Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

IgG ve IgM Antikorlarının Eşzamanlı Algılama için İki Renkli Antijen Mikroarray'ler Üretimi

doi: 10.3791/54543 Published: September 15, 2016

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Sulandırma antijen ve Yaratma Antijen Mikroarray'ler

  1. 0.2 mg / ml'lik bir son konsantrasyona PBS içinde antijenleri seyreltilir. 9 iğneli bir mikro-dizici konfigürasyonu ile iki nüsha halinde 162 kadar benzersiz antijenleri yazdırın. antijen kitaplık olarak pozitif kontrol IgG ve IgM antijenleri ekleyin. Yalnızca bir negatif kontrol olarak PBS içerir.
  2. 384 gözlü bir kaynak plaka her bir antijenin 20 ul ekle. Kafasının kurulumu ayna gruplar halinde kaynak plakasına antijenleri ekleyin (9 pimleri baskı için kullanıldığında, örneğin, 9 kişilik gruplar halinde antijenleri düzenlemek).
  3. diziler yazdırmak için hazır olana kadar -80 ° C'de folyo ve dondurma ile kapak kaynak plakası.
  4. 3 x 1 dakika boyunca iyonu giderilmiş su ile, bir sonikasyon banyosu içinde onları kuluçka katı mikro-dizici işaretçilerini temizleyin. rafa yerleştirin pimleri kurutun ve daha sonra mikroarray yazıcı kafasındaki işaretçilerine düzenlemek için. 9 pin için, 3 x 3 yapılandırmayı kullanın.
  5. kafasının sayı işaretçilerine ayarlayarak tarafından işletilen baskı için program mikro-dizici,slaytlar sayısı her slaytta, pedleri numarasını yazdırmak ve her bir antijen için çoğaltmak lekelerin sayısı için. Tipik olarak, 9 işaretçilerine, 70 kaydırak, 2 pedleri / slayt ve her bir antijen için 2 suret noktalar kullanın. Program mikro-dizici antijenlerin farklı gruplar arasında suda işaretçilerine ses dalgalarına maruz için.
  6. Çözülme kaynak plakası 100 x g, 1 dakika daha sonra santrifüj plaka. mikro dizicinin belirlenen noktada kaynak plaka koyun. Basılacak antijenlerin ilk grubu kapsayan folyo bölümünü kaldırın.
  7. arrayer yüzeyi ve çalıştırma baskı programı baskısız slaytlar düzenleyin. Dizi makinesinin nemlendirici inşa ile% 60 - nem oda sıcaklığında baskı slaytlar 55 de arrayer ayarlanır.
  8. antijenlerin her grup her slaytlarda basıldıktan sonra, mikro-dizici duraklatmak. sadece folyo ile basıldı antijenleri Kapak (buharlaşmasını önlemek için) ve antijenlerin sonraki grup basılacak ortaya çıkarmak. Baskı programına devam edin.
  9. Tüm antijenler yazdırıldıktan sonra, kapak kaynak pl-80 ° C folyo ve dondurma yeni bir parça ile yedi. slayt kutu ve vakum mühür basılmış slaytlar yerleştirin. Slaytlar ertesi gün kullanılan veya en fazla bir ay sonra olabilir.

