Abstract
אלקטרופורזה נימים חינם-פתרון (CE) מפרידה analytes, תרכובות טעונות בדרך כלל פתרון באמצעות היישום של שדה חשמלי. לעומת טכניקות פרדה אנליטית אחרות, כגון כרומטוגרפיה, CE הוא זול, חזק ואפקטיבי לא דורש הכנת מדגם (במשך מספר מטריצות טבע מורכבות או דוגמאות פולימריות). CE הוא מהיר וניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר האבולוציה של תערובות בזמן אמת (למשל, קינטיקה כימית תגובה), כמו האותות נצפו עבור התרכובות המופרדות הם ביחס ישר לכמות שלהם בתמיסה.
הנה, את היעילות של CE מודגמת לניטור השתלת קוולנטי של פפטידים על גבי סרטי chitosan עבור יישומים ביו שלאחר מכן. התכונות מיקרוביאלית ביולוגיות של Chitosan להפוך אותו חומר אטרקטיבי עבור יישומים ביו כגון מצעי צמיחת תאים. קוולנטית השתלת rgds פפטיד (ארגינין - גליצין -חומצה אספרטית - סרין) על פני השטח של סרטי chitosan שואפת לשפר מצורף תא. מבחינה היסטורית, כרומטוגרפיה וניתוח חומצת אמינו שימשו לספק מדידה ישירה של כמות פפטיד מורכבים. עם זאת, ההפרדה והיעדר המהירה של הכנת מדגם מסופקת על ידי CE מאפשרים פחות ניטור מדויק עדיין בזמן אמת של תהליך השתלת פפטיד. CE הוא מסוגל להפריד בין לכמת את המרכיבים השונים של תערובת התגובה: הפפטיד (לא מורכב) ואת סוכני הצימוד הכימי. בדרך זו את השימוש לספירת תוצאות בסרטים משופרים עבור יישומים במורד זרם.
סרטי chitosan אופיינו באמצעות ספקטרוסקופיית מצב מוצק NMR (תהודה מגנטית גרעינית). טכניקה זו דורשת זמן רב ולא ניתן ליישם בזמן אמת, אבל מניב מדידה ישירה של פפטיד ובכך מאמתת את טכניקת CE.
Introduction
אלקטרופורזה נימי פתרון חינם (CE) היא טכניקה שמפרידה תרכובות פתרונות המבוססים על 1,2 היחס האחראי ל-חיכוך שלהם. החיוב לגודל- יחס לעתים קרובות מוזכר בספרות, אבל פישוט זה אינו חל על polyelectrolytes, לרבות פוליפפטידים בעבודה זו, וגם הוצג לא להיות מתאים 3 מולקולות אורגניות קטנות. CE נבדל טכניקות הפרדה אחרות בכך שהוא לא מקיים בשלב נייח, אלקטרוליט רקע בלבד (בדרך כלל חיץ). זה מאפשר את הטכניקה כדי להיות חזקה ביכולתה לנתח מגוון רחב של דוגמאות עם מטריצות מורכבות 4 כגון סיבים צמחיים 5, מבשל תסיסה 6 השתלה על פולימרים סינטטיים 7, דגימות מזון 8, ופפטידים מסיסים כמעט 9 ללא הכנת מדגם מייגע טָהֳרָה. מדובר בהישג משמעותי עבור polyelectrolytes מורכבים אשר יש בעיות פירוק (יםuch כמו chitosan 10 ו gellan מסטיק 11) ולכן קיים כפי מצטבר או זרז בתמיסה כבר נותח בהצלחה ללא סינון מדגם. יתר על כן, הניתוח של סוכרי דגני בוקר מעורב הזרקת דגימות עם חלקיקים של דגימות דגני בוקר זרז במים 8. זה גם מרחיב את הניתוח של polyelectrolytes מסועף או קופולימרים 12,13. עבודה נרחבת גם הושלמה בפיתוח טכניקות CE במיוחד עבור ניתוח של חלבונים עבור פרוטאומיקה 14, ההפרדה כיראליות של פפטידים טבעיים או סינתטיים 15 והפרדות שבב של חלבונים ופפטידים 16. מאז ההפרדה והניתוח להתבצע בתוך נימים, רק בנפחים קטנים של מדגם וממסים משמשים המאפשרים CE יש עלות ריצה נמוכה יותר מאשר טכניקות הפרדה אחרות כולל 5,6,17 כרומטוגרפיה. מאז ההפרדה על ידי CE היא מהירה, הוא מאפשר לבקרהטבעת של קינטיקה התגובה. הדבר בא לידי ביטוי במקרה של השתלת פפטידים על גבי סרטי chitosan עבור הידבקות תא משופר 18.
Chitosan הינו פוליסכריד נגזר N -deacetylation של כיטין. ניתן להשתמש סרטי Chitosan עבור יישומים ביו שונים כגון bioadhesives 19 מצעי צמיחת תאי 18,20, בשל biocompatibility של chitosan 21. מצורפים תא חלבוני מטריצה ספציפית תאיים, כמו פיברונקטין, collagens ו laminin, קשור ישירות ההישרדות של התאים 22. יש לציין, תאים מסוגים שונים לעתים קרובות דורשים מצורפים חלבונים תאים מטריקס שונים להישרדות ותפקוד תקין. מצורף תא סרטי chitosan הוצג להיות משופר באמצעות השתלת פיברונקטין 23; עם זאת, הכנה, טיהור השתלת חלבונים גדולים כאלה אינה כלכליים. לחילופין מגוון של פפטידים קטנים havדואר הוכח להיות מסוגל לחקות את תכונות חלבונים מטריקס גדולים. לדוגמה, פפטידים כגון RGD mimetics פיברונקטין (ארגינין - גליצין - חומצה אספרטית) ו rgds (ארגינין - גליצין - חומצה אספרטית - סרין) שימשו כדי להקל ולהגדיל תא מצורף 24. קוולנטיים השתלת rgds על גבי סרטי chitosan הביאה מצורף תא משופר עבור תאים המכונים לצרף פיברונקטין in vivo 18. נציב חלבונים גדולים אוהב פיברונקטין עם פפטידים קטנים יותר, שיש אותה פונקציונלי מספקת צמצום משמעותי בעלויות.
