cada función.

Figura 1
Figura 1. Generación de antígeno microarrays. Los antígenos se coloca primero en la placa fuente. En la placa de fuente mostrado en la figura, los antígenos están dispuestos en grupos de 9, igualando la disposición 3 x 3 de los pasadores del cabezal de impresión. La placa de fuente se coloca entonces en el microarrayer robótico y los antígenos son luego manchado sobre los portaobjetos. En este ejemplo, 2-pad diapositivas RÁPIDO are utilizado, teniendo en cuenta las matrices idénticas que se manchará sobre las superficies 2 de nitrocelulosa. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Procesamiento del antígeno microarrays. Los portaobjetos se colocan en marcos de FAST usando cámaras de incubación y se procesan mediante la adición de muestras y luego anticuerpos secundarios. reactividades de antígeno se revelan con un escáner capaz de detectar señales fluorescentes. Se muestra la imagen escaneada de una diapositiva RÁPIDO 2-pad. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3 <br /> Figura 3. Dos colores antígeno Microarrays optimizado para su uso con sueros humanos. (A) IgG, IgM, IgG y Fc se detectan en la matriz sondeado únicamente con anticuerpos secundarios. Estos tres antígenos son controles positivos para mostrar la especificidad de los anticuerpos secundarios. fluorescencia roja (canal IgM) indica la unión del anticuerpo secundario IgM anti-humano. fluorescencia verde (canal IgG) indica la unión del anticuerpo secundario IgG anti-humano. El antígeno IgG Fc es blanca debido a la sobresaturación. (B) Muchos más reactividades se detectan en la matriz se sondearon con suero de control positivo de un paciente con lupus eritematoso sistémico con reactividad conocida de antígeno Ribo P. Las cajas indican los lugares donde han sido dispuestas antígenos de ADN y Ribo P. (C) Cuantificación de las intensidades de fluorescencia en el suero de control positivo revela que la mayoría de las reactividades de anticuerpos contra antígenos de ADN son de la IgM isotipo. (D) La cuantificación de las intensidades de fluorescencia en el suero de control positivo revela que la mayoría de las reactividades de anticuerpos contra antígenos Ribo P son del isotipo IgG. características de la matriz se detectaron por duplicado y son aproximadamente 500 micras de diámetro. Los gráficos muestran la media ± SD para las características de la matriz. ADN de doble cadena, ADN de cadena doble; ssDNA, ADN de cadena sencilla; MFI-B, la intensidad media de fluorescencia menos el fondo; Ribo P, ribosomal P. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Intensidad de fluorescencia vs. Serum Factor de dilución. (A) MFI-B a través de una amplia gama de diluciones de suero se muestra para IgM contra ssDNA y IgG contra Ribo P. Para estosexperimentos, se utilizó suero de control positivo conocido con la reactividad de IgG contra Ribo P y ssDNA. MFI-B se satura a un valor de aproximadamente 65.000. Transformación (B) Log2 de los datos MFI-B revela respuestas lineales en ambos de los canales de IgG e IgM en una amplia gama de reactividades de antígeno. Durante un MFI-B de 30.000, la señal de IgG comienza a saturar y pierde la linealidad. características de la matriz fueron vistos en 6 repeticiones. Los gráficos muestran la media ± SD para las características de la matriz. ssDNA, ADN de cadena sencilla; MFI-B, la intensidad media de fluorescencia menos el fondo; Ribo P, ribosomal P. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. La detección de factor reumatoide con dos colores antígeno microarrays. (B) de matriz se sondearon con suero de un paciente con vasculitis crioglobulinémica con un alto factor reumatoide. La función de IgG es de color verde-amarillo debido a la unión de IgM en el suero del paciente para inmovilizado IgG. Curiosamente, este paciente también tiene anticuerpos IgG contra IgM como la característica IgM aparece de color naranja. El paciente también tiene una historia de enfermedad cardíaca congénita y se observó a tener una alta reactividad a la proteína troponina C. La cuantificación (C) de la IgG e IgM incluye