2. Seyreltik Sera ile Antijen mikrodizileri Probing

  1. Kuluçka odaları kullanarak çerçevelerin içine slaytlar yerleştirin. Her bir dizi yüzey engelleme tamponu (% 2.5 [hacim / hacim] fetal buzağı serumu (FCS), PBS içinde Tween 20,% 0.1 [/ hacim: hacim]) 700 ul ekle.
  2. Islak bir doku parçası ile kapalı bir kapta çerçeve ve yerde yapışkan film yerleştirin. bir rocker 4 ° C'de O / N inkübe edin.
  3. Serum örnekleri 1 sulandırmak: 100 tampon engelleme. Aspire dizilerden engelleme çözümü ve her dizi yüzeyine seyreltilmiş örnek 500 ul ekleyin.
  4. yapışkan film ile örtün ve sallanan 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca inkübe edilir.
  5. tampon engelleme ikincil antikorlar seyreltilir. İnsan deneyleri için, 0.33 mg / ml ve Cy5 bir Cy3 etiketli keçi anti-insan IgG antikoru seyreltilmiş keçi anti-Huma etiketli0.25 ug / ml IgM antikoru n. Fare çalışmaları için, bir Cy3 mi 0.38 ug / keçi anti-fare IgG antikoru etiketlenmiş ve bir Cy5 / ml 0.7 ug keçi anti-fare IgM antikoru etiketli seyreltin.
  6. dizileri aspire örnekler ve dizi yüzeyleri durulama tamponu (PBS içerisinde% 0.1 Tween 20) ile 4 kez yıkayın. slaytlar üzerine tampon ve çabuk fiske dökün.
  7. sallanan oda sıcaklığında her dizi yüzeyini yıkamak ve 10 dakika inkübe etmek blokaj tamponu 700 ul ekle. Tekrarlayın yıkama adımı iki kez daha.
  8. Her slayt yüzeyine seyreltilmiş ikincil antikor 500 ul ekleyin ve yapışkan film ile kaplayın. sallanan 4 ° C'de 45 dakika inkübe edin.
  9. Aspire ikincil antikor slaytlar gelen karışım ve yukarıdaki gibi 4 kez yıkayın. Yıkama yukarıdaki gibi engelleme / seyreltme tamponu 700 ul ile 3 kez kayar.
  10. PBS batırılır metal slayt raf çerçeveleri ve yerden slaytları çıkarın. yörünge çalkalama ile oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkalayın. PBS yeni kapta koyun ve başka bir 20 m inkübesallayarak ile.
  11. deiyonize su 15 saniye bir kap içine koyun slayt raf. su, yeni bir kapta raf yerleştirin ve başka bir 15 saniye kuluçkaya yatmaktadır.
  12. Kuru slaytlar, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 220 xg'de santrifüj ve spin bir ELISA plakası adaptörü üzerindeki yeri slayt rafa.
  13. tarama için hazır olana kadar ışık geçirmez kutu slaytlar yerleştirin.

3. Tarama Antijen Mikroarray'ler ve İhracat Verileri

  1. Cy3 ve Cy5 floresan sinyalleri algılayabilen bir mikrodizi tarayıcı kullanarak tarama slaytlar. Tarayıcının photomultiplier tüp (PMT) seviyesini ayarlamak için, sadece sekonder antikor ile problanmıştır bir slayt önceden tarayın.
    Not: Bu slayt tam pozitif (IgG ve IgM) de dahil olmak üzere basılmış antijen kütüphanesi yanı sıra negatif (PBS) kontrolleri olmalıdır. ön tarama optimum PMT ayarlarını bulmak için hızlı bir şekilde kullanıcı sağlayan bir düşük çözünürlüklü tarama olduğunu.
  2. PMT değerlerini ayarlayın, böylece (Cy3 kanalında) insan IgG özellikleri ve uğultu(Cy5 kanalında) bir IgM özellikleri benzer medyan floresan eksi arka plan (MFI-B) (tipik olarak 40.000) var. PMT düzeyleri "donanım" düğmesine basarak ayarlanır. ayarlandıktan sonra, sabit bu PMT ayarları korumak.
  3. "Tarama" tuşuna basarak iki kanal deneysel slaytlar tarayın. Her taramadan sonra slayt görüntüleri (iki kanal) kaydedin.
  4. slayt yükle "Dosya" düğmesini kullanarak mikroarray yazılımı içine analiz edilecek.
  5. "Dosya" düğmesini kullanarak gen dizisi listesi (GAL) dosyasını yükleyin. GAL dosya dizisi özellikleri kimlikleri ile dizinin düzeni vardır.
  6. diziler özellikleri mümkün olduğunca yakından şablonu eşleşecek şekilde taranan görüntünün üzerine dizi şablonu yerleştirin.
  7. "Hizalama" düğmesine basarak şablonu ile tüm bloklarda özellikleri aynı hizaya getirin. Program genellikle dairesel özellikleri anahat bulacaksınız ama bazı manuel ayarlamalar gerekebilir. Bu ayarlamalar özellik moduna girerek yapılabilir. Yazılım daha sonra antijenlerin her biri için bir MFI-B hesaplar.
  8. Bir metin dosyası olarak bu sonuçları ihracat "dosya" düğmesini kullanın.

