Abstract
Free-Lösung Kapillarelektrophorese (CE) trennt Analyten, im allgemeinen geladenen Verbindungen in Lösung durch die Anwendung eines elektrischen Feldes. Im Vergleich zu anderen analytischen Trenntechniken, wie Chromatographie, ist CE billig, robust und erfordert effektiv keine Probenvorbereitung (für eine Reihe von komplexen natürlichen Matrices oder polymere Proben). CE ist schnell und kann verwendet werden , die Entwicklung der Mischungen in Echtzeit zu verfolgen (beispielsweise chemische Reaktionskinetik), da die Signale für die abgetrennten Verbindungen beobachtet direkt proportional zu ihrer Menge in Lösung.
Dabei wird die Effizienz der CE gezeigt, zur Überwachung der kovalente Pfropfung von Peptiden auf Chitosan-Filme für nachfolgende biomedizinische Anwendungen. Chitosan ist antimikrobiell und biokompatiblen Eigenschaften machen es zu einem attraktiven Material für biomedizinische Anwendungen wie Zellwachstumssubstrate. Kovalent Pfropfen der Peptid RGDS (Arginin - Glycin -Asparaginsäure - Serin) auf die Oberfläche des Chitosanfilme zielt auf die Zellanheftung zu verbessern. Historisch haben Chromatographie und Aminosäureanalyse wurde eine direkte Messung der Menge des aufgepfropften Peptid bereitzustellen, verwendet. Jedoch ermöglicht die schnelle Trennung und Abwesenheit von Probenvorbereitung durch CE vorgesehen gleichermaßen genaue noch eine Echtzeitüberwachung des Peptids Pfropfverfahren. CE ist in der Lage, die verschiedenen Komponenten der Reaktionsmischung abzutrennen und zu quantifizieren: Die (nicht gepfropften) -Peptid und die chemischen Kupplungsmittel. Auf diese Weise führt die Verwendung von CE in verbesserte Folien für Downstream-Anwendungen.
Die Chitosan-Filme wurden charakterisiert durch Festkörper-NMR (kernmagnetische Resonanz) -Spektroskopie. Diese Technik ist zeitraubend und kann nicht in Echtzeit angewendet werden, aber eine direkte Messung des Peptids ergibt und somit validiert die CE-Technik.
Introduction
Freie Lösung Kapillarelektrophorese (CE) ist eine Technik , die Verbindungen in Lösungen auf der Basis ihrer Ladung-zu-Reibungsverhältnis 1,2 trennt. Ladungs-Größenverhältnis wird häufig in der Literatur erwähnt, aber diese Vereinfachung gilt nicht für Polyelektrolyte, einschließlich Polypeptiden in dieser Arbeit, und wurde auch für kleine organische Moleküle 3 nicht als geeignet gezeigt. CE unterscheidet sich von anderen Trenntechniken in, daß es nicht eine stationäre Phase hat, nur eine Hintergrundelektrolyt (normalerweise ein Puffer). Dies ermöglicht die Technik in seiner Fähigkeit , robust zu sein , eine große Auswahl an Proben mit komplexen Matrices 4 wie Pflanzenfasern 5, Fermentation Sude 6 Pfropfen auf synthetischen Polymeren 7, Lebensmittelproben 8 und kaum lösliche Peptide 9 ohne langwierige Probenvorbereitung zur Analyse und Reinigung. Dies ist besonders bedeutsam für komplexe Polyelektrolyte, die Auflösung Probleme haben (such als Chitosan 10 und Gellangummi 11) und existieren daher als aggregierte oder in Lösung ausgefällt und haben ohne Probenfiltration erfolgreich analysiert. Ferner ging es um die Analyse von Zuckern in Frühstückszerealien Proben mit Partikeln von Frühstück Getreideproben in Wasser 8 gefällt injiziert wird . Diese erstreckt sich auch auf die Analyse von verzweigter Polyelektrolyte oder Copolymere 12,13. Umfangreiche Arbeit wurde auch in der Entwicklung von CE - Techniken speziell für die Analyse von Proteinen für die Proteomik 14, chirale Trennung von natürlichen oder synthetischen Peptide 15 und Mikrochip - Trennungen von Proteinen und Peptiden 16 abgeschlossen ist. Da die Trennung und Analyse in einer Kapillare nehmen, sind nur kleine Volumina von Probe und Lösungsmittel verwendet , das CE ermöglicht eine niedrigere Betriebskosten als andere Trennverfahren einschließlich Chromatographie 5,6,17 haben. Da die Trennung durch CE schnell ist, erlaubt es die monitoRing der Reaktionskinetik. Dies wurde in dem Fall der Pfropfung von Peptiden auf Chitosan - Filme für verbesserte Zelladhäsion 18 gezeigt.
