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Chemistry

Electrophorèse Capillaire pour surveiller Peptide greffant sur chitosan Films en temps réel

Published: October 26, 2016 doi: 10.3791/54549

Abstract

capillaire libre solution électrophorèse (CE) sépare analytes, composés généralement pratiqués en solution par l'application d'un champ électrique. Par rapport à d'autres techniques de séparation analytiques, telles que la chromatographie, C'est pas cher, robuste et ne nécessite aucune préparation de l'échantillon (pour un certain nombre de matrices naturelles complexes ou des échantillons polymères) de manière efficace. C'est rapide et peut être utilisé pour suivre l'évolution des mélanges en temps réel (par exemple, la cinétique de réaction chimique), les signaux observés pour les composés séparés sont directement proportionnels à leur quantité dans la solution.

Ici, l'efficacité de la C'est mise en évidence pour la surveillance du greffage covalent de peptides sur des films de chitosane pour des applications biomédicales ultérieures. propriétés anti-microbiennes et biocompatibles de chitosan en font un matériau intéressant pour des applications biomédicales telles que les substrats de croissance cellulaire. greffage covalence les MFG peptidiques (arginine - glycine -l'acide aspartique - serine) sur la surface des films de chitosane vise à améliorer la fixation des cellules. Historiquement, la Chromatographie et l'analyse des acides aminés ont été utilisées pour fournir une mesure directe de la quantité de peptide greffé. Cependant, la séparation rapide et absence de préparation de l'échantillon fourni par CE permet la surveillance en temps réel aussi précise encore du procédé de greffage des peptides. C'est capable de séparer et quantifier les différents composants du mélange réactionnel: (non greffé), des peptides et des agents de couplage chimique. De cette manière, l'utilisation de CE conduit à des films améliorés pour les applications en aval.

Les films de chitosane ont été caractérisés par RMN du solide (résonance magnétique nucléaire) spectroscopie. Cette technique est plus chronophage et ne peut être appliqué en temps réel, mais on obtient une mesure directe du peptide et donc valide la technique de la CE.

Introduction

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Capillaire solution gratuite électrophorèse (CE) est une technique qui sépare les composés dans des solutions basées sur leur ratio 1,2 charge-friction. Ratio-Charge à la taille est souvent mentionné dans la littérature, mais cette simplification ne concerne pas les polyélectrolytes, y compris des polypeptides dans ce travail, et a également été montré ne pas être approprié pour les petites molécules organiques 3. CE diffère d'autres techniques de séparation en ce qu 'il n'a pas une phase stationnaire, seul un électrolyte de fond (généralement un tampon). Cela permet à la technique pour être robuste dans sa capacité à analyser une large gamme d'échantillons avec des matrices complexes 4 telles que les fibres végétales 5, fermentation brassins 6 greffage sur des polymères synthétiques 7, des échantillons de produits alimentaires 8 et peptides difficilement solubles 9 sans préparation de l' échantillon fastidieux et purification. Ceci est particulièrement significatif pour les polyélectrolytes complexes, qui ont des problèmes de dissolution (Such comme chitosane 10 et la gomme gellane 11) et donc exister sous forme agrégée ou précipité en solution et ont été analysés avec succès sans filtration de l' échantillon. En outre, l'analyse des sucres dans céréales de petit déjeuner impliqué injectant des échantillons avec des particules d'échantillons de céréales de petit déjeuner précipité dans l' eau 8. Cela va également à l'analyse des polyélectrolytes ou des copolymères ramifiés 12,13. Un travail considérable a également été accompli dans le développement de techniques CE spécifiquement pour l'analyse des protéines pour la protéomique 14, séparation chirale des peptides naturels ou synthétiques 15 et les séparations des micropuces de protéines et de peptides 16. Depuis la séparation et l' analyse ont lieu dans un capillaire, seulement de petits volumes d'échantillon et les solvants sont utilisés , ce qui permet CE d'avoir un coût de fonctionnement inférieur à d' autres techniques de séparation , y compris la chromatographie 5,6,17. Depuis la séparation par C'est rapide, il permet à l'monitoanneau de la cinétique de réaction. Cela a été démontré dans le cas du greffage de peptides sur des films de chitosane pour une meilleure adhérence des cellules 18.