Mikroarray'ler Önemi Analizi ile 4. Analiz Dizi Verileri (SAM)

  1. excel içine tek metin dosyaları yüklemek ve Cy3 ve Cy5 kanalları için MFI-B var sütunları belirlemek.
  2. yinelenen özellikler için ortalama hesaplayın.
  3. herhangi bir olumsuz MFI-B, 10 ile negatif sayı günlük tabanı 2 hesaplayarak sonra 100 ile ham MFI-B bölünmesi ve verileri Transform değiştirin.
  4. Daha önce 7 açıklandığı gibi Mikroarray'ler (SAM) Önemi Analizi ile günlük dönüştürülmüş verileri analiz edin.
  5. Iki grup (örneğin, sağlıklı kontrol vs hasta), etiket bir grup "1" ve grup kullanarak bir çalışma için "2." ler vardır antijenler reaksiyonlarını belirlemek için SAM iki sınıf, eşleşmemiş analizini kullanınHer iki grup arasında önemli ölçüde farklıdır (q <0.05).
  6. Sunum 8 görüntüleri yapmak için kümeleme ve ısı haritası üreten yazılımını kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Şekil 1'de gösterildiği gibi antijenler bir robot mikro dizicinin tarafından Slaytlarınıza 384 plaka olarak düzenlenmiş ve yazdırılır. 2 inkübasyon odaları ve işlenmesinden sonra taranmış bir slayt ile bir çerçeve içinde yerleştirildi slaytlar göstermektedir. 3 pozitif ve negatif kontrol slaytlar göstermektedir. Negatif bir slayt, sadece sekonder antikor ile incelendi ve pozitif kontrol slayt sistemik lupus eritematozus, bir hastadan alınan serum ile incelenir. İki ayrı işaretlenmiş sekonder antikorlar kullanarak, IgG ve IgM reaktiviteleri aynı slayt, yüzey üzerindeki ayrılabilir. Şekil 4, tek bağlı DNA (ssDNA) ve IgG geniş fazla ribozomal P (Ribo P) karşı antikorlar karşı IgM antikorlarının floresans yoğunluğunu gösterir serum seyreltileri aralığı. Ribo P yönelik bilinen reaktiviteye sahip sistemik lupus eritematozus, bir hastadan alınan bu deney, pozitif kontrol serumunun kullanılmıştır. LinKulak yanıtları tüm serum dilüsyonları üzerinde IgM kanalında görülmektedir. Doğrusal yanıtlar yaklaşık 30.000 MFI-B kadar IgG kanalında görülmektedir. Bu noktadan sonra, yanıtları doyurulması için başlar ve Ribo P antikor artışlar MFI-B karşılık gelen bir artışa neden olmamıştır. Dizileri insan serum romatoid faktörü tespit etmek için nasıl kullanılabileceğini 5 göstermektedir. Bu çalışmada, belgelenmiş romatoid faktör ile kriyoglubulinemik vaskülit olan bir hastadan alınan serum (normal <11 IU / ml) 167 IU / ml (IgG karşı IgM antikorları) kullanıldı. yalnız ikincil antikorlar kullanılarak, hiçbir IgM reaktivite dizisi üzerine fark edilir IgG karşı görülür. Slayt romatoid faktör hastadan serum ile incelenir Aksine, önemli bir IgM reaktivite (yaklaşık 5.000 MFI-B) IgG karşı tespit edilir. 6 fare serumu ile kullanım için bir iki-renkli antijeni mikrodizisinin gelişimini göstermektedir. Bu şekilde, fare IgM incidizisi üzerinde belirlenir sadece dizisi yalnızca anti-fare IgG ikincil antikor ile tespit edilir üzerinde belirlenir anti-fare IgM sekonder antikor ve fare IgG ile tespit edilir. taranmış bir şablon ızgara 7'de hizalaması, Şekıl mikrodizi analiz yazılımı kullanılarak dizi görüntü. Dizi özellikleri ızgara ile uyumlu edildikten sonra, dizi özellikleri her özellik için medyan floresan eksi arka plan elde etmek için analiz edilebilir.