הנה, פפטיד השתלה כדי chitosan בוצע כפי שפורסם בעבר 18. כפי שהוכח בעבר, גישה זו מספקת השתלת פשוטה ויעילה באמצעות סוכני צימוד EDC-HCl (1-אתיל-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) ו NHS (-hydroxysuccinimide N) כדי functionalize חומצה קרבוקסילית של rgds להיות מורכב על גביסרט chitosan. שני יתרונות של שיטה זו הם השתיל כי היא אינה דורשת שינוי כלשהו של chitosan או של הפפטיד, וזה מתבצע במדיום מימי על מנת למקסם את התאימות עם יישומי תרבית תאים בעתיד 18,20. כמו סוכני הצימוד ואת פפטיד ניתן לטעון, CE היא שיטה מתאימה לניתוח של קינטיקה התגובה. חשוב לציין, ניתוח של קינטיקה התגובה באמצעות CE מאפשר ניטור בזמן אמת של תגובת ההשתלה, ובכך מאפשר הוא ייעול לכימות מידת ההשתלה.
אמנם זה לא הכרחי באופן שגרתי, התוצאות של ניתוח CE ניתן תוקף off-line על ידי מדידה ישירה של הפפטיד השתיל על סרטי chitosan באמצעות NMR מצב מוצק (תהודה מגנטית גרעינית) ספקטרוסקופיה 25,26 כדי להדגים את השתלת קוולנטי של הפפטיד על הסרט 18. עם זאת, בהשוואה ל ספקטרוסקופיה NMR מצב מוצק, ניתוח בזמן אמת שמספקCE מאפשרת כימות של צריכת פפטיד בזמן אמת ובכך את היכולת להעריך את קינטיקה של התגובה.
השיטה הנ"ל היא פשוטה ומאפשרת הניתוח בזמן האמת של פפטיד השתלה גבי סרטי chitosan עם כימות עקיפה של מידת ההשתלה. השיטה הוכיחה ניתן להאריך את הערכה כמותית בזמן אמת של תגובות כימיות שונות כל עוד המגיבים או המוצרים להיות מנותח ניתן לטעון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת סרטי Chitosan
- תשקול 2 גרם של חומצה אצטית קרחונית, להשלים 100 מיליליטר עם מי ultrapure.
- תשקלי 1.7 גרם של אבקת chitosan, להוסיף 100 מ"ל של תמיסה מימית חומצה 2% מ / מ 'אצטית. מערבבים במשך 5 ימים עם בר ערבוב צלחת בחישה מגנטית בטמפרטורת החדר מכוסה או ברדיד אלומיניום או בחושך.
- צנטריפוגה פיזור chitosan ב 1,076 XG ב 23 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. אסוף את supernatant עם מזרק וזורק את המשקע.
- עבור כל סרט, aliquot 10 מ"ל של השעיה chitosan לתוך צלחת 9 ס"מ פטרי מפלסטיק בטמפרטורת החדר. השאר את הסרטים מכוסים להתייבש במשך 7 ימים לפחות.
- מספרי שימוש לחתוך סרטים היבשים לתוך 1 x 1 ריבועי סנטימטר. הערה: הניסוי יכול להיות מושהה בשלב זה.
2. הכנת פוספט שנאגר מלוח (PBS)
- תשקלי נתרן כלורי 8 גרם, אשלגן כלורי 0.2 גרם, phos מימן Disodium 1.44 גרםphate ופוספט dihydrogen אשלגן 0.24 גרם.
- ממסי כימיקלים אלה נשקלו ב 800 מיליליטר מי ultrapure ו לכייל פתרון עם חומצה הידרוכלורית מרוכזת ל- pH 7.4.
הערה: הניסוי יכול להיות מושהה בשלב זה.
3. הכנת 75 מ"מ נתרן Borate ההצפה ב- pH 9.2
- תשקול 3.0915 גרם של חומצה בורה. לפזר אותו 75 מ"ל מים ultrapure.
- לכיל הפתרון חומצה בורית כדי pH של 9.2 עם פתרון נתרן הידרוקסידי בריכוז של 10 M ומעלה.
זהירות: פתרונות סודיום הידרוקסיד מרוכז הם מאכלים יש לטפל בכפפות. - שלם עם מי ultrapure להשיג 100 מיליליטר של תמיסה. זה מניב חיץ borate נתרן 500 מ"מ ב- pH 9.2.
- לדלל את חיץ borate נתרן 500 מ"מ עם מים ultrapure למאגר borate 75 מ"מ נתרן. הערה: הניסוי יכול להיות מושהה בשלב זה.
4. הכנת Chitosan FiLMS עבור תגובת ההשתלה
- לשטוף 10 סרטים chitosan מרובע (1 x 1 ס"מ) ב 5 מ"ל של PBS עבור שעה 2 בצלחת פטרי בטמפרטורת החדר.