Le chitosan est un polysaccharide dérivé du N -deacetylation de la chitine. Des films de chitosan peuvent être utilisées pour diverses applications biomédicales telles que 19 bioadhésifs et des substrats de croissance cellulaire 18,20, en raison de la biocompatibilité du 21 chitosane. La fixation des cellules aux protéines de la matrice extracellulaire spécifiques, telles que la fibronectine, la laminine et les collagènes, est directement liée à la survie des cellules 22. En particulier, différents types de cellules nécessitent souvent la fixation de différentes protéines de la matrice extracellulaire pour la survie et le bon fonctionnement. La fixation des cellules à des films de chitosane a été montré être amélioré par le greffage de 23 fibronectine; Cependant, la préparation, la purification et le greffage de ces grandes protéines ne sont pas économiquement viables. Alternativement une gamme de petits peptides VHAe sont révélés être capables d'imiter les propriétés des grandes protéines de la matrice extracellulaire. Par exemple, des peptides tels que les mimétiques de fibronectine RGD (arginine - glycine - acide aspartique) et MFG (arginine - glycine - acide aspartique - sérine) ont été utilisées pour faciliter et accroître l' attachement des cellules 24. Covalent greffage de MFG sur des films chitosane a permis d'améliorer la fixation des cellules pour les cellules connues pour attacher à la fibronectine in vivo 18. Substituer plus grandes protéines fibronectine aime avec de plus petits peptides qui ont la même fonctionnalité fournit une réduction significative des coûts.

Ici, peptide greffage chitosane a été réalisée comme précédemment publié 18. Comme cela est démontré plus haut, cette approche fournit un greffage simple et efficace en utilisant les agents de couplage EDC-HCl (1-éthyl-3- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide) et du NHS (N - hydroxysuccinimide) fonctionnaliser l'acide carboxylique de MFG être greffé sur lefilm de chitosane. Deux avantages de ce procédé de greffage est qu'il ne nécessite aucune modification du chitosane ou du peptide, et il est utilisé en milieu aqueux afin de maximiser la compatibilité avec les futures applications de culture cellulaire 18,20. Étant donné que les agents de couplage et le peptide peuvent être chargés, C'est un procédé approprié pour l'analyse de la cinétique de la réaction. Fait important, l'analyse de la cinétique de réaction par l'intermédiaire de la CE permet la surveillance en temps réel de la réaction de greffage et permet ainsi à la fois l'optimisation et la quantification du taux de greffage.

Bien qu'il soit pas systématiquement nécessaire, les résultats de l'analyse de la CE peuvent être validées hors ligne par une mesure directe du peptide greffage sur les films de chitosane en utilisant l' état solide RMN (résonance magnétique nucléaire) spectroscopie 25,26 pour démontrer le greffage covalent du peptide sur le film 18. Cependant, par rapport à la spectroscopie RMN à l'état solide, l'analyse en temps réel fourni parCE permet la quantification de la consommation de peptides en temps réel, et donc la capacité d'évaluer la cinétique de la réaction.

Le procédé mentionné ci-dessus est simple et permet l'analyse en temps réel du peptide greffage sur des films de chitosane avec une quantification indirecte de la mesure de la greffe. La méthode illustrée peut être étendue à l'évaluation quantitative en temps réel des réactions chimiques différentes tant que les réactifs ou les produits à analyser peuvent être chargés.

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Protocol

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1. Préparation de chitosane Films

  1. Peser 2 g d'acide acétique glacial, on complète à 100 ml avec de l'eau ultrapure.
  2. Peser 1,7 g de poudre de chitosane, ajouter 100 ml de 2% m / m acétique solution aqueuse d'acide. Agiter pendant 5 jours avec un barreau d'agitation et de plaque d'agitation magnétique à température ambiante soit recouverte d'une feuille d'aluminium ou dans l'obscurité.
  3. Centrifuger la dispersion de chitosane à 1076 xg à 23 ° C pendant 1 heure. Recueillir le surnageant avec une seringue et jeter le précipité.
  4. Pour chaque film, aliquote de 10 ml de la suspension de chitosane en une matière plastique plat de 9 cm de Petri à température ambiante. Laissez les films couverts à sécher pendant au moins 7 jours.
  5. Utilisation de ciseaux couper les films secs dans 1 x 1 cm carrés. Remarque: L'expérience peut être interrompue à ce stade.