en la matriz sondeado únicamente con anticuerpos secundarios muestra que los anticuerpos secundarios no tienen cualquier reactividad cruzada. (D) Cuantificaciónde las características de IgG e IgM en la matriz se sondearon con el suero del paciente se confirma la presencia de factor reumatoide. Las características son vistos por duplicado y son aproximadamente 500 micras de diámetro. Los gráficos muestran la media ± SD para las características de la matriz. MFI-B, la intensidad media de fluorescencia menos el fondo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. Desarrollo de matrices de dos colores para Perfil Ratón anticuerpos séricos. (A) de matriz única sondeó con anticuerpos secundarios. fluorescencia roja indica la unión del anticuerpo secundario anti-IgM de ratón. de fluorescencia verde indica que la unión del anticuerpo secundario anti-IgG de ratón. La IgG de ratón que se vio en la matriz sólo se detecta por el anti-mouse IgG anticuerpo secundario, y la IgM de ratón que se detecta sólo se detecta por el anticuerpo secundario anti-IgM de ratón. Las otras características de las matrices que son detectadas por los anticuerpos secundarios son anticuerpos de captura contra IgG de ratón o IgM de ratón. (B) de matriz se sondaron con un anticuerpo monoclonal IgG de ratón contra etiquetas de histidina. En esta matriz, el antígeno Ribo P (proteína recombinante marcada con His) es de color verde, lo que indica que sólo se detecta por el anticuerpo secundario anti-IgG de ratón. Esto se espera ya que el anticuerpo monoclonal es del isotipo IgG. El antígeno Ribo P no se detecta cuando las matrices se sondaron con anticuerpos secundarios solos (recuadro naranja). (C) Cuantificación de IgG, IgM, y Ribo P dispone en la matriz se sondaron con un anticuerpo monoclonal IgG de ratón contra etiquetas de histidina. características de la matriz se detectaron en seis repeticiones y aproximadamente 500 micras de diámetro. Los gráficos muestran la media ± SD para las características de la matriz. MFI-B, la mediana fluorEscence intensidad de menos de fondo; Ribo P, ribosomal P. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7
Figura 7. Alineación de una cuadrícula de plantilla sobre una matriz de imagen. En esta captura de pantalla, una rejilla de la plantilla, que se genera a partir de un archivo gal, se alineó con un microarray de antígeno previamente escaneada. La matriz se sondó con suero de un paciente con lupus eritematoso sistémico y un trastorno de coagulación de la sangre que tenía muchos reactividades de autoanticuerpos. fluorescencia verde representa la unión de los anticuerpos IgG y la fluorescencia roja representa la unión de anticuerpos IgM. Las características impresas por pasadores sólidos son casi circular y son fácilmente descritos por el software de microarrays (Genepix). Una vez que la rejilla de alineación se ha completado, el software puede calcular la intensidad de fluorescencia media de menos de fondo (tanto en los canales de Cy3 y Cy5) para cada una de las características de la matriz. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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El protocolo descrito aquí permite la cuantificación de autoanticuerpos utilizando la técnica de microarray antígeno. microarrays de antígeno ofrecen varias ventajas sobre ELISA convencional en la detección de autoanticuerpos. En primer lugar, una variedad de antígenos, incluyendo ácidos nucleicos, proteínas, péptidos, y los lisados ​​celulares se puede vestida sobre los portaobjetos de nitrocelulosa recubierto, lo que permite la detección de autoanticuerpos multiplexada. Además, sólo microgramos de antígeno son necesarios para generar las matrices desde nanolitros de antígeno son avistados en cada diapositiva. Las matrices también requieren muy poca muestra del paciente, ya que se necesita solamente 5 l de suero a la sonda una superficie de la matriz en una dilución 1: 100 de la muestra. Finalmente, manchas arrays sobre nitrocelulosa se ​​han demostrado ser más sensible que el ELISA convencional en la detección de autoanticuerpos 9.