Şekil 1
Antijen Mikrodiziler. Antijen Şekil 1. Üretim İlk kaynak plakasının yerleştirilir. Şekil l'de gösterilen kaynak plakasında antijenler yazıcı kafası pim, 3 x 3 düzeni eşleşen 9 gruplar halinde düzenlenmiştir. Kaynak plaka daha sonra robotik mikro dizicinin yerleştirilir ve antijenler daha sonra slaytlar üzerine fark vardır. Bu örnekte, 2-pad HIZLI slaytlar arözdeş diziler için izin kullanılan e, 2 nitroselüloz yüzeylere lekeli olabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Antijen Mikrodiziler. Slaytlar Şekil 2. İşleme inkübasyon odası kullanılarak hızlı dilimlerinde yerleştirilir ve daha sonra sekonder antikor örnekleri eklenmesi ve işlenir. Antijen reaktiflikleri flüoresan sinyalleri saptayabilen bir tarayıcı ile ortaya çıkar. 2-pad HIZLI slayt Taranan görüntü gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3, <br /> Şekil 3. İnsan Sera ile kullanım için iki renkli Antijen Mikroarray'ler Optimize. (A) IgG, IgM ve IgG Fc, sadece sekonder antikor ile problanmıştır dizisinde tespit edilir. Bu üç antijenler sekonder antikor özgünlüğünü gösteren pozitif kontrol bulunmaktadır. Kırmızı floresans (IgM kanalı), anti-insan IgM sekonder antikor bağlanmasını gösterir. Yeşil floresan (IgG kanalı), anti-insan IgG ikincil antikor bağlanmasını gösterir. IgG Fc antijeni aşırı doygunluk nedeniyle beyazdır. (B), çok daha fazla reaktivite Ribo P antijen için bilinen reaksiyon ile sistemik lupus eritematozus, bir hastadan alınan pozitif kontrol serumu ile problanmış dizisinde tespit edilir. Kutuları, DNA ve Ribo P antijenleri dizilmiş olan yerleri gösterir. (C) pozitif kontrol serumunda floresan yoğunlukları Kantitasyonu DNA antijenlere karşı antikor reaktivite çoğunluğu Ig olduğunu ortaya koymaktadırM izotip. (D), pozitif kontrol serumunun floresan yoğunluklarının Niceleme Ribo P antijenlerine karşı antikor reaktivitelerinin çoğunluğu IgG izotipinde olduğu görülmektedir. Dizi özellikleri kopya halinde lekeli ve yaklaşık 500 mikron çaplı halindedirler. Grafikler dizi özellikleri için ortalama ± SD göstermektedir. dsDNA, iki iplikçikli bir DNA; ssDNA tek şeritli DNA; MFI-B, medyan floresan yoğunluğu eksi arka plan; Ribo P, ribozomal P bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Serum seyreltme faktörü genel Şekil 4. florasan yoğunluğu (A). Serum sulandırmaları, geniş bir aralık üzerinde MFI-B, bu için Ribo P. karşı ssDNA ve IgG karşı IgM gösterilmektedirDeneyler, Ribo P ve ssDNA karşı bilinen IgG tepkisi olan, pozitif kontrol serumunun kullanıldı. MFI-B., Yaklaşık 65,000 arasında bir değerde, doymuş MFI-B verileri (B) log2 dönüşümü antigen reaktiflikleri geniş bir aralığı üzerinde hem IgG ve IgM kanallarında, doğrusal yanıtlar içermemektedir. 30.000 bir MFI-B üzerinde, IgG sinyal doyurmak için başlar ve doğrusallık kaybeder. Dizi özellikleri 6 tekrarlı tespit edildi. Grafikler dizi özellikleri için ortalama ± SD göstermektedir. ssDNA tek şeritli DNA; MFI-B, medyan floresan yoğunluğu eksi arka plan; Ribo P, ribozomal P bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