2. Préparation de la solution saline tamponnée au phosphate (PBS)

  1. Peser 8 g de chlorure de sodium, 0,2 g de chlorure de potassium, 1,44 g disodique phosphate et 0,24 g de dihydrogénophosphate de potassium.
  2. Dissoudre ces produits pesés dans 800 ml d'eau ultra-pure et titrer la solution avec de l'acide chlorhydrique concentré jusqu'à pH 7,4.
    Remarque: L'expérience peut être interrompue à ce stade.

3. Préparation de mM borate de sodium tampon 75 à pH 9,2

  1. Peser 3,0915 g d'acide borique. Le dissoudre dans 75 ml d'eau ultrapure.
  2. Titrer la solution d'acide borique à un pH de 9,2 avec une solution d'hydroxyde de sodium à une concentration de 10 M ou plus.
    Attention: les solutions d'hydroxyde de sodium concentré sont corrosifs et doivent être manipulés avec des gants.
  3. Avec de l'eau ultra-pure pour obtenir 100 ml de solution. On obtient ainsi un tampon au borate de sodium 500 mM à pH 9,2.
  4. On dilue le tampon borate de sodium 500 mM avec de l'eau ultra-pure à un tampon de borate de sodium 75 mM. Remarque: L'expérience peut être interrompue à ce stade.

4. Préparation de chitosane Films pour la réaction de greffage

  1. Rinçage 10 films chitosan carrés (1 x 1 cm) dans 5 ml de PBS pendant 2 h dans une boîte de Petri à température ambiante.
  2. Pendant ce temps, préparer et valider l'instrument d'électrophorèse capillaire (étape 5).

5. Préparation et validation de l'électrophorèse capillaire Instrument

  1. Préparer un tube capillaire en silice fondue de 43,5 cm à nu d'un diamètre intérieur de 50 um (43,5 cm est la longueur totale, la longueur effective de la fenêtre de détection est typiquement 35 cm), en affaiblissant le revêtement extérieur polymère du capillaire à la longueur d'ensemble d'une ustensile contondant claquer ensuite le capillaire.
    1. Créer une fenêtre pour le tube capillaire à l'aide d'un briquet pour brûler le revêtement de polymère à 8,5 cm de l'entrée et après qu'il refroidit l'essuyer avec de l'éthanol. Graver le revêtement du capillaire à chaque extrémité pour quelques millimètres avec un briquet, et après avoir refroidi l'essuyer avec de l'éthanol.
    2. Lieu capillaire insila fenêtre de détection et de l'installer dans la cassette capillaire en le plaçant à des longueurs égales dans l'entrée et la sortie et l'enrouler autour des broches de la cassette. Ensuite, installez la cassette dans l'appareil d'électrophorèse capillaire.
  2. Définir les paramètres du procédé pour chaque séparation. Dans le menu du logiciel sélectionnez "méthode", puis "modifier la méthode entière". Réglez la température, le temps, la tension, et les flacons utilisés pour la séparation (par exemple 25 ° C, 10 min, 30 kV).
    1. Dans la section de pré-conditionnement, régler les bouffées consécutives: 10 min avec 1 M d'hydroxyde de sodium (dans l'eau), 5 min avec de l'hydroxyde de sodium 0,1 M (dans l'eau), 5 min avec de l'eau ultrapure et 5 min avec un tampon de borate de sodium 75 mM à un pH de 9,2 pour le premier procédé d'une série d'analyses.
    2. Pour les méthodes suivantes, définissez l'ensemble des bouffées consécutives dans la section de pré-conditionnement: 1 min avec 1 M d'hydroxyde de sodium (dans l'eau), 5 min avec un tampon de borate de sodium 75 mM à pH 9.2.
    3. Dans la section d'injection, de définir des paramètres pour une injection hydrodynamique avec une pression de 30 mbar pendant 10 secondes pour toutes les méthodes. Dans la section de séparation, fixer les conditions de séparation à 30 kV à 25 ° C pendant 9 min pour toutes les méthodes.
      REMARQUE: Consultez le mode d'emploi de l'instrument CE spécifique que la procédure pour faire fonctionner l'instrument de la CE peut varier entre les fabricants. Préparer la solution d'hydroxyde de sodium 1 M le jour.
  3. Injecter et séparer un étalon interne neutre (10 ul de 10% v / v de diméthylsulfoxyde (DMSO), dans de l'eau diluée dans 450 ul de tampon de borate de sodium 75 mM). Puis injecter et séparer de la même manière une norme oligoacrylate (dissous dans de l' eau ultrapure à 10 g ∙ L -1; voir la liste des matériaux) pour vérifier la validité du capillaire. Pause la séquence ici jusqu'à ce que la réaction de greffage est prêt à démarrer.