Además de utilizar los microarrays de antígeno para la detección de autoanticuerpos, las matrices pueden ser de usod para detectar la reactividad contra las proteínas no propios (por ejemplo, proteínas virales), para definir la especificidad de los anticuerpos monoclonales, y para medir los niveles de anticuerpos no HLA en el trasplante como se describe anteriormente 9-12. microarrays antígeno también se pueden utilizar para llevar a cabo experimentos de mapeo de epítopos detallada, donde la superposición de péptidos de una sola proteína se disponen sobre un portaobjetos. Un estudio reciente utiliza este enfoque para definir epítopos de la proteína U1-70K que son objetivos de autoanticuerpos en lupus eritematoso sistémico 13.

Utilizando el protocolo descrito aquí, la detección de IgG e IgM reactividades es lineal en un amplio intervalo de diluciones de suero. Estos estudios se llevaron a cabo utilizando suero control positivo de un paciente con lupus eritematoso sistémico con la reactividad conocida de antígeno ribosomal P y ssDNA. IgM reactividad a ssDNA es lineal en diluciones de suero de 1: 125 a 1: 32.000, correspondiente a MFI-B de 17.000 a 50. reactividad IgG aRibo P es lineal en diluciones de suero de 1: 4000 a 1: 512.000, correspondiente a MFI-B de 32 000 a 200. En diluciones inferiores a 1: 4000 (y MFI-B mayor que 32.000), la curva se aplana la detección de la reactividad de IgG y ya no es lineal. En el trabajo con los receptores de trasplante de corazón, el suero se diluye de forma rutinaria a 1: 100 como MFI-B para antígenos rara vez supera los 10.000 a esta dilución. Para los estudios con pacientes con enfermedad autoinmune con autoanticuerpos de alto título, las muestras de pacientes pueden necesitar ser diluidas para asegurar que la mayoría de las reactividades de autoanticuerpos dentro del intervalo lineal del ensayo.

Mientras MFI-B puede ser útil comparar las reactividades de autoanticuerpos entre grupos de pacientes, también puede ser útil para convertir este valor en una medida más cuantitativa de los niveles de autoanticuerpos. Esto puede lograrse mediante la detección de múltiples conocido diluciones de IgG purificada y IgM sobre los portaobjetos para generar una curva estándar. El uso de esta curva, IMF-B, entonces puede ser transformada en un nivel de autoanticuerpos para cada antígeno.

En el protocolo que aquí se presenta, se utilizaron 2-pad diapositivas de nitrocelulosa con recubrimiento. En estas diapositivas, dos matrices idénticas, que pueden ser sondeadas con dos muestras de suero separadas, se imprimen en cada diapositiva. Esto permite que dos muestras del mismo paciente (como tratamiento pre y post) que han de compararse en la misma diapositiva, lo que minimiza la variabilidad interslide. Treinta y dos portaobjetos con 64 muestras de pacientes individuales se procesan habitualmente al mismo tiempo en un día. La gama más actual se imprime con 9 pines, lo que permite 162 antígenos que se imprimirá por duplicado (cada pin imprime un subconjunto 36 característica que es igual a 18 antígenos impresas por duplicado).

Los microarrays de antígeno que se generan en este protocolo se imprimieron con alfileres microarrayer sólidos. Impresión con pasadores sólidos requiere más tiempo que imprimir con pasadores de estilo pluma ya que el microarrayer debe volver a echar mano de la placa de la fuente después de cada tIME que los pasadores toquen la superficie de deslizamiento. Se utilizaron clavijas sólidas, ya que producen, las características de la matriz casi circulares altamente reproducibles (aproximadamente 500 micras de diámetro). Estas características pueden ser fácilmente detectados y descritos por el software del escáner, y se necesitan ajustes manuales mínimos para cuantificar las características de la matriz. clavijas sólidas también permiten lisados ​​de células para ser impreso, que puede ser difícil de imprimir con pasadores canilla debido a su mayor viscosidad. Debido a los largos tiempos de impresión implicados con pasadores sólidos (a veces 10 - 11 horas para imprimir 70 diapositivas), antígenos que no se están impresas en la placa de fuente están cubiertas con papel de aluminio para evitar la evaporación.