İki renkli Antijen Mikroarray'ler ile Romatoid Faktör Şekil 5. tespiti. (B) dizisi. IgG özelliği nedeniyle IgG hareketsizleştirilmiş hastanın serum IgM bağlanması yeşil-sarı renktedir. IgM özelliği turuncu göründüğü gibi İlginçtir, bu hasta da IgM karşı IgG antikorları vardır. Hasta aynı zamanda konjenital kalp hastalığı geçmişi vardır ve IgG ve IgM sadece sekonder antikor ile probed dizisinde özellikleri ikincil antikorlar yok olduğunu göstermektedir kardiyak protein troponin C (C) Niceleme yüksek reaktivitesi sahip olduğunu kaydetti çapraz reaktivite. (D) NicelemeHasta serumu ile probed dizisinde IgG ve IgM özelliklerinin romatoid faktör varlığını doğrulamaktadır. Özellikler kopya lekeli ve yaklaşık 500 mikron çaplı halindedirler. Grafikler dizi özellikleri için ortalama ± SD göstermektedir. MFI-B, medyan floresan yoğunluğu eksi arka plan. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
İki renkli Diziler Şekil 6. Kalkınma Fare Serum Antikorlar Profile. (A) Dizi sekonder antikor ile sadece araştırdı. Kırmızı floresans anti-fare IgM sekonder antikor bağlanmasını gösterir. Yeşil floresan anti-fare IgG ikincil antikor bağlanmasını gösterir. dizisi üzerinde belirlenir fare IgG, sadece anti-MM ile tespit edilirSE IgG ikincil antikor, sadece anti-fare IgM sekonder antikor ile tespit edilir fark edilir fare IgM. Ikincil antikorlar tarafından tespit edilir dizilerinde diğer özellikleri fare IgG veya fare IgM karşı yakalama antikorlardır. Histidin etiketleri karşı fare IgG monoklonal antikor ile probed (B) Dizi. bu, dizide, Ribo P antijen (His-etiketli protein rekombinant) sadece anti-fare IgG ikincil antikor ile tespit belirten yeşildir. Bu monoklonal antikor, IgG izotipinde olduğu göz önüne alındığında beklenmektedir. Ribo P antijen dizileri tek başına ikincil antikor (turuncu kutu) ile problandı olduğunda. Tespit IgG, IgM (C) ölçme ve Ribo P histidin etiketleri karşı fare IgG monoklonal antikoru ile problanmış dizi özellikler değildir. Dizi özellikleri altı tekrarlamalı benekli ve yaklaşık 500 mikron çaplı halindedirler. Grafikler dizi özellikleri için ortalama ± SD göstermektedir. MFI-B, medyan fluoryoğunluk eksi zemin Escence; Ribo P, ribozomal P bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7,
Dizi Görüntü üzerine Şekil 7. Hizalama Şablon Grid. Bu ekran görüntüsünde, bir gal dosyasından oluşturulan bir şablon ızgara, önceden taranmış antijen mikroarray ile uyumlu oldu. Dizi, sistemik lupus eritematoz ve pek çok antikor reaktivitelere sahip bir kan pıhtılaşma bozukluğu olan bir hastadan alınan serum ile problanmıştır. Yeşil floresan IgG antikorlarının bağlanmasını temsil eder, ve kırmızı floresans IgM antikorlarının bağlanmasını temsil etmektedir. Katı pimleri tarafından basılan özellikleri neredeyse dairesel ve kolayca mikroarray yazılımı (GenePix) tarafından özetlenmiştir. Izgara hizalama tamamlandıktan sonra, software dizi özelliklerin her biri için ortalama floresan eksi (hem Cy3 ve Cy5 kanalları üzerinde) arka plan hesaplayabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada açıklanan protokol antijen mikrodizi tekniği kullanılarak otoantikorlann ölçümü sağlar. Antijen mikrodizileri otoantikorlar için eleme testi esnasında klasik ELISA göre birçok avantajı vardır. Her şeyden önce, nükleik asitler, proteinler, peptidler ve hücre lizatları dahil çeşitli antijenlere ve böylece oto antikorların çoğaltılmış çok katlı taranması için izin nitroselüloz kaplı slaydlar üzerine dizilmiş olabilir. antijen nanolitre Her bir slayt üzerine fark vardır Ek olarak, antijenin yalnızca mikrogram dizilerini üretmek için gereklidir. 100 dilusyonun: serum sadece 5 ul 1 bir dizi yüzeyini incelemek için gerekli olduğu gibi diziler de, çok az hasta örneği gerektirir. Son olarak, diziler nitroselüloz üzerine otoantikor 9 taramasında konvansiyonel ELISA daha duyarlı olduğu gösterilmiştir gördü.