6. Intensification des MFG SUR DES Chitosan Film

  1. Peser le peptide (1 mg MFG)et les agents de couplage (3 mg d'EDC-HCl et de 2 mg de NHS).
  2. 2 heures après le début du trempage du film de chitosane dans du PBS, on dissout le peptide et les agents de couplage dans 5 ml de PBS.
    1. Prenez une aliquote de 50 pi de cette solution. Ajouter 2 ul de 10% v / v de DMSO dans l'eau comme étalon interne neutre à l'aliquote. Analyser l'aliquote avec CE (voir l'étape 7).
  3. Retirer les 5 ml de PBS utilisés pour rincer les films chitosane de la boîte de Pétri. Ajouter la solution 5 ml de peptides et agents de couplage à la boîte de Pétri contenant les films de chitosane.
  4. Couvrir la boîte de Pétri avec un film de paraffine et le placer sur un agitateur orbital à température ambiante. Prendre 50 aliquotes ul de milieu de réaction à des moments.
    REMARQUE: La durée totale de l' analyse par C'est de 15 min, donc une aliquote peut être pris toutes les 15 minutes (ou toutes les 30 minutes si les deux réactions sont surveillées en parallèle, etc.).
    1. Ajouter 2 ul de 10% v / v de DMSO dans l'eau comme étalon interne neutre à chaque alIQUOT.
      NOTE: Des aliquotes devraient être analysées avec CE dès qu'ils sont prises (voir l'étape 7).
  5. Après 4 heures d'agitation et l'enlèvement aliquote, retirer la boîte de Pétri de l'agitateur. Retirer le milieu réactionnel à partir de la boîte de Petri. Ajouter 5 ml de PBS pour rincer les films chitosane.
  6. Retirez le PBS de la boîte de Pétri, rincer le film chitosane avec de l'eau ultrapure et laissez-les sécher pendant la nuit. Retirer l'eau ultrapure et de stocker les films à -20 ° C dans une boîte de Pétri en plastique.

7. Suivi de Réaction de greffage utilisant CE

  1. Injecter et aliquotes séparées des milieux de réaction immédiatement après le retrait de la boîte de Pétri en utilisant les conditions d'analyse comme dans la section 5.2.
  2. A l'issue des séparations de rinçage capillaire avec de l'eau ultra pure pendant 10 minutes. Sécher à travers une chasse d'eau avec un flacon vide (air) pendant 10 min.
    NOTE: L'expérience peut être interrompue à ce stade.

8. Données Trea VICE pour CE

  1. Vérifiez la validité de chaque séparation, en vérifiant que les deux le courant lors de la séparation et le temps de migration du marqueur de la mobilité électroosmotique (DMSO dans ce cas) sont similaires à ceux observés pour la oligoacrylate séparation standard.
    NOTE: Jusqu'à 10-15% de variation est acceptable de la valeur actuelle attendue d'environ 50 uA et migration valeur temps de 1,3 min (valeurs de mobilité électrophorétique doivent être utilisés à la place des temps de migration si une répétabilité élevée est requise).
  2. Pour chaque séparation réussie, exporter les données brutes à partir du logiciel d'électrophorèse capillaire en sélectionnant un ensemble de données spécifiques, en cliquant à droite sur l'exportation et la sélection d'un signal approprié.
  3. Convertir les données brutes enregistrées par le CE (présentée en tant que l'absorbance UV en fonction du temps de migration). Convertir l'axe des X (migration temps t m) dans un μ de mobilité électrophorétique suivant l' équation 1:
    n 1 "src =" / files / ftp_upload / 54549 / 54549eq1.jpg "/> (1)
    L d est la longueur du détecteur, L t est la longueur totale du capillaire, V est la tension, et t eo est le temps de migration d'une espèce neutre (le standard interne DMSO dans ce cas) 27.
    Convertir l'axe Y des données brutes (absorbance en UA) pour une répartition des mobilités électrophorétiques W (μ) suivant l' équation 2: 28
    équation 2 (2)

9. Caractérisation supplémentaire du film __gVirt_NP_NN_NNPS<__ peptidiques greffé 18

  1. Insérez des films de chitosane peptidiques greffé, roulées autour d'eux, dans un 4 mm à l'état solide RMN rotor. Remplissez le rotor avec une solution saline tamponnée au phosphate à gonfler les films, et fermer le rotor. Attendez quelques heures.
  2. Analyser le film avec 13 </ sup> C spectroscopie RMN 18.