- במהלך תקופה זו, להכין ולאמת את מכשיר אלקטרופורזה הנימים (שלב 5).
5. הכנה ותיקוף של כלי אלקטרופורזה נימי
- הכן סיליקה התמזגו נימי 43.5 ס"מ חשוף עם קוטר פנימי של 50 מיקרומטר (43.5 ס"מ אורך כולל, אורך יעיל לחלון זיהוי הוא בדרך כלל 35 ס"מ) באמצעות החלשת את הציפוי החיצוני פולימר של נימי על אורך קבוצה עם תשמיש בוטה אז מצלם נימים.
- יצירת חלון עבור הנימים באמצעות מצית לשרוף את ציפוי הפולימרים ב -8.5 סנטימטרי המכניסה ואחרי שהוא מתקרר לנגב את זה נקי עם אתנול. לשרוף את הציפוי של הנימים בכל קצה במשך כמה מילימטרים עם מצית, ואחרי שהוא מתקרר לנגב את זה נקי עם אתנול.
- Insi נימי מקוםחלון איתור דה ולהתקין אותה קלטת הנימים ידי הצבתו באורכים שווים הכניסה והיציאה וסובב אותו למוטות את הקלטת. ואז להתקין את הקלטת במכשיר אלקטרופורזה הנימים.
- הגדר את הפרמטרים של השיטה עבור כל פרדה. בתפריט התוכנה ובחר "שיטה" ואז "ערוך את השיטה כולו". הגדר את הטמפרטורה, זמן, מתח, בקבוקונים המשמשים להפרדה (למשל 25 ° C, 10 דקות, 30 kV).
- במקטע מראש המיזוג, להגדיר את הגלים הרצופים: 10 דקות עם 1 M נתרן הידרוקסידי (במים), 5 דקות עם 0.1 M נתרן הידרוקסידי (במים), 5 דקות עם מי ultrapure ו -5 דקות עם חיץ borate 75 מ"מ נתרן ב- pH 9.2 עבור השיטה הראשונה של סדרת ניתוחים.
- לקבלת השיטות הבאות, להגדיר את הסט אדמומי ברציפות בקטע מראש המיזוג: 1 דקות עם 1 M נתרן הידרוקסידי (במים), 5 דקות עם חיץ borate נתרן 75 מ"מ ב- pH 9.2.
- במקטע ההזרקה, להגדיר פרמטרים עבור הזרקת הידרודינמית עם לחץ 30 mbar במשך 10 שניות לכל השיטות. בקטע ההפרדה, הגדר את תנאי ההפרדה עד 30 קילו ב 25 מעלות צלזיוס למשך 9 דקות עבור כל השיטות.
הערה: בדוק במדריך למשתמש של מכשיר לספירה ספציפי בתור נוהל להפעלת מכשיר CE עשוי להשתנות בין יצרנים. הכן את פתרון הידרוקסיד 1 M נתרן ביום.
- להזריק ולהפריד תקן פנימי נייטרלי (10 μl של dimethylsulfoxide v / v 10% (DMSO), במים מדולל לתוך 450 μl של חיץ borate נתרן 75 מ"מ). ואז להזריק ולהפריד באותו אופן תקן oligoacrylate (מומס במי ultrapure ב 10 גרם ∙ ל -1; לראות רשימה של חומרים) כדי לבדוק את תוקפו של הנימים. השהה את הרצף כאן עד תגובת ההשתלה הוא מוכן להתחיל.
6. הארכת rgds גבי סרט Chitosan
- תשקול את הפפטיד (1 מ"ג rgds)ואת סוכני צימוד (3 מ"ג EDC-HCl ו -2 מ"ג NHS).
- 2 שעות לאחר תחילת השריה הסרט chitosan ב PBS, לפזר את הפפטיד ואת סוכני צימוד 5 מ"ל של PBS.
- קחו aliquot 50 μl של פתרון זה. הוסף 2 μl של 10% v / v DMSO במים כתקן נייטרלי הפנימי aliquot. ניתוח aliquot עם לסה"נ (ראה שלב 7).
- הסר את 5 מ"ל של PBS נהגו לשטוף את הסרטים chitosan מצלחת פטרי. מוסיף את הפתרון 5 מיליליטר של סוכני פפטיד צימוד כדי בצלחת פטרי המכילה סרטי chitosan.
- מכסה את צלחת פטרי עם סרט פרפין ומניח אותו על שייקר מסלולית בטמפרטורת חדר. קח 50 aliquots μl של תקשורת תגובה בזמנים קבועים.
הערה: בפעם הניתוח הכוללת עם CE היא 15 דקות, אפוא aliquot ניתן לקחת כל 15 דקות (או כל 30 דקות אם שתי תגובות מנוטרות במקביל, וכו ').- הוסף 2 μl של 10% v / v DMSO במים כתקן נייטרלי פנימי לכל אלiquot.
הערה: Aliquots צריך להיות מנותח עם CE ברגע שהם נלקחים (ראה שלב 7).
- הוסף 2 μl של 10% v / v DMSO במים כתקן נייטרלי פנימי לכל אלiquot.
- לאחר 4 שעות של טלטול והסרת aliquot, הסר את צלחת פטרי מן שייקר. הסר את מדיום תגובת מצלחת פטרי. הוסף 5 מ"ל של PBS לשטוף את הסרטים chitosan.