otoantikorlar taranması için antijen mikrodiziler kullanmanın yanı sıra, diziler kullanmak olabilirD monoklonal antikorların spesifitesini belirlemek için, daha önce tarif edildiği gibi 9-12 transplantasyonunda non-HLA antikorlarının seviyelerini ölçmek için, kendinden olmayan proteinlerin (örneğin, viral proteinler) karşı etkinliği tespit etmek. Antijen mikrodizileri, aynı zamanda, tek bir protein çakışan peptitler slayt üzerine dizilmiş ayrıntılı epitop haritalama deneyleri için de kullanılabilir. Yeni bir çalışmada, sistemik lupus eritematozus 13 oto antikorların hedefleri olan U1-70K protein epitopların tanımlanması için bu yaklaşım kullandık.

Burada tarif edilen protokol kullanılarak, IgG ve IgM reaktivitelerinin tespit serum sulandırmaları, geniş bir aralık içinde doğrusaldır. Bu çalışmalar ribozomal P antijeni ve ssDNA için bilinen reaksiyon ile sistemik lupus eritematozus, bir hastadan alınan pozitif kontrol serumu ile yapıldı. 17,000 50. IgG reaktivitesi MFI-B karşılık gelen 32.000: 125 1: ssDNA IgM reaktivitesi 1 serum seyreltmeleri lineer olduğunu4000 (MFI-B 32,000 den daha büyük), IgG reaktivite düzleştirir tespit eğrisi: 1 'den daha düşük seyreltmelerde 200 32.000 MFI-B'ye karşılık, 512.000: 1 ila 4000: Ribo p, 1 serum seyreltilerinde doğrusaldır ve bundan sonra doğrusaldır. Kalp transplantasyonu ile çalışmada, serum rutin 1 seyreltilir: antijenleri için MFI-B nadiren bu seyreltme de 10.000 aşıyor 100 olarak. yüksek titreli antikorların otoimmün hastalığı olan hastalar üzerinde yapılan çalışmalarla, hasta numuneleri antikor reaktivitelerinin çoğunluğu doğrusal deney sınırları dahilinde olmasını sağlamak için daha da seyreltilerek gerekebilir.