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Representative Results

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C'est bien adapté à la surveillance du greffage des peptides (par exemple, RGDS) sur des films de chitosane. Des agents de couplage appropriés comprennent l' EDC-HCl et du NHS qui activent le peptide se greffer sur le chitosan (figure 1). C'est capable de séparer les différentes molécules d'intérêt à partir du milieu réactionnel. Pour attribuer les pics sur l'électrophérogramme, MFG purs, EDC-HCl et NHS ont été dissous, injectés et séparés séparément. Après l'affectation de crête, le milieu réactionnel a été injecté et les différents réactifs ont été identifiés (figure 2). EDC-HCl mis à réagir dans un produit secondaire EDH-HCl (3 - (((éthylamino) (hydroxy) méthylène) amino) - N, N -dimethylpropan-1-amine). Diméthylsulfoxyde (DMSO) est utilisé comme étalon interne pour les séparations CE. Chitosan est présent dans l'expérience de greffage sous la forme de films insolubles et est ainsi injectée ou non observée dans CE. Notez que pour toutes les données brutes, til enregistre l' axe des temps de migration est converti en un axe de mobilité électrophorétique (équation 1) et l'axe d'absorbance UV en une répartition des mobilités électrophorétiques W (μ) (équation 2).

Étant donné que les aliquotes sont prélevés dans le milieu réactionnel, ils sont placés dans l'appareil de CE et injectés. L'étendue de la réaction est contrôlée par la diminution du pic associé à RGDS (figure 3). Il peut également être vu que le pic d'EDC-HCl diminue tandis que le pic augmente EDH-HCl au fil du temps. Il est important de noter qu'il n'y a pas de signal qui peut être attribué à un produit d'une réaction secondaire du peptide, par conséquent, il est supposé que les MFG étant éliminés du milieu réactionnel est en cours greffé sur le film de chitosan. Électrophérogrammes (figure superposées 3A) permettent la quantification de la consommation du peptide à partir du début jusqu'à la fin de la réaction. Il est à noter quebien que la cinétique a été initialement mesurée pendant 18 heures (figure 3B), 4 heures a été jugé suffisant pour la réaction de procéder à son extension maximale. Pour permettre la quantification d' un volume d'injection optimal est nécessaire pour assurer le signal-bruit est assez élevé tout en évitant la surcharge (figure 4A) et dans le cas de MFG, les injections devaient être terminés en temps réel pour prévenir polycondensation (figure 4B ).

La technique à base CE décrit ici pour analyser peptide greffage films chitosane est simple et rapide; cependant, il ne quantifie pas le procédé de greffage directement. spectroscopie RMN est utilisée pour démontrer le greffage; cette mesure ne peut pas être fait en temps réel (il faut généralement plusieurs heures) et doit être achevé post-réaction. La comparaison qualitative des films chitosane avant et après la greffe montre la greffe réussie des peptides thropouah l'apparition d'un signal à 70 ppm dans les films greffés correspondant à la liaison amide entre le chitosane et le peptide (figure 5).

Figure 1
Figure 1. Schéma de la réaction de greffage. Chimique schéma réactionnel montrant l'activation par EDC-HCl et NHS du groupe fonctionnel d'acide carboxylique de MFG suivie par son greffage sur la surface du film de chitosane. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .

Figure 2
Figure 2. Pic affectation des espèces présentes dans le milieu réactionnel. A. Séparation et affectation de pointe pour les solutions de partiellement hydrolysé EDC -HCl (Rose), MFG (rouge), NHS (bleu), ainsi que pour PBS (violet) et le milieu réactionnel (noir). B. Electrophérogrammes des milieux de réaction (noir) présenté en fonction du temps de migration (électrophorétique la mobilité doit être utilisé pour surmonter une mauvaise répétabilité dans les temps de migration). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Surveillance CE de MFG consommation. (A) Superposées pics peptidiques à temps de réaction de 30 min (ligne solide violet), 60 min (ligne pointillée magenta), 90 min (ligne bleue solide), 120 min (ligne pointillée verte), 150 min (ligne rouge solide) et (B) cinétique de greffage complété plus de 18 heures en répétitions (carrés et cercle).pload / 54549 / 54549fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. pics peptidiques superposée dans les milieux de réaction montrant des résultats optimaux (A) variable (hydrodynamique) des temps d'injection:. 5 sec (ligne bleue), 10 sec (ligne noire), 20 sec (ligne rouge) et 30 sec (ligne magenta) . Médias (B) de réaction à gauche dans un flacon de CE pendant une période prolongée de temps avant l' injection:. 30 min (ligne rouge) et 90 min (ligne bleue) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. 13C-état gonflé spectres RMN des films de chitosane. Comparaison des films avant (ligne noire) et après (ligne bleue) peptide greffage. Les signaux présents seulement dans le spectre enregistré après la greffe sont indiquées par des astérisques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

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La simplicité du protocole décrit ici, il est parfaitement adapté à une application à grande échelle. Cependant, une attention particulière doit être accordée à des étapes clés suivantes.

Préparation des instruments de la CE Proper

Il est important de séparer une norme connue immédiatement avant la séparation des échantillons inconnus (ainsi qu'à la fin d'une série de séparations) pour vérifier la validité du capillaire et de l'instrument sur la journée. Cette norme peut être un oligoacrylate 27 ou tout échantillon connu pour donner des pics multiples sur une large gamme de temps de migration. Surveillance du courant durant toutes les séparations et l'analyse de la migration d'un marqueur neutre dans chaque séparation sont des étapes clés pour identifier les problèmes. Une instabilité des variations de courant ou de grande taille (plus de 10-15%) de la valeur du plateau du courant peuvent être dues à des incohérences dans la mémoire tampon (pH ou de la concentration). Si elle est suivie d'une Migratio retardéen temps de la machine neutre, il peut également être due au capillaire ne pas être suffisamment propre. Les contrôles de routine du pH du tampon et un rinçage supplémentaire du capillaire pendant 10 min avec 1 M d'hydroxyde de sodium (fraîchement préparé) peuvent être utilisés pour prévenir / modifier ce problème. Pendant l'expérience, les étapes de nettoyage supplémentaires peuvent être utilisés pour assurer une séparation optimale, en général, y compris l'allongement ou un rinçage avec de l'hydroxyde de sodium aqueux concentré pour régénérer la surface de la silice fusible capillaire.

Traitement de données approprié

À la fin de l'expérience, le traitement approprié des données brutes est essentiel lorsque l'on compare les résultats. Cela implique la conversion de X et de l'axe Y obtenu à partir de l'instrument EC (étape 8.3). Les temps de migration déterminés CE ont une relativement faible répétabilité et nous vous recommandons d'utiliser des mobilités électrophorétiques place, conduisant à une meilleure répétabilité. L'importance de bien t les données de RÉATION a été montré précédemment avec la séparation et la caractérisation de chitosane 10, le poly (acide acrylique) 29, les copolymères séquences 13 et la détection des sucres dans les céréales pour petit déjeuner 8 à travers les écarts - types plus petits (RSD) observées entre les expériences pour les mobilités que pour des temps de migration . En outre, le CE a été montré pour être plus robuste que par HPLC pour la séparation des monosaccharides dans des matrices complexes 5. D'autres étapes peuvent inclure d'optimisation du réglage du volume d'injection (temps d'injection) pour permettre la séparation avec une bonne sensibilité sans provoquer une surcharge qui empêche la quantification. Un temps d'injection de 10 secondes est considérée comme optimale à 30 mbar (figure 4B): un temps d'injection plus court conduit à une sensibilité réduite pendant de plus longues durées d'injection entraînent une distorsion de forme de pic indicatif d' une surcharge capillaire.

Importance de la surveillance en temps réel

ove_content "> une force critique de cette méthode basée C'est la capacité à surveiller les réactions en temps réel. Ceci exige des conditions CE optimales pour la détection et la séparation du réactif (s) et / ou des produit (s). En outre, le analyse des réactions chimiques en temps opportun zéro doit être pris comme une référence de la réaction, ce qui consiste typiquement à la séparation des réactifs mesurées sur juste avant la réaction de départ cela peut être fait par exemple avant un réactif particulier est introduit, avant. la température est augmentée, ou avant l'irradiation UV est lancé pour déclencher la réaction.