El protocolo descrito aquí presenta un método para separar IgG e IgM reactividades en la misma superficie de deslizamiento. Los arrays se han optimizado para la detección de ambos anticuerpos humanos y de ratón utilizando pares de anticuerpos secundarios marcados con diferentes fluoróforos. Fundamental para este enfoque de dos colores es la identificación Secoanticuerpos Ndary que son altamente específicos para cualquiera de los isotipos de IgG o IgM. Los anticuerpos secundarios que se utilizan reconocen la porción Fc de IgG o IgM y no reaccionan de forma cruzada entre sí. La separación de las señales de IgG e IgM es importante dadas las diferentes funciones de estos anticuerpos en la respuesta inmune. Por ejemplo, IgM se produce en los niveles superiores por las células B1 y es típicamente un marcador de una respuesta inmune temprana. Por otro lado, IgG es un marcador de una respuesta inmune más tarde, que se desarrolla como resultado de la clase de conmutación 14. Mediante la detección de las señales de IgG e IgM por separado, también es posible identificar los factores reumatoides IgM en muestras de pacientes (es decir, inmunoglobulinas IgM que se unen a IgG que se ha visto en la matriz). Mediante la identificación de diferentes porciones de anticuerpos (por ejemplo, Fc frente a Fab), la unión de factor reumatoide a diferentes epítopos de anticuerpos IgG se puede cuantificar. Con la disponibilidad de escáneres con más de dos láseres, adicional segundaanticuerpos ary podrían añadirse a la par anticuerpo secundario actual para identificar la unión de los anticuerpos IgA, IgD o IgE. Los anticuerpos secundarios también pueden ser identificados que permitiría la identificación de las subclases de IgG distintos (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) unidos a antígenos en una sola matriz.

En conclusión, la técnica de microarrays antígeno es una tecnología robusta que permite la caracterización de alto rendimiento de autoanticuerpos en suero. Esta técnica es altamente adaptable y sensible. El sistema de detección basado en la fluorescencia ha sido optimizado para los estudios humanos y ratón y permite la detección simultánea de anticuerpos IgG e IgM.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ribosomal P0 Diarect 14100 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG Jackson Immuno 009-000-003 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM Jackson Immuno 009-000-012 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG Sigma-Aldrich I5381 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM Biolegend 401601 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA Sigma-Aldrich D1626 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA Sigma-Aldrich D8899 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer Virtek VersArray Chipwriter Pro many types of arrayers are suitable
solid printing pins Arrayit Corporation SSP015
software for robotic microarrayer Virtek Chipwriter Pro 
FAST slides (2 Pad) GVS Northa America 10485317
FAST frame GVS Northa America 10486001
FAST incubation chambers (2 Pad) GVS Northa America 10486242
384 well plates Whatman 7701-5101
plate sealers VWR 60941-062
foil plate covers VWR 60941-124
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Fetal calf serum Invitrogen 12483020
Cy3 goat anti-human IgG Jackson Immuno 109-165-096 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM Jackson Immuno 109-175-129 use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG Jackson Immuno 115-165-071 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM Jackson Immuno 115-175-075 use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner Molecular Devices Axon 4200A
Microarray software Molecular Devices Genepix 6.1
Clustering software eisenlab.org Cluster 3.0
Heatmap software eisenlab.org Treeview 1.60
Microarray statistical software Stanford University SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)

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References

  1. Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
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Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).More

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).

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