MFI-B hastalarında grupları arasında otoantikor reaktiviteleri karşılaştırmak için yararlı olabilir, aynı zamanda otoantikor düzeylerinin daha nicel ölçü içine bu değeri dönüştürmek için yararlı olabilir. Bu, standart bir eğri oluşturmak için slaytlar üzerine saflaştırılmış IgG ve IgM çok bilinen dilüsyonları tespit ile gerçekleştirilebilir. Bu eğri kullanarak, MFI-B daha sonra trans olabilirher bir antijen için bir otoantikor seviyesi halinde oluşturulmuştur.

Burada yer alan protokol, 2-pad nitroselüloz kaplı slaytlar kullanılmıştır. Bu slaytlar üzerinde, iki ayrı serum örnekleri ile tanınacak iki özdeş diziler, her slayt üzerine basılır. Bu (örneğin öncesi ve sonrası tedavi gibi) aynı hastanın iki numune interslide değişkenlik en aza indirir aynı slayt üzerinde karşılaştırılmasına olanak tanır. 64 bireysel hasta numuneleri ile otuz iki kayar düzenli bir gün içinde, aynı zamanda işlenmektedir. En güncel dizi 162 antijenler için izin 9 iğneli basılır (her pim nüsha basılmış 18 antijenleri eşittir 36 özellik SubArray yazdırır) nüsha basılacak.

Bu protokol oluşturulan antijen mikroarray'ler katı mikro-dizici pimleri ile basıldı. Katı pimleri ile yazdırma mikro-dizici her t sonra kaynak plakasına daldırma yeniden gerekir çünkü tüy tarzı pimleri ile baskı daha tüketen daha fazla zaman olduğunupimleri slayt yüzeyine dokunmayın olduğunu ime. onlar (çapı yaklaşık 500 mikron) yüksek tekrarlanabilir, neredeyse dairesel dizi özellikleri üretmek gibi katı pimleri kullanılmıştır. Bu özellikler kolayca tespit ve tarayıcı yazılımı tarafından özetlenen, ve minimal manuel ayarlamalar dizisi özelliklerini ölçmek için gerekli olan edilebilir. Katı pimleri, aynı zamanda nedeniyle daha yüksek bir viskoziteye tüy pim ile baskı zor olabilir, basılacak hücre lizatları izin verir. Nedeniyle katı pimleri ile ilgili uzun baskı kez - kaynak plakası basılmış edilmemesi antijenler buharlaşmayı önlemek için folyo ile kaplıdır (bazen 10 saat 11 70 slaytları yazdırmak için).

Burada açıklanan protokol, aynı slayt, yüzey üzerindeki IgG ve IgM reaktivitelere ayrılması için bir yöntem sunmaktadır. diziler farklı fluorophores etiketli sekonder antikor çiftleri kullanılarak, hem insan hem fare antikorların taranması için optimize edilmiştir. Bu iki renkli yaklaşımına Kritik Seco tespitidiryüksek ya da IgG ya da IgM izotipleri için spesifik olan ndary antikorlar. kullanılan ikincil antikorlar IgG veya IgM Fc kısmını tanıyan ve birbirleri ile çapraz reaksiyona girmezler. IgG ve IgM sinyallerini ayırmak bağışıklık tepkilerinin bu antikorların farklı işlevler verilen önemlidir. Örneğin, IgM B1 hücreler tarafından daha yüksek seviyelerde üretilir ve tipik olarak erken bağışıklık tepkisinin bir markördür. Öte yandan, IgG sınıfı 14 geçiş bir sonucu olarak gelişir daha sonra bağışıklık cevabının, bir belirtecidir. Ayrıca IgG ve IgM sinyalleri tespit ederek, hasta numunelerinde IgM romatoid faktörlerinin belirlenmesi de mümkündür (yani, dizi üzerine tespit edilmiştir IgG'ye bağlama IgM immünoglobulinler). Antikorların farklı kısımlarını tespit ile (örneğin, Fab karşı Fc), farklı bir IgG antikoru epitoplara romatoid faktörü bağlama belirlenebilir. İkiden fazla lazerler ile tarayıcıların durumu ile, ilave ikincili antikorlar IgA, IgD veya IgE antikorların bağlanma tespit etmek mevcut ikincil antikor çifti eklenebilir. İkincil antikorlar, ayrıca, tek bir dizi üzerinde antijenlere bağlanan ayrı bir IgG altsınıfları (lgG1, IgG2, IgG3, IgG4) tanımlanması için izin vereceğini tanımlanabilir.