Dans le cas du greffage des peptides RGDS (onto chitosane ou sur un autre substrat), le peptide est capable de réagir avec lui - même pour produire des oligomères linéaires ou ramifiés , par l' intermédiaire de structures 18 polycondensation. En effet, RGDS contient à la fois des groupes fonctionnels amine et acide carboxylique. Ces oligomères de peptides ne possèdent pas la même adresse ela mobilité lectrophoretic que les peptides RGDS initiaux et peuvent donc provoquer une quantification inexacte, par exemple la co-migration avec d'autres espèces. Il est donc important de veiller à ce que des parties aliquotes du milieu réactionnel , on injecte et on les sépare en quelques minutes après avoir été prélevé du milieu réactionnel (figure 4B).

Une bonne préparation des films de chitosane

En traitant spécifiquement des films de chitosane, il y a un certain nombre de mesures pour se conformer. Au cours de la production des films de chitosane, les films doivent être laissés à sécher pendant au moins 7 jours (de préférence plus). Si ce n'est pas terminée, lorsque les films sont placés dans un tampon PBS pour rincer, ils vont se dissoudre plutôt que de former un film gonflé qui empêche alors les prochaines étapes. En outre, il est important de neutraliser le film avant la réaction de greffage pour éliminer l'acide acétique restant qui peuvent lixivier du film et de concurrencerle peptide pour la réaction de greffage 18. Cela peut être fait par trempage dans de l'hydroxyde de sodium aqueux dilué ou dans du PBS. Le pH du tampon utilisé comme solvant pour la réaction de greffage est également critique: si elle est trop acide, les films seront partiellement ou complètement dissoudre. Au cours de la réaction de greffage, il est important que le film est en mesure d'avoir un contact maximum avec la solution réactionnelle. Par conséquent, la boîte de Petri contenant les films et le mélange réactionnel est placé sur un agitateur. Il est également impératif d'éviter l'évaporation du mélange réactionnel pour éviter des variations non contrôlées de concentration conduisant à des quantifications inexactes; l'utilisation du film de paraffine pour couvrir la boîte de Pétri a été efficace pour l'empêcher.

La principale limitation de la technique de la C'est que, individuellement, il est pas en mesure de confirmer le processus de greffage. Dans le cadre du procédé de greffage chimique mentionné ci-dessus, la quantification du greffage du peptide est indirect. Cepeuvent être surmontés par l'utilisation d'une technique complémentaire telles que la spectroscopie RMN à l'état solide tel que mentionné précédemment. Autres limites de la technique de la CE comprennent qu'il exige le composé d'intérêt à charger. Par conséquent, les espèces neutres migrent en même temps. Dans certains cas, cela peut être surmonté si le composé de complexes d'intérêt avec un borate. Enfin, si le composé d'intérêt ne contient pas la détection de chromophores autres que les UV telles que la conductivité peut avoir besoin d'être utilisé. Cela nécessite l'achat supplémentaire d'un détecteur de conductivité qui nécessite une optimisation.

Avantages de l' analyse de peptide greffage via CE vs d' autres méthodes d' analyse

Le procédé CE présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes indirectes alternatives, y compris une Chromatographie à haute performance en liquide (HPLC), l'analyse des acides aminés (AAA) et la méthode directe de la spectroscopie RMN. Par rapport à AAA, il est un haut-débit, méthode robuste which permet d'analyser des échantillons complexes de manière efficace sans préparation d'échantillon fastidieux. Ceci est avantageux en particulier dans l'analyse des réactions chimiques en temps réel. HPLC a été utilisé précédemment pour peptide greffage analyse 30, mais il a été jugé que semi-quantitative. CE a un coût de fonctionnement plus faible que HPLC et ne nécessite pas la filtration de l' échantillon avant l'analyse, ce qui minimise le risque de perte de l' échantillon 5. Bien que 13 spectroscopie RMN C est capable de mesurer directement le produit d'intérêt, il est une technique coûteuse et est incapable de mesurer en temps réel.