- הסר את PBS בצלחת פטרי, יש לשטוף את הסרט chitosan עם מים ultrapure ולאפשר להם להתייבש במשך הלילה. הסר את מי ultrapure ולאחסן הסרטים ב -20 ° C בצלחת פטרי מפלסטיק.
ניטור 7. תגובת הארכת שימוש CE
- להזריק ו aliquots נפרד של התקשורת התגובה מיד לאחר הסרת מצלחת פטרי באמצעות התנאים ניתוח כאמור בסעיף 5.2.
- עם השלמת ההפרדות לשטוף את הנימים עם מי ultrapure במשך 10 דקות. לייבש אותו באמצעות סומק עם בקבוקון ריק (אוויר) במשך 10 דקות.
הערה: יכול להיות מושהה הניסוי בשלב זה.
8. בגיד נתונים tment עבור CE
- בדוק את תוקפו של כל ההפרדה, על ידי סימון כי הן הנוכחי במהלך הפרידה ואת זמן ההעברה של הסמן ניידות electroosmotic (DMSO במקרה זה) הם דומים לאלה שנצפו להפרדת oligoacrylate סטנדרטי.
הערה: עד 10-15% וריאציה מקובל מהערך הנוכחי צפוי של כ -50 מיקרו-אמפר וערך העברה חד של 1.3 דקות (ערכים ניידות electrophoretic אמור לשמש במקום פעמים הגירה אם ההדירות גבוהה נדרשת). - עבור כל הפרדה מוצלחת, לייצא את הנתונים הגולמיים מתוכנת אלקטרופורזה נימים ידי בחירת ערכת נתונים ספציפית, לחיצה ימנית על יצוא ובחירת אות מתאימה.
- המר את הנתונים הגולמיים שרשמו לסה"נ (כפי שהוצג ספיגת UV כפונקציה של זמן הגירה). המר את ציר ה- X (מ 'הגירה בזמן t) לתוך μ ניידות electrophoretic הבאים משוואה 1:
n 1 "src =" / files / ftp_upload / 54,549 / 54549eq1.jpg "/> (1)
כאשר L ד את הזמן ממושך הגלאי, L t הוא האורך הכולל של הנימים, V הוא המתח, ו- T איו היא זמן ההעברה של מצלצלים ניטראליים (תקן DMSO הפנימי במקרה זה) 27.
המר את ציר Y של הנתונים הגולמיים (ספיגת ב au) על חלוקת W mobilities electrophoretic (μ) בעקבות משוואה 2: 28
(2)
(2) 9. אפיון נוסף של סרטי פפטיד מורכב 18
- הכנס סרטי chitosan מורכב פפטיד, התגלגלו סביב עצמם, בתוך הרוטור NMR 4 מ"מ מצב מוצק. מלא את הרוטור עם פוספט שנאגר מלוח להתנפח הסרטים, ולסגור את הרוטור. חכה כמה שעות.
- ולנתח את הסרט עם 13 </ sup> ספקטרוסקופיה C תמ"ג 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CE הוא גם מתאים לפקח על ההשתלה של פפטידים (למשל, rgds) על גבי סרטי chitosan. סוכני צימוד מתאימים כוללים EDC-HCl ו NHS אשר מפעיל את הפפטיד להיות מורכבת על גבי chitosan (איור 1). CE הוא מסוגל להפריד בין המולקולות השונות של עניין מן מדיום התגובה. כדי להקצות את פסגות על electropherogram, rgds טהור, EDC-HCl ו NHS היו מומסים, מוזרק והפריד בנפרד. לאחר השמת השיא, מדיום התגובה הזריק המגיבים השונים זוהו (איור 2). EDC-HCl הגיבו למוצר הצד EDH-HCl (3 - (((ethylamino) (הידרוקסי מתילן)) אמינו) - N, N -dimethylpropan-1-אמין). sulfoxide דימתיל (DMSO) משמש כסטנדרט פנימי עבור הפרדות CE. Chitosan שוהה הניסוי השתלה בצורת סרטים מסיסים ולכן אינו מוזרק או שנצפתה CE. שים לב שעבור כל הנתונים הגולמיים, tהקליט ציר הזמן הגירה מומר ציר ניידות electrophoretic (משוואה 1) ואת ציר ספיגת UV לתוך ההפצה של W mobilities electrophoretic (μ) (משוואה 2).
כמו aliquots לקוחי מדיום התגובה הם ממוקמים לתוך מכשיר CE והזריקו. היקף התגובה מנוטר דרך הירידה של השיא הקשורים rgds (איור 3). כמו כן, ניתן לראות כי שיא EDC-HCl יורד בעוד עליות שיא EDH-HCl לאורך זמן. חשוב לציין כי אין אות שניתן להקצות למוצר מתגובה הצד של הפפטיד, ולכן ההנחה היא כי rgds סולקו מן המדיום התגובה מתבצעת מורכבים על גבי הסרט chitosan. Electropherograms המעולף (איור 3 א) לאפשר כימות של צריכת פפטיד מההתחלה עד הסוף של התגובה. זה יצוין, כילמרות קינטיקה בתחילה נמדדה במשך 18 שעות (איור 3 ב), 4 hr נחשב מספק התגובה להמשיך במידה המקסימלי. כדי לאפשר כימות נפח הזרקה אופטימלי נדרש כדי להבטיח את יחס אות לרעש גבוה מספיק תוך מניעת עומס יתר (איור 4 א) ובמקרה של rgds, זריקות נדרשו להסתיים בזמן אמת כדי למנוע polycondensation (איור 4 ב ).