Chitosan ist ein Polysaccharid aus der N -deacetylation von Chitin abgeleitet. Chitosan - Filme können solche für verschiedene biomedizinische Anwendungen verwendet werden , wie Bioadhäsive 19 und Zellwachstumssubstrate 18,20 aufgrund Chitosan der Biokompatibilität 21. Zellbindung an spezifische extrazelluläre Matrixproteine wie Fibronektin, Kollagenen und Laminin, direkt 22 , um das Überleben der Zellen verbunden. Bemerkenswert ist, erfordern unterschiedliche Zelltypen oft Bindung an verschiedene extrazelluläre Matrixproteine für das Überleben und die einwandfreie Funktion. Zellanheftung an Chitosan - Filme wurde durch das Pfropfen von Fibronektin 23 werden verstärkt dargestellt; jedoch Herstellung, Reinigung und Veredelung von solchen großen Proteinen ist nicht wirtschaftlich. Alternativ kann ein Bereich von kleinen Peptiden have wurde in der Lage gezeigt, die Eigenschaften der großen extrazellulären Matrixproteinen zu imitieren. Zum Beispiel Peptide wie die Fibronektin - Mimetika RGD (Arginin - Glycin - Asparaginsäure) und RGDS (Arginin - Glycin - Asparaginsäure - Serin) wurden die Zellbindung 24 verwendet zu erleichtern und zu erhöhen. Kovalentes Pfropfen von RGDS auf Chitosan - Filme zu einer verbesserten Zellanhaftung für Zellen in vivo 18 bis Fibronektin zu befestigen bekannt. Substituieren größere Proteine gefällt Fibronektin mit kleineren Peptiden, die die gleiche Funktionalität stellt eine erhebliche Kostenreduzierung aufweisen.
Hier Peptid an Chitosan Pfropfung wurde durchgeführt , wie zuvor 18 veröffentlicht. Wie zuvor gezeigt, bietet dieser Ansatz eine einfache und effiziente Pfropfen durch die Kupplungsmittel EDC-HCl (1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid) und NHS (N - Hydroxysuccinimid) unter Verwendung der Carbonsäure der RGDS zu funktionalisieren zu sein auf das gepfropfteChitosan-Film. Zwei Vorteile dieses Pfropfverfahren sind , dass es keine Änderung des Chitosans benötigt oder des Peptids, und es wird in wäßrigem Medium durchgeführt zu maximieren Kompatibilität mit zukünftigen Zellkulturanwendungen 18,20. Als Kupplungsmittel und das Peptid aufladbar ist, ist CE ein geeignetes Verfahren für die Analyse der Reaktionskinetik. Wichtig ermöglicht, die Analyse der Reaktionskinetik mittels CE Echtzeit-Überwachung der Pfropfreaktion, und ermöglicht damit sowohl der Optimierung und der Pfropfgrad zu quantifizieren.
Während es nicht routinemäßig erforderlich ist, können die Ergebnisse der CE - Analyse durch eine direkte Messung des Peptids off-line überprüft werden Pfropfung auf die Chitosan - Filme unter Verwendung von Festkörper-NMR (kernmagnetische Resonanz) -Spektroskopie 25,26 , um die kovalente Pfropfung demonstrieren des Peptids auf den Film 18. Doch im Vergleich mit Festkörper-NMR-Spektroskopie, die Echtzeit-Analyse zur Verfügung gestellt vonCE ermöglicht die Quantifizierung des Peptids Verbrauch in Echtzeit und damit die Fähigkeit, die Kinetik der Reaktion zu bewerten.
Das oben erwähnte Verfahren ist einfach und ermöglicht die Echtzeit-Analyse von Peptid auf Chitosan-Filme mit indirekter Quantifizierung des Ausmaßes der Pfropfung Pfropfung. Die aufgezeigte Methode kann zur Echtzeit-quantitative Bewertung verschiedener chemischer Reaktionen verlängert werden, solange die Reaktanden oder die Produkte analysiert werden können berechnet.
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Protocol
1. Herstellung von Chitosanfilme
- Abwiegen 2 g Eisessig, komplett auf 100 ml mit Reinstwasser.
- Man wiegt 1,7 g Chitosan-Pulver, 100 ml der 2% m / m Essigsäure wässriger Lösung. Rühren Sie für 5 Tage mit Rührstab und magnetische Rührplatte bei Raumtemperatur entweder mit Aluminiumfolie abgedeckt oder in der Dunkelheit.
- Zentrifugieren Sie die Chitosan-Dispersion bei 1076 × g bei 23 ° C für 1 Stunde. Die überstehende Flüssigkeit mit einer Spritze und entsorgen Sie den Niederschlag.
- Für jeden Film, Aliquot von 10 ml der Chitosan-Suspension in eine 9 cm Kunststoff-Petrischale bei Raumtemperatur. Lassen Sie die verdeckten Filme für mindestens 7 Tage trocknen.