Le protocole descripted ici fournit une méthode rapide, efficace, peu coûteux et fiable pour l'optimisation de peptide de greffage à un film de chitosane. Cette nouvelle approche permet donc des avantages importants pour adapter les propriétés de fixation cellulaire des films de chitosane par rapport aux méthodes traditionnelles telles que la Chromatographie et AAA. Cette méthode CE peut être utilisé pour surveiller un nombred'autres réactions chimiques en temps réel, généralement des réactions se produisant sur le délai de plusieurs heures, pour lesquelles les réactifs / produits d'intérêt peuvent être facturés. Dans ce cas, il est toutefois important de noter que le procédé CE doit être optimisé avant l'analyse d'une réaction chimique différente pour permettre une analyse efficace. Ceci comprend l'analyse des réactifs et des produits purs avant la réaction afin de leur permettre d'identifier et de faire en sorte qu'ils puissent être détectés et séparés, ainsi que pour garantir qu'aucun contaminant peut empêcher la quantification. La séparation peut être améliorée et le temps total d'analyse modifiée en faisant varier la composition du tampon et de la tension longueur du capillaire, et éventuellement à l'aide d'un capillaire avec des parois revêtues. La détection peut être améliorée en modifiant les conditions dans lesquelles l'échantillon est injecté à favoriser les réactifs chargés, soit par l'injection d'une plus grande quantité de l'échantillon dans le capillaire. En outre, d'autres détecteurs en dehors de détection UV peuvent be employée, y compris la fluorescence, des détecteurs de conductivité sans contact ou le CE peut être couplé à un spectromètre de masse. La capacité de surveiller les réactions en temps réel, permet à la réaction de greffage doit être effectuée directement dans un flacon CE si le substrat est en solution et est apte à être analysé par CE. Cela peut se faire directement à l' intérieur de l'instrument de la CE, que nous avons récemment réalisé pour le greffage de aminoantipyrine de poly (acide acrylique) 7 En outre, l'approche ne se limite pas à des réactions de greffage , mais peut être étendu pour contrôler diverses autres réactions chimiques. En outre, la surveillance des réactions permet une optimisation de la réaction et peut également être utilisée pour valider le produit de la réaction. Tant que le composé d'intérêt peut être dissous et accusé, la méthode de la CE permet rapide, pas cher et robuste de séparation, la détection et la quantification.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Water Millipore All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality
Chitosan powder (medium molecular weight) Sigma-Aldrich 448877 lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides
Acetic acid - Unilab Ajax Finechem 2-2.5L GL laboratory reagent
Dimethylsulfoxide Sigma-Aldrich D4540 laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested
Sodium hydroxide  Sigma-Aldrich 221465  laboratory reagent, corrosive 
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide  Sigma-Aldrich D80002 Irritant to skin 
N-hydroxysuccinimide  Sigma-Aldrich 130672 Irritant to skin
Sodium chloride  Ajax Finechem 466-500G laboratory reagent
Potassium chloride - Univar Ajax Finechem 384-500G analytical reagent, slight skin irritant
Disodium hydrogen phosphate - Unilab Ajax Finechem 1234-500G laboratory reagent, slight skin irritant
Potassium dihydrogen phosphate - Univar Ajax Finechem 4745-500G analytical reagent, slight skin irritant
Oligoacrylate standard custom made See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46
Boric acid  BDH AnalR, Merck Pty Ltd 10058 Corrosive
Hydrochloric acid - Unilab Ajax Finechem A1367-2.5L laboratory reagent, corrosivie
Fused silica tubing Polymicro (Molex) TSP050375 Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter 
Agilent 7100 CE Agilent Technologies G7100CE Capillary electrophoresis instrument
Orbital shaker  IKA KS260
Electronic balance Mettler Toledo MS204S
Milli-Q Synthesis  Millipore ZMQS5VF01 Ultrapure water filtration system
Parafilm  Labtek PM966 Parrafin wax

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Electrophorèse Capillaire pour surveiller Peptide greffant sur chitosan Films en temps réel
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Thevarajah, J. J., O'Connor, M. D., Castignolles, P., Gaborieau, M. Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time. J. Vis. Exp. (116), e54549, doi:10.3791/54549 (2016).More

Thevarajah, J. J., O'Connor, M. D., Castignolles, P., Gaborieau, M. Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time. J. Vis. Exp. (116), e54549, doi:10.3791/54549 (2016).

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