הטכניקה מבוססת CE המתואר כאן לנתח פפטיד השתלה לסרטי chitosan הוא מהיר ופשוט; עם זאת, זה לא לכמת את תהליך ההשתלה ישיר. ספקטרוסקופיה NMR משמשת כדי להדגים את ההשתלה; מדידה זו לא ניתן לעשות זאת בזמן אמת (זה בדרך כלל לוקח כמה שעות) ועליו להסתיים-תגובה פוסט. ההשוואה האיכותית של סרטי chitosan לפני ואחרי ההשתלה מראה את ההשתלה המוצלחת של פפטידים throאיכס הופעתו של אות ב 70 עמודים לדקה בסרטים המורכבים המתאימים האג"ח האמיד בין chitosan ואת פפטיד (איור 5).
Scheme באיור 1. תגובת ההשתלה. ערכת תגובה כימית מראה את ההפעלה על ידי EDC-HCl ו NHS של הקבוצה הפונקציונלית החומצה קרבוקסילית של rgds ואחריו ההשתלה שלה על פני שטח הסרט של chitosan. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .
משימת שיא איור 2. של מיני נוכח מדיום התגובה. הפרדת א והמחאת שיא לפתרונות של EDC הידרוליזה חלקית -HCl (ורוד), rgds (אדום), NHS (כחול), כמו גם עבור PBS (סגול) ו מדיום התגובה (שחור). ב Electropherograms של תקשורת תגובה (שחור) הציגה כפונקציה של זמן הגירה (electrophoretic ניידות יש להשתמש כדי להתגבר דירות עניות פעמי הגירה). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ניטור איור 3. CE צריכת rgds. (א) מעולף פסגות פפטיד ב 30 דקות זמן תגובה (קו מוצק סגול), 60 דקות (קו מקף מג'נטה), 90 דקות (קו מוצק כחול), 120 דקות (קו מקף ירוק), 150 דקות (קו אדום מוצק) ו- (ב) קינטיקה של השתלת של מעל 18 שעות ב משכפל (מרובע עיגול)."Target =" pload / 54,549 / 54549fig3large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. פסגות פפטיד מעולפות במדיה תגובה מראות תוצאות לא טובות (א) משתנה פעמי הזרקה (הידרודינמית):. 5 שניות (קו כחול), 10 שניות (קו שחור), 20 שניות (קו אדום) ו -30 שניות (קו אדום) . (ב) כלי תקשורת תגובה עזבו בבקבוקון CE במשך תקופה ארוכה של זמן לפני זריקה:. 30 דק '(קו אדום) ו -90 דקות (קו כחול) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. 13C ספקטרום NMR נפוחה-מדינה של סרטי chitosan. השוואה של סרטים לפני (הקו השחור) ואחרי (קו כחול) השתלת פפטיד. איתות נוכחית רק בספקטרום נרשם לאחר ההשתלה מסומנת על ידי כוכביות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפשטות של הפרוטוקול המתואר כאן עושה אותו אידיאלי כדי יישום נרחב. עם זאת, תשומת לב מיוחדת צריכה להיות משולם כדי הצעדים העיקריים הבאים.
הכנת מכשיר לספירת פרופר
חשוב להפריד סטנדרט ידוע מייד לפני הפירוד של דגימות ידועות (כמו גם בסוף השורה של פרדות) כדי לבדוק את תוקפו של נימי המכשיר ביום. תקן זה יכול להיות oligoacrylate 27 או כל מדגם ידוע לתת פסגות מרובות על פני טווח רחב של פעמי הגירה. ניטור הנוכחי במהלך כל ההפרדות וניתוח נדידת סמן ניטראלי בכל הפרדה הם שלבים עיקריים לזהות בעיות. וריאציות נוכחיות או גדולות יציבות (יותר מ 10-15%) בשווי הרמה של הזרם יכולות להיות בגלל חוסר עקביות החיץ (pH או ריכוז). אם זה מלווה migratio מתעכבn זמן של היצרנית הניטראלית זה יכול להיות גם בשל הנימים לא להיות נקיות מספיק. בדיקות שגרתיות של ה- pH של למאגר וסומק תוספת של נימי למשך 10 דקות עם 1 M נתרן הידרוקסידי (מוכן טרי) יכול לשמש כדי למנוע / לתקן את הבעיה הזו. במהלך הניסוי, צעדי ניקיון נוספים יכולים להיות מועסקים על מנת להבטיח הפרדה אופטימלית, הכוללים בדרך כלל או הארכת סומק עם סודיום הידרוקסיד מימי מרוכז להתחדש לפני שטח נימי סיליקה פתיל.
טיפול נתונים פרופר
בסיומו של הניסוי, הטיפול המתאים של הנתונים הגולמיים חיוני כאשר משווים תוצאות. זה כולל המרה של X ו- Y ציר מתקבל המכשיר לספירה (שלב 8.3). בפעמי ההגירה שנקבעו CE יש דירות עניות יחסית ואנחנו ממליצים להשתמש mobilities electrophoretic במקום, מה שמוביל דירות הרבה יותר טובות. המשמעות של כראוי t נתוני reating הוכחו בעבר עם הפרדה ואפיון של chitosan 10, פולי (חומצה אקרילית) 29, קופולימרים לחסום 13 ואת זיהוי הסוכרים דגני בוקר 8 דרך סטיות תקן קטנות (RSD) נצפו בין ניסויים עבור mobilities מאשר פעמי הגירה . יתר על כן, CE הוכח להיות חזק יותר HPLC בהפרדת מונוסכרידים מטריצות מורכבות 5. פעולות נוספות של אופטימיזציה עשויות לכלול התאמת עוצמת הזריקה (בזמן ההזרקה) כדי לאפשר הפרדה עם רגישות טובה מבלי לגרום עומס יתר אשר ימנע כימות. זמן הזרקה של 10 שניות נחשבת אופטימלית 30 mbar (איור 4B): זמן הזרקה קצר מוביל רגישות מופחת תוך פעמי הזרקה כבר להוביל לעיוות צורת שיא מעידה על עומס יתר נימים.
חשיבותה של ניטור בזמן אמת
ove_content "> חוזק קריטי של שיטת CE מבוסס זה הוא היכולת לפקח תגובות בזמן אמת. זה דורש תנאי CE אופטימליים לגילוי והפרדה של המגיב הרלוונטי (ים) ו / או מוצר (ים). יתר על כן, עבור ניתוח של תגובות כימיות זמן מתאים אפס חייב להילקח כאמת מידה של התגובה; זה בדרך כלל מורכב בהפרדת המגיבים נמדדים החוצה רק לפני התגובה החל ניתן לעשות זאת למשל לפני מגיב מסוים אחד הוא הציג, לפני. הטמפרטורה עולה, או לפני קרינת UV הוא התחילה כדי לעורר את התגובה.במקרה של ההשתלה של rgds פפטיד (על chitosan או על מצע אחר), הפפטיד הוא מסוגל להגיב עם עצמו כדי לייצר oligomers ליניארי או מבנים מסועפים דרך polycondensation 18. הסיבה לכך היא כי rgds מכיל גם אמין וגם קבוצות פונקציונליות חומצה קרבוקסילית. oligomers פפטיד אלה אין אותו הדוארניידות lectrophoretic כמו rgds פפטיד הראשוני ועל כן היא עשויה לגרום כימות מדויק, דרך למשל שיתוף הגירה עם מינים אחרים. לכן חשוב לוודא כי aliquots של מדיום התגובה מוזרק והפריד תוך מספר דקות, לאחר שנלקח מדיום התגובה (האיור 4B).
הכנה נכונה של סרטי chitosan
כאשר מתמודדים במיוחד עם סרטים chitosan ישנם מספר צעדים כדי לדבוק. במהלך הייצור של סרטי chitosan, הסרטים צריכים להשאיר להתייבש במשך לפחות 7 ימים (רצוי יותר). אם זה לא הושלם, כאשר הסרטים ממוקמים חיץ PBS לשטוף הם יתמוססו ולא ליצור סרט נפוח אשר מונע את הצעדים הבאים. בנוסף, חשוב לנטרל את הסרט לפני תגובת ההשתלה כדי להסיר כל חומצה אצטית נותרים אשר עשוי לדלוף החוצה של הסרט ולהתחרותהפפטיד עבור תגובת השתלת 18. ניתן לעשות זאת באמצעות השריית נתרן הידרוקסידי לדלל מימית או PBS. ה- pH של המאגר משמש ממס עבור תגובת ההשתלה הוא גם קריטי: אם הוא חומצי מדי הסרטים יהיו חלקיים או מוחלט לפזר. במהלך תגובת ההשתלה חשובה כי הסרט הוא מסוגל לקיים קשר מקסימלית עם פתרון התגובה. לכן, צלחת פטרי המכילה את הסרטים ואת תערובת התגובה ממוקמת על שייקר. זוהי גם חובה למנוע אידוי של תערובת התגובה למנוע וריאציות ריכוז בלתי מבוקרת וכתוצאה מכך quantifications מדויק; שימוש סרט פרפין כדי לכסות את צלחת פטרי היה יעיל כדי למנוע את זה.
המגבלה העיקרית של הטכניקה CE הוא שכל אחד מהם בנפרד זה אינו מסוגל לאשר את תהליך השתלת. בהקשר של תהליך ההשתלה הכימי שהוזכר לעיל, כימות של השתלת פפטיד היא עקיפה. זֶהניתן להתגבר עם השימוש בטכניקה משלימה כגון ספקטרוסקופיה NMR מצב מוצק כאמור. מגבלות אחרות של טכניקת CE כוללות שזה דורש מתחם העניין להיות מחויב. לכן מינים נייטרלי יהגרו בעת ובעונה אחת. במקרים מסוימים ניתן להתגבר אם המתחם של מתחמי עניין עם borate. לבסוף, אם המתחם של עניין אינו מכיל זיהוי chromophores מלבד UV כגון מוליכות ייתכן שיהיה צורך בשימוש. זה מחייב את הרכישה הנוספת של גלאי מוליכות אשר דורש אופטימיזציה.
היתרונות של השתלת פפטיד לנתח באמצעות לספירה לעומת שיטות אנליטיות אחרות
שיטת CE יש מספר יתרונות על פני שיטות עקיפות אלטרנטיביות כוללים כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC), ניתוח של חומצות אמיניות (AAA) ואת השיטה הישירה של ספקטרוסקופיה NMR. לעומת AAA הוא תפוקה גבוהה, שיטה חזקה which מאפשר לו לנתח דגימות מורכבות ביעילות ללא הכנת מדגם מייגעת. זהו יתרון במיוחד בניתוח של תגובות כימיות בזמן אמת. HPLC נוצל בעבר עבור פפטיד השתלת ניתוח 30, אולם זה נחשב רק וכמותיות. יש CE בעלות ריצה נמוכה יותר HPLC ואינו דורש סינון מדגם לפני הניתוח, למזער את הסיכון של אובדן מדגם 5. למרות 13 ספקטרוסקופיה C התמ"ג הוא מסוגלת למדוד את המוצר של עניין באופן ישיר, הוא טכניקה יקרה ואינו מסוגל למדוד את זה בזמן אמת.
הפרוטוקול descripted כאן מספק שיטה מהירה, יעילה, זולה ואמינה לייעול פפטיד השתלה לסרט chitosan. גישה חדשה זו ובכך מספקת יתרונות משמעותיים עבור להתאים את התכונות מצורפות תא של סרטי chitosan בהשוואה לשיטות משמשות באופן מסורתי כגון כרומטוגרפיה ו AAA. שיטת CE זה יכול לשמש כדי לפקח על מספרשל תגובות כימיות אחרות בזמן אמת, בדרך כלל תגובות המתרחשות על פרק הזמן של מספר שעות, עבורו המגיבים / מוצרים של עניין יכולים להיות מחויבים. במקרה זה, חשוב עם זאת לציין כי השיטה לספירה צריכה להיות מותאמת לפני הניתוח של תגובה כימית שונה כדי לאפשר ניתוח מוצלח. זה כולל ניתוח של המגיבים הטהורים והמוצרים לפני התגובה כדי לאפשר את זיהוי ולוודא כי הם יכולים להתגלות ומופרדים, כמו גם כדי לוודא ששום מזהמים עלולים למנוע כימות. ההפרדה ניתן לשפר ואת זמן הניתוח הכולל השתנה על ידי שינוי אורך נימים, רכב החיץ והמתח, ואפשרות באמצעות נימים עם קירות מצופים. האיתור ניתן לשפר על ידי שינוי התנאים שבם המדגם מוזרק להעדיף המגיבים לשעבוד או על ידי הזרקת כמות גדולה יותר של המדגם לתוך הנימים. יתר על כן, גלאים אחרים מלבד איתור UV יכולים בדואר המועסק כולל קרינה, גלאי מוליכות ללא מגע או לספירה יכול להיות מצמיד את ספקטרומטר מסה. היכולת לנטר תגובות בזמן אמת מאפשרת תגובה השתלת להתבצע ישירות בקבוקון CE אם המצע נמצא פתרון, והוא מסוגל להיות מנותח על ידי CE. זה יכול להתרחש ישירות בתוך המכשיר לספירה, כפי שאנו לאחרונה בצענו אותו השתלת aminoantipyrine על פולי (חומצה אקרילית) 7 בנוסף, הגישה אינה מוגבלת תגובות השתלת אך ניתן להאריך לפקח תגובות כימיות שונות אחרות. יתר על כן, הניטור של התגובות מאפשר אופטימיזציה של התגובה ועשוי לשמש גם כדי לאמת את תוצר הלוואי של התגובה. עוד במתחם של עניין ניתן להמס וטיעון, שיטת CE מאפשרת מהיר, זול ויציב הפרדה, איתור וכימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water | Millipore | All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality | |
| Chitosan powder (medium molecular weight) | Sigma-Aldrich | 448877 | lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides |
| Acetic acid - Unilab | Ajax Finechem | 2-2.5L GL | laboratory reagent |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | laboratory reagent, corrosive |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | Irritant to skin |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | Irritant to skin |
| Sodium chloride | Ajax Finechem | 466-500G | laboratory reagent |
| Potassium chloride - Univar | Ajax Finechem | 384-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Disodium hydrogen phosphate - Unilab | Ajax Finechem | 1234-500G | laboratory reagent, slight skin irritant |
| Potassium dihydrogen phosphate - Univar | Ajax Finechem | 4745-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Oligoacrylate standard | custom made | See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46 | |
| Boric acid | BDH AnalR, Merck Pty Ltd | 10058 | Corrosive |
| Hydrochloric acid - Unilab | Ajax Finechem | A1367-2.5L | laboratory reagent, corrosivie |
| Fused silica tubing | Polymicro (Molex) | TSP050375 | Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies | G7100CE | Capillary electrophoresis instrument |
| Orbital shaker | IKA | KS260 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo | MS204S | |
| Milli-Q Synthesis | Millipore | ZMQS5VF01 | Ultrapure water filtration system |
| Parafilm | Labtek | PM966 | Parrafin wax |
References
- Muthukumar, M. Theory of electrophoretic mobility of a polyelectrolyte in semidilute solutions of neutral polymers. Electrophoresis. 17, 1167-1172 (1996).
- Barrat, J. L., Joanny, J. F. in Advances in Chemical Physics, Vol Xciv Vol. 94 Advances in Chemical Physics. , John Wiley & Sons Inc. 1-66 (1996).
- Fu, S. L., Lucy, C. A. Prediction of electrophoretic mobilities. 1. Monoamines. Anal. Chem. 70, 173-181 (1998).
- Harvey, D. Modern Analytical Chemistry. , McGraw Hill. (2000).
- Oliver, J. D., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust determination of monosaccharides in plant fibers in complex mixtures by capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 1291, 179-186 (2013).
- Oliver, J. D., Sutton, A. T., Karu, N., Phillips, M., Markham, J., Peiris, P., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust monitoring of ethanol fermentations by capillary electrophoresis. Biotechnology and Applied Biochemistry. 62, 329-342 (2015).
- Thevarajah, J. J., Sutton, A. T., Maniego, A. R., Whitty, E. G., Harrisson, S., Cottet, H., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantifying the Heterogeneity of Chemical Structures in Complex Charged Polymers through the Dispersity of Their Distributions of Electrophoretic Mobilities or of Compositions. Anal. Chem. 88, 1674-1681 (2016).
- Toutounji, M. R., Van Leeuwen, M. P., Oliver, J. D., Shrestha, A. K., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantification of sugars in breakfast cereals using capillary electrophoresis. Carbohydr. Res. 408, 134-141 (2015).
- Miramon, H., Cavelier, F., Martinez, J., Cottet, H. Highly Resolutive Separations of Hardly Soluble Synthetic Polypeptides by Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 82, 394-399 (2010).
- Mnatsakanyan, M., Thevarajah, J. J., Roi, R. S., Lauto, A., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of chitosan by degree of acetylation using simple free solution capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 405, 6873-6877 (2013).
- Taylor, D. L., Ferris, C. J., Maniego, A. R., Castignolles, P., in het Panhuis, M., Gaborieau, M. Characterization of Gellan Gum by Capillary Electrophoresis. Australian Journal of Chemistry. 65, 1156-1164 (2012).
- Thevarajah, J. J., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation and characterization of synthetic polyelectrolytes and polysaccharides with capillary electrophoresis. Adv. Chem. 2014, 798503 (2014).
- Sutton, A. T., Read, E., Maniego, A. R., Thevarajah, J., Marty, J. -D., Destarac, M., Gaborieau, M., Castignolles, P. Purity of double hydrophilic block copolymers revealed by capillary electrophoresis in the critical conditions. J. Chromatogr. A. 1372, 187-195 (2014).
- Righetti, P. G., Sebastiano, R., Citterio, A. Capillary electrophoresis and isoelectric focusing in peptide and protein analysis. Proteomics. 13, 325-340 (2013).
- Ali, I., Al-Othman, Z. A., Al-Warthan, A., Asnin, L., Chudinov, A. Advances in chiral separations of small peptides by capillary electrophoresis and chromatography. J. Sep. Sci. 37, 2447-2466 (2014).
- Kasicka, V. Recent developments in capillary and microchip electroseparations of peptides (2011-2013). Electrophoresis. 35, 69-95 (2014).
- JoVE Science Education Database. Capillary Electrophoresis (CE). Essentials of Analytical Chemistry. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/10226/capillary-electrophoresis-ce (2016).
- Taylor, D. L., Thevarajah, J. J., Narayan, D. K., Murphy, P., Mangala, M. M., Lim, S., Wuhrer, R., Lefay, C., O'Connor, M. D., Gaborieau, M., Castignolles, P. Real-time monitoring of peptide grafting onto chitosan films using capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 407, 2543-2555 (2015).
- Rinaudo, M. Chitin and chitosan: Properties and applications. Prog. Polym. Sci. 31, 603-632 (2006).
- Li, Z., Leung, M., Hopper, R., Ellenbogen, R., Zhang, M. Feeder-free self-renewal of human embryonic stem cells in 3D porous natural polymer scaffolds. Biomaterials. 31, 404-412 (2010).
- Domard, A. A perspective on 30 years research on chitin and chitosan. Carbohydr. Polym. 84, 696-703 (2011).
- Shekaran, A., Garcia, A. J. Nanoscale engineering of extracellular matrix-mimetic bioadhesive surfaces and implants for tissue engineering. Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj. 1810, 350-360 (2011).
- Custodio, C. A., Alves, C. M., Reis, R. L., Mano, J. F. Immobilization of fibronectin in chitosan substrates improves cell adhesion and proliferation. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 316-323 (2010).
- Boateng, S. Y., Lateef, S. S., Mosley, W., Hartman, T. J., Hanley, L., Russell, B. RGD and YIGSR synthetic peptides facilitate cellular adhesion identical to that of laminin and fibronectin but alter the physiology of neonatal cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 288, C30-C38 (2005).
- Lefay, C., Guillaneuf, Y., Moreira, G., Thevarajah, J. J., Castignolles, P., Ziarelli, F., Bloch, E., Major, M., Charles, L., Gaborieau, M., Bertin, D., Gigmes, D. Heterogeneous modification of chitosan via nitroxide-mediated polymerization. Polym. Chem. 4, 322-328 (2013).
- Gartner, C., Lopez, B. L., Sierra, L., Graf, R., Spiess, H. W., Gaborieau, M. Interplay between Structure and Dynamics in Chitosan Films Investigated with Solid-State NMR, Dynamic Mechanical Analysis, and X-ray Diffraction. Biomacromolecules. 12, 1380-1386 (2011).
- Castignolles, P., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Sprong, E., Ferguson, C. J., Gilbert, R. G. High resolution separation of oligo(acrylic acid) by capillary zone electrophoresis. Macromol. Rapid Commun. 27, 42-46 (2006).
- Chamieh, J., Martin, M., Cottet, H. Quantitative Analysis in Capillary Electrophoresis: Transformation of Raw Electropherograms into Continuous Distributions. Anal. Chem. 87, 1050-1057 (2015).
- Maniego, A. R., Ang, D., Guillaneuf, Y., Lefay, C., Gigmes, D., Aldrich-Wright, J. R., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of poly(acrylic acid) salts according to topology using capillary electrophoresis in the critical conditions. Anal. Bioanal. Chem. 405, 9009-9020 (2013).
- Chung, T. W., Lu, Y. F., Wang, S. S., Lin, Y. S., Chu, S. H. Growth of human endothelial cells on photochemically grafted Gly-Arg-Gly-Asp (GRGD) chitosans. Biomaterials. 23, 4803-4809 (2002).