- Mit einer Schere schneiden Sie die trockenen Filme in 1 x 1 cm große Quadrate. Hinweis: Das Experiment kann in diesem Stadium angehalten werden.
2. Herstellung von Phosphat-gepufferter Saline (PBS)
- Man wiegt 8 g Natriumchlorid, 0,2 g Kaliumchlorid, 1,44 g Dinatriumhydrogenphosphat phosphat und 0,24 g Kaliumdihydrogenphosphat.
- Man löst diese abgewogen Chemikalien in 800 ml Reinstwasser und titriert die Lösung mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,4.
Hinweis: Das Experiment kann in diesem Stadium angehalten werden.
3. Herstellung von 75 mM Natriumboratpuffer bei pH 9,2
- Man wiege 3,0915 g Borsäure. Man löst es in 75 ml Reinstwasser.
- Titrieren die Borsäure Lösung auf einen pH von 9,2 mit einer Natriumhydroxid-Lösung bei einer Konzentration von 10 M oder höher.
Achtung: Konzentrierte Natronlauge sind ätzend und sollte mit Handschuhen angefasst werden. - Komplett mit Reinstwasser zu erhalten 100 ml Lösung. Dies ergibt eine 500 mM Natriumboratpuffer bei pH 9,2.
- Verdünne das 500 mM Natriumboratpuffer mit Reinstwasser bis 75 mM Natriumboratpuffer. Hinweis: Das Experiment kann in diesem Stadium angehalten werden.
4. Herstellung von Chitosan Films für die Pfropfreaktion
- Spülen 10 Quadrat Chitosanfilme (1 x 1 cm) in 5 ml PBS für 2 Stunden in einer Petrischale bei Raumtemperatur.
- Während dieser Zeit vorzubereiten und die Kapillar-Elektrophorese-Instrument (Schritt 5) zu validieren.
5. Herstellung und Validierung der Kapillarelektrophorese Instrument
- Vorbereiten eines 43,5 cm bare Quarzglaskapillare mit einem Innendurchmesser von 50 & mgr; m (43,5 cm beträgt die Gesamtlänge, die wirksame Länge zu dem Detektionsfenster wird in der Regel 35 cm), indem das Polymer äußeren Beschichtung der Kapillare Schwächung bei der eingestellten Länge mit einem stumpfe utensil schnappen dann die Kapillare.
- Erstellen eines Fenster für die Kapillare durch ein Feuerzeug mit Hilfe der Polymerbeschichtung bei 8,5 cm von dem Einlaß zu verbrennen und nach Abwischen kühlt es sauber mit Ethanol. Brennen Sie die Beschichtung der Kapillare an jedem Ende für ein paar Millimeter mit einem Feuerzeug, und nachdem sie abkühlt sauber wischen mit Ethanol.
- Platz Kapillare inside Detektionsfenster und installieren in der Kapillarkassette indem sie bei gleichen Längen in dem Einlass und Auslass platziert und um die Spindeln der Wickelkassette. Installieren Sie dann die Kassette in der Kapillar-Elektrophorese Instrument.
- Die Parameter des Verfahrens für jede Trennung. Im Software-Menü wählen Sie "Methode", dann "das gesamte Verfahren zu bearbeiten". Stellen Sie die Temperatur, Zeit, Spannung und Phiolen für die Trennung verwendet wird (beispielsweise 25 ° C, 10 min, 30 kV).
- Im Abschnitt Präkonditionierung, stellen die aufeinanderfolgenden Spülungen: 10 min mit 1 M Natriumhydroxid (in Wasser), 5 min mit 0,1 M Natriumhydroxid (in Wasser), 5 min mit Reinstwasser und 5 min mit 75 mM Natriumboratpuffer bei pH 9,2 für die erste Methode einer Reihe von Analysen.
- Für die folgenden Methoden, stellen Sie die Menge, die die aufeinanderfolgenden Spülungen in der Pre-Konditionierstrecke: 1 min mit 1 M Natriumhydroxid (in Wasser), 5 min mit 75 mM Natriumboratpuffer bei pH 9.2.
- Im Injektionsabschnitt, eingestellte Parameter für einen hydrodynamischen Injektion mit 30 mbar Druck für 10 Sekunden für alle Methoden. In dem Trennabschnitt, stellen die Trennungsbedingungen zu 30 kV bei 25 ° C für 9 min für alle Methoden.
HINWEIS: Bedienungsanleitung der spezifischen CE-Gerät als Verfahren finden Sie in der CE-Gerät für den Betrieb zwischen Herstellern variieren. Bereiten Sie die 1 M Natriumhydroxid-Lösung am Tag.
- Einschleusen und einen neutralen interner Standard trennen (10 & mgr; l von 10% v / v Dimethylsulfoxid (DMSO), verdünnt in Wasser in 450 ul 75 mM Natriumboratpuffer). Dann spritzen und auf die gleiche Weise ein Oligoacrylat Standard trennen (gelöst in Reinstwasser bei 10 g ∙ L -1; siehe Liste der Materialien) , um die Gültigkeit der Kapillare zu überprüfen. Unterbrechen Sie die hier Sequenz, bis die Pfropfreaktion ist startbereit.
6. Verpflanzen von RGDS auf Chitosanfilms
- Wiegen Sie das Peptid (1 mg RGDS)und die Kopplungsmittel (3 mg EDC-HCl und 2 mg NHS).
- 2 h nach dem Start der Chitosanfilm Einweichen in PBS, lösen sich das Peptid und das Kupplungsmittel in 5 ml PBS.
- Nehmen Sie ein 50-ul-Aliquot dieser Lösung. Hinzufügen 2 & mgr; l von 10% v / v DMSO in Wasser als interner Standard neutral zum Aliquot. Analysieren Sie den aliquoten mit CE (siehe Schritt 7).
- Entfernen die 5 ml PBS verwendet, die Chitosan-Filme aus der Petrischale zu spülen. Fügen Sie die 5 ml-Lösung von Peptid und Kupplungsmitteln zu der Petrischale, die Chitosan-Filme enthält.
- Decken Sie die Petrischale mit Paraffinfilm und legen Sie es auf einem Schüttler bei Raumtemperatur. Bis zu 50 & mgr; l-Aliquots von Reaktionsmedien zu festgelegten Zeiten.
HINWEIS: Die Gesamtanalysezeit mit CE beträgt 15 min, wodurch ein Aliquot kann alle 15 min genommen werden (oder alle 30 Minuten , wenn zwei Reaktionen parallel überwacht werden, etc.).- Hinzufügen 2 & mgr; l von 10% v / v DMSO in Wasser als interner Standard neutral zu jedem aliquot.
HINWEIS: Aliquots sollten so bald mit CE analysiert werden, da sie (siehe Schritt 7) getroffen werden.
- Hinzufügen 2 & mgr; l von 10% v / v DMSO in Wasser als interner Standard neutral zu jedem aliquot.
- Nach 4 Stunden Schütteln und Aliquotentfernung, entfernen Sie die Petrischale aus dem Schüttler. Entfernen des Reaktionsmediums aus der Petrischale. 5 ml PBS, die Chitosan-Filme zu spülen.
- Entfernen Sie die PBS aus der Petrischale, spülen Sie die Chitosan-Film mit Reinstwasser und lassen sie über Nacht trocknen. Entfernen Sie die Reinstwasser und speichern die Filme bei 20 ° C in einer Kunststoff-Petrischale.
7. Überwachung von Pfropfreaktion CE Verwendung
- Injizieren und getrennte Aliquots von Reaktionsmedien unmittelbar nach der Entnahme aus der Petrischale mit den Analysebedingungen wie in Abschnitt 5.2.
- Nach Abschluss der Trennungen Spülen der Kapillare mit ultrareinem Wasser für 10 min. Trocknen Sie es durch einen Flush mit einem leeren Fläschchen (Luft) für 10 min.
HINWEIS: Das Experiment kann in diesem Stadium angehalten werden.
8. Daten Trea tment für CE
- Überprüfen Sie die Gültigkeit jeder Trennung, durch die Überprüfung sowohl der Strom während der Trennung und die Migrationszeit der elektroosmotischen Mobilität Marker (DMSO in diesem Fall) sind ähnlich denen, die für die Oligoacrylat Standardtrennung beobachtet.
HINWEIS: Bis zu 10-15% Abweichung von dem erwarteten Stromwert von etwa 50 & mgr; A und Migrationszeit-Wert von 1,3 min (elektrophoretische Mobilität Werte anstelle von Migrationszeiten verwendet werden sollte, wenn eine höhere Wiederholgenauigkeit erforderlich ist) akzeptabel ist. - Für jede erfolgreiche Trennung Exportieren Sie die Rohdaten von der Kapillar-Elektrophorese-Software durch einen bestimmten Datensatz der Auswahl Recht auf Export klicken und ein entsprechendes Signal auswählen.
- Wandeln die Rohdaten von der CE aufgezeichnet (dargestellt als UV-Absorption als Funktion der Migrationszeit). Wandeln die X-Achse (Wanderungszeit t m) in eine elektrophoretische Mobilität μ folgenden Gleichung 1:
n 1 "src =" / files / ftp_upload / 54549 / 54549eq1.jpg "/> (1)
wobei L d die Länge zum Detektor ist, L t die Gesamtlänge der Kapillare, V die Spannung ist, und t eo ist die Migrationszeit eines neutralen Spezies (der interne Standard DMSO in diesem Fall) 27.
Wandeln die Y-Achse der Rohdaten (Extinktion in au) zu einer Verteilung der elektrophoretischen Mobilitäten W (μ) nach der Gleichung 2: 28
(2)
(2) 9. Weitere Charakterisierung von Peptid-gepfropft Films 18
- Legen Peptid-gepfropft Chitosanfilme, rollte um sich in einem 4 mm Festkörper-NMR-Rotor. Füllen den Rotor mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die Filme zu quellen, und den Rotor zu schließen. Warten Sie ein paar Stunden.
- Analysieren Sie den Film mit 13 </ sup> C - NMR - Spektroskopie 18.
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Representative Results
CE ist gut geeignet , um die Transplantation von Peptiden zur Überwachung (zB RGDS) auf Chitosan - Filme. Geeignete Kupplungsmittel schließen EDC-HCl und NHS , die das Peptid zu aktivieren , auf dem Chitosan (Abbildung 1) gepfropft werden. CE ist in der Lage, die verschiedenen Moleküle von Interesse aus dem Reaktionsmedium abzutrennen. Um die Peaks auf der Elektropherogramm, reine RGDS, EDC-HCl und NHS vergeben wurden aufgelöst, injiziert und separat getrennt. Nach der Zuordnung der Peaks wurde das Reaktionsmedium eingespritzt und die verschiedenen Reaktanten wurden identifiziert (Abbildung 2). EDC-HCl , umgesetzt in ein Nebenprodukt EDH-HCl (3 - (((ethylamino) (Hydroxy) methylen) amino) - N, N -dimethylpropan-1-amin). Dimethylsulfoxid (DMSO) wird als interner Standard für die CE-Trennungen verwendet. Chitosan ist in dem Pfropfen Experiment in Form von unlöslichen Filmen und ist somit nicht injiziert oder in CE beobachtet. Beachten Sie, dass für alle Rohdaten, ter aufgezeichnet Migrationszeitachse in einem elektrophoretischen Mobilitätsachse (Gleichung 1) und die UV - Extinktion Achse in eine Verteilung der elektrophoretischen Mobilitäten W umgewandelt wird (μ) (Gleichung 2).
Da die Aliquots aus dem Reaktionsmedium entnommen werden, werden sie in die CE-Instrument aufsetzbar und injiziert. Das Ausmaß der Reaktion wird durch die Verringerung der mit RGDS (Abbildung 3) zugeordneten Spitzen überwacht. Es kann auch gesehen werden, daß die EDC-HCl peak abnimmt, während die EDH-HCl peak der Zeit zunimmt. Es ist wichtig zu beachten, dass kein Signal vorhanden ist, die zu einem Produkt aus einer Nebenreaktion des Peptids zugeordnet werden kann, so wird angenommen, dass die RGDS aus dem Reaktionsmedium entfernt wird, auf die Chitosan-Film gepfropft wird. Überlagerte Elektropherogramme (3A) erlauben die Quantifizierung des Peptids Verbrauch vom Beginn bis zum Ende der Reaktion. Es ist zu beachten, dassobwohl die Kinetik zunächst für 18 Stunden (3B), wurde 4 h wurde gemessen , als ausreichend für die Reaktion auf seine maximale Ausdehnung fortzufahren. Zu ermöglichen Quantifizierungs eine optimale Einspritzmenge erforderlich ist , um das Signal-Rausch - sicherzustellen Verhältnis hoch genug ist , während verhindert eine Überlastung (4A) und im Falle von RGDS wurden Injektionen erforderlich in Echtzeit abgeschlossen sein zu verhindern , Polykondensation (4B ).
Die CE-basierte Technik hier beschriebene Peptid zu analysieren, um Chitosanfilme Pfropfen ist schnell und einfach; Allerdings ist es nicht das Pfropfverfahren direkt zu quantifizieren. NMR-Spektroskopie wird verwendet, um das Pfropfen zu demonstrieren; Diese Messung kann nicht in Echtzeit durchgeführt werden (es dauert typischerweise mehrere Stunden) und muss nach der Reaktion zu vervollständigen. Der qualitative Vergleich der Chitosan-Filme vor und nach der Transplantation zeigt das erfolgreiche Pfropfung der Peptide through das Auftreten eines Signals bei 70 ppm in den gepfropften Filme auf die Amidbindung zwischen dem Chitosan und dem Peptid (Figur 5) entspricht.
Abbildung 1 : Schema der Pfropfreaktion. Chemische Reaktionsschema die Aktivierung durch EDC-HCl und NHS der funktionellen Carbonsäuregruppe von RGDS , gefolgt von der Pfropfen auf die Filmoberfläche des Chitosan zeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen .
Abbildung 2. Peak - Zuordnung der vorliegenden Spezies im Reaktionsmedium. A. Trennung und Zuordnung der Peaks für Lösungen von teilweise hydrolysierten EDC HCl (pink), RGDS (rot), NHS (blau), sowie für PBS (lila) und das Reaktionsmedium (schwarz). B. Elektropherogramme von Reaktionsmedien (schwarz) als Funktion der Migrationszeit präsentiert (elektrophoretische Mobilität verwendet werden sollte , schlechte Reproduzierbarkeit in Migrationszeiten zu überwinden). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. CE Überwachung von RGDS Verbrauch. (A) Überlagert Peptidpeaks bei Reaktionszeit 30 min (lila durchgezogene Linie), 60 min (magenta gestrichelte Linie), 90 min (blau durchgezogene Linie), 120 min (grün gestrichelte Linie), 150 min (rote Linie) und (B) Kinetik des Pfropfens über 18 Stunden in Replikaten (Quadrat und Kreis) abgeschlossen.pload / 54549 / 54549fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Überlagerte Peptidpeaks in Reaktionsmedien zeigt suboptimale Ergebnisse (A) Unterschiedlich (hydrodynamischen) Injektionszeiten: 5 Sek . (Blaue Linie), 10 sec (schwarze Linie), 20 sec (rote Linie) und 30 Sekunden (magentafarbene Linie) . (B) Reaktion links Medien in einem CE - Fläschchen für einen längeren Zeitraum vor der Injektion: 30 Min . (Rote Linie) und 90 min (blaue Linie) Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. 13C geschwollene-NMR - Spektren von Chitosan - Filmen. Ein Vergleich der Filme vor (schwarze Linie) und nach (blaue Linie) Peptid Transplantation. Die Signale , die nur in dem Spektrum aufgenommen , nachdem durch Sternchen angegeben Pfropfen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Einfachheit des hier beschriebene Protokoll macht es ideal für eine breite Anwendung geeignet. Allerdings muss besonderes Augenmerk auf die folgenden wesentlichen Schritte zu zahlen.
Proper CE Instrumentenaufbereitung
Es ist wichtig, einen bekannten Standard unmittelbar vor der Trennung von unbekannten Proben (wie auch am Ende einer Reihe von Trennungen) zu trennen, um die Gültigkeit der Kapillare und Instrument am Tag zu überprüfen. Dieser Standard kann ein Oligoacrylat 27 oder jede Probe bekannt sein , mehrere Spitzen über einen weiten Bereich von Migrationszeiten zu geben. Die Überwachung der Strom während aller Trennungen und die Migration eines neutralen Markers in jeder Trennung der Analyse sind wichtige Schritte Probleme zu identifizieren. Ein instabiler Strom oder große Schwankungen (mehr als 10-15%) in dem Plateauwert des Stroms kann in dem Puffer (pH-Wert oder Konzentration) zu Inkonsistenz fällig. Wenn es durch eine verzögerte migratio gefolgtn-Zeit der neutralen maker kann auch darauf zurückzuführen sein, die Kapillare nicht ausreichend sauber sein. Routinekontrollen des pH-Wertes des Puffers und eine zusätzliche Spülung der Kapillare 10 min mit 1 M Natriumhydroxid (frisch hergestellt) kann verwendet werden, um dieses Problem zu vermeiden / ändern. Während des Versuchs kann zusätzliche Reinigungsschritte eingesetzt werden, um eine optimale Trennung zu gewährleisten, die typischerweise eine oder bündig mit konzentriertem wässrigem Natriumhydroxid Verlängern der Sicherung Silika Kapillaroberfläche zu regenerieren.
Die richtige Datenverarbeitung
Am Ende des Experiments, eine geeignete Behandlung der Rohdaten ist wesentlich, wenn die Ergebnisse zu vergleichen. Dies beinhaltet die Umwandlung der X- und Y-Achse von der CE Instrument erhalten (Schritt 8.3). Die Migrationszeiten bestimmt in CE haben eine relativ schlechte Reproduzierbarkeit und wir empfehlen die Verwendung von elektrophoretischen Mobilitäten stattdessen zu einer viel besseren Reproduzierbarkeit führt. Die Bedeutung der korrekten t rstelleneineskomplett Daten wurden Chitosan zuvor mit der Trennung und Charakterisierung von 10 gezeigt, Poly (Acrylsäure) 29, Blockcopolymere 13 und den Nachweis von Zuckern in Frühstückszerealien 8 durch kleinere Standardabweichungen (RSD) für Beweglichkeiten zwischen Experimenten beobachtet als für die Migrationszeiten . Ferner wurde CE 5 bei der Trennung von Monosacchariden in komplexen Matrizes als HPLC sein robuster gezeigt. Weitere Schritte der Optimierung beinhalten kann das Injektionsvolumen (Zeitpunkt der Injektion) das Einstellen Trennung mit guter Empfindlichkeit zu ermöglichen, ohne eine Überlastung verursacht, die Quantifizierung verhindern würde. Eine kürzere Injektionszeit führt zu einer verringerten Empfindlichkeit während längere Einspritzzeiten auf eine Spitzenformverzerrung führen indikativ für kapillare Überlastung: eine Einspritzzeit von 10 sec wird optimal bei 30 mbar (4B) betrachtet.
Bedeutung der Überwachung in Echtzeit
ove_content "> eine kritische Stärke dieses CE-Verfahren ist die Fähigkeit, Reaktionen in Echtzeit zu überwachen. Dies erfordert eine optimale CE Bedingungen zur Detektion und Trennung des betreffenden Reaktant (en) und / oder das Produkt (n). Ferner ist für die Analyse von chemischen Reaktionen ein geeigneter Zeitpunkt Null muss als Maßstab der Reaktion genommen werden, dies besteht in der Regel in der Trennung der an der Reaktion Reaktanden abgemessen kurz vor Start dieser zum Beispiel durchgeführt werden kann, bevor eine bestimmte Reaktanden eingeführt wird, vor. die Temperatur erhöht wird, oder vor der UV-Bestrahlung begonnen wird, die Reaktion auszulösen.Im Falle der Pfropfung der Peptid RGDS (auf Chitosan oder auf ein anderes Substrat) ist das Peptid mit sich selbst reagieren können lineare Oligomere oder verzweigte Strukturen durch 18 Polykondensation herzustellen. Dies liegt daran, RGDS enthält sowohl Amin- und Carbonsäure-funktionellen Gruppen. Diese Peptidoligomeren haben nicht die gleiche Electrophoretic Mobilität als anfängliche Peptid RGDS und kann daher eine ungenaue Quantifizierung verursachen, zum Beispiel durch Co-Migration mit anderen Arten. Es ist daher wichtig, sicherzustellen , dass Aliquote des Reaktionsmediums eingespritzt und innerhalb von wenigen Minuten aus dem Reaktionsmedium (4B) aufgenommen zu werden getrennt.
Die richtige Vorbereitung der Chitosan - Filme
Wenn speziell mit Chitosan Filmen handelt es gibt eine Reihe von Schritten zu halten. Während der Herstellung der Chitosan-Filme, benötigen die Filme gelassen werden für mindestens 7 Tage trocknen (vorzugsweise mehr). Ist dies nicht abgeschlossen ist, wenn die Filme in PBS-Puffer platziert werden auszuspülen werden sie aufzulösen, anstatt einen gequollenen Films bilden, die dann die nächsten Schritte verhindert. Zusätzlich ist es wichtig, den Film vor der Pfropfreaktion zu neutralisieren jegliches verbleibende Essigsäure zu entfernen, die aus der Film auslaugen können und konkurrieren mitdas Peptid für die Pfropfreaktion 18. Dies kann in verdünnter wässriger Natriumhydroxid oder in PBS durchgeführt werden Einweichen durch. Der pH-Wert des Puffers als Lösungsmittel für die Pfropfreaktion verwendet wird, ist auch kritisch: wenn es zu sauer ist, die Filme werden teilweise oder vollständig auflösen. Während der Pfropfreaktion ist es wichtig, dass der Film der Lage ist, einen maximalen Kontakt mit der Reaktionslösung zu haben. Daher werden die Petrischale, die Filme und die Reaktionsmischung enthält, auf einen Schüttler gestellt. Es ist auch unbedingt erforderlich, die Verdampfung des Reaktionsgemisches zu verhindern unkontrollierte Konzentrationsschwankungen in ungenauen Quantifizierungen ergeb zu verhindern; die Verwendung von Paraffinfilm der Petrischale zu bedecken war wirksam zu verhindern.
Die wichtigste Einschränkung der CE-Technik ist, dass individuell nicht in der Lage ist, das Pfropfverfahren zu bestätigen. Im Rahmen der chemischen Pfropfverfahren oben erwähnt, ist die Quantifizierung des Peptids Pfropfung indirekt. Dieswie zuvor erwähnt, kann mit der Verwendung einer komplementären Technik, wie beispielsweise Festkörper-NMR-Spektroskopie überwunden werden. Weitere Einschränkungen der CE-Technik beinhalten, dass es die Verbindung von Interesse erfordert aufgeladen werden. Daher neutrale Spezies wird zur gleichen Zeit wandern. In bestimmten Fällen kann dies, wenn die Verbindung von Interesse Komplexe mit Borat überwunden werden. Schließlich, wenn die Verbindung von Interesse nicht Chromophore Erkennung anderer als UV wie Leitfähigkeit enthalten muss verwendet werden kann. Dies erfordert die zusätzliche Anschaffung eines Leitfähigkeitsdetektors, die Optimierung erfordert.
Vorteile der Analyse Peptid Transplantation über CE vs andere analytische Methoden
Das CE-Verfahren hat mehrere Vorteile gegenüber alternativen indirekten Methoden einschließlich Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Aminosäureanalyse (AAA) und dem direkten Verfahren der NMR-Spektroskopie. Im Vergleich zu AAA ist es ein Hochdurchsatz, robustes Verfahren which erlaubt es komplexe Proben effizient und ohne langwierige Probenvorbereitung zu analysieren. Dies ist insbesondere bei der Analyse von chemischen Reaktionen in Echtzeit. HPLC wurde zuvor für verwendet worden Analyse Peptid Pfropfen 30, aber es war nur semi-quantitative angesehen. CE hat eine niedrigere Betriebskosten als HPLC und nicht Probenfiltrierung vor der Analyse erfordern, 5 das Risiko der Probenverlust zu minimieren. Obwohl 13 C - NMR - Spektroskopie das interessierende Produkt direkt messen kann, ist es eine kostspielige Technik , und ist unfähig , sie in Echtzeit zu messen.
Das Protokoll descripted hier bietet eine schnelle, effiziente, kostengünstige und zuverlässige Methode für die Peptid-Pfropfen auf Chitosan-Film zu optimieren. Dieser neue Ansatz bietet somit erhebliche Vorteile für das Nähen der Zellanheftung Eigenschaften von Chitosan-Filme im Vergleich zu traditionell verwendeten Methoden, wie Chromatographie und AAA. Diese CE-Verfahren kann verwendet werden, um eine Zahl zu überwachenanderer chemischer Reaktionen in Echtzeit, in der Regel auftretenden Reaktionen auf den Zeitraum von mehreren Stunden, für die die Reaktanden / Produkte von Interesse aufgeladen werden kann. In diesem Fall ist es jedoch wichtig, dass das CE-Verfahren zu beachten, sollten vor der Analyse einer unterschiedlichen chemischen Reaktion eine erfolgreiche Analyse zu ermöglichen optimiert werden. Dazu gehört die Analyse der reinen Edukte und Produkte vor der Reaktion, damit sie zu identifizieren und sicherzustellen, dass sie erkannt und getrennt werden können, sowie um sicherzustellen, dass keine Verunreinigungen Quantifizierung verhindern. Die Trennung verbessert werden kann und die Gesamtanalysezeit durch Variation der Kapillarlänge, Pufferzusammensetzung und Spannung, und möglicherweise unter Verwendung einer Kapillare mit beschichteten Wänden verändert. Die Detektion kann durch Modifizieren der Bedingungen verbessert werden, bei der die Probe eingespritzt wird, um die geladenen Reaktanten oder durch Einspritzen einer größeren Menge der Probe in die Kapillare zu begünstigen. Weiterhin können andere Detektoren abgesehen von UV-Detektion be eingesetzt, einschließlich Fluoreszenz, berührungslose Leitfähigkeitsdetektoren oder der CE kann mit einem Massenspektrometer gekoppelt werden. Die Fähigkeit zur Überwachung Reaktionen in Echtzeit ermöglicht die Pfropfreaktion in einem CE Phiole durchgeführt direkt zu werden, wenn das Substrat in Lösung ist und in der Lage, durch CE analysiert werden. Dies kann direkt im Inneren des CE Instrument, wie wir es vor kurzem zum Pfropfen von Aminoantipyrin auf Poly (acrylsäure) 7 durchgeführt Zusätzlich wird der Ansatz für Pfropfreaktionen nicht beschränkt , sondern kann erweitert werden , um verschiedene andere chemische Reaktionen zu überwachen. Ferner das Produkt der Reaktion zur Validierung die Überwachung der Reaktionen ermöglicht eine Optimierung der Reaktion und können auch verwendet werden. Solange die Verbindung von Interesse aufgelöst werden kann und geladen, ermöglicht es die CE-Methode schnell, billig und robust Trennung, Detektion und Quantifizierung.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water | Millipore | All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality | |
| Chitosan powder (medium molecular weight) | Sigma-Aldrich | 448877 | lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides |
| Acetic acid - Unilab | Ajax Finechem | 2-2.5L GL | laboratory reagent |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | laboratory reagent, corrosive |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | Irritant to skin |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | Irritant to skin |
| Sodium chloride | Ajax Finechem | 466-500G | laboratory reagent |
| Potassium chloride - Univar | Ajax Finechem | 384-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Disodium hydrogen phosphate - Unilab | Ajax Finechem | 1234-500G | laboratory reagent, slight skin irritant |
| Potassium dihydrogen phosphate - Univar | Ajax Finechem | 4745-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Oligoacrylate standard | custom made | See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46 | |
| Boric acid | BDH AnalR, Merck Pty Ltd | 10058 | Corrosive |
| Hydrochloric acid - Unilab | Ajax Finechem | A1367-2.5L | laboratory reagent, corrosivie |
| Fused silica tubing | Polymicro (Molex) | TSP050375 | Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies | G7100CE | Capillary electrophoresis instrument |
| Orbital shaker | IKA | KS260 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo | MS204S | |
| Milli-Q Synthesis | Millipore | ZMQS5VF01 | Ultrapure water filtration system |
| Parafilm | Labtek | PM966 | Parrafin wax |
References
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