Sonuç olarak, antijen mikrodizi tekniği kanında, serum antikorlanyla yüksek verimlilik karakterizasyonu için sağlayan bir sağlam bir teknolojidir. Bu teknik son derece özelleştirilebilir ve duyarlıdır. flüoresan bazlı tespit sistemi, insan ve fare çalışmalar için optimize edilmiş ve IgG ve IgM antikorlarının eş zamanlı saptanması için olanak tanımaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ribosomal P0 Diarect 14100 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG Jackson Immuno 009-000-003 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM Jackson Immuno 009-000-012 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG Sigma-Aldrich I5381 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM Biolegend 401601 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA Sigma-Aldrich D1626 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA Sigma-Aldrich D8899 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer Virtek VersArray Chipwriter Pro many types of arrayers are suitable
solid printing pins Arrayit Corporation SSP015
software for robotic microarrayer Virtek Chipwriter Pro 
FAST slides (2 Pad) GVS Northa America 10485317
FAST frame GVS Northa America 10486001
FAST incubation chambers (2 Pad) GVS Northa America 10486242
384 well plates Whatman 7701-5101
plate sealers VWR 60941-062
foil plate covers VWR 60941-124
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Fetal calf serum Invitrogen 12483020
Cy3 goat anti-human IgG Jackson Immuno 109-165-096 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM Jackson Immuno 109-175-129 use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG Jackson Immuno 115-165-071 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM Jackson Immuno 115-175-075 use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner Molecular Devices Axon 4200A
Microarray software Molecular Devices Genepix 6.1
Clustering software eisenlab.org Cluster 3.0
Heatmap software eisenlab.org Treeview 1.60
Microarray statistical software Stanford University SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
  2. Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention. Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).
  3. Robinson, W. H., et al. Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses. Nature. medicine. 8, 295-301 (2002).
  4. Quintana, F. J., et al. Antigen microarrays identify unique serum autoantibody signatures in clinical and pathologic subtypes of multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18889-18894 (2008).
  5. Hueber, W., et al. Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 52, 2645-2655 (2005).
  6. Price, J. V., et al. Protein microarray analysis reveals BAFF-binding autoantibodies in systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 123, 5135-5145 (2013).
  7. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5116-5121 (2001).
  8. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14863-14868 (1998).
  9. Chruscinski, A., et al. Generation of Antigen Microarrays to Screen for Autoantibodies in Heart Failure and Heart Transplantation. PloS one. 11, e0151224 (2016).
  10. Price, J. V., et al. Characterization of influenza vaccine immunogenicity using influenza antigen microarrays. PloS one. 8, e64555 (2013).
  11. Singh, H., et al. Reactivity profiles of broadly neutralizing anti-HIV-1 antibodies are distinct from those of pathogenic autoantibodies. Aids. 25, 1247-1257 (2011).
  12. Porcheray, F., et al. Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses. Transplantation. 89, 1239-1246 (2010).
  13. Haddon, D. J., et al. Mapping epitopes of U1-70K autoantibodies at single-amino acid resolution. Autoimmunity. 48, 513-523 (2015).
  14. Schroeder, H. W. Jr, Cavacini, L. Structure and function of immunoglobulins. J Allergy Clin Immunol. 125, S41-S52 (2010).
IgG ve IgM Antikorlarının Eşzamanlı Algılama için İki Renkli Antijen Mikroarray&#39;ler Üretimi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).More

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter