Abstract
프리 용액을 모세관 전기 영동 (CE)은 전계의인가를 통해 용액 분석, 일반적으로 충전 된 화합물을 분리한다. 크로마토 그래피와 같은 다른 분석 분리 기술에 비해, CE 강력한, 저렴하고 효율적으로 (복잡한 자연 행렬 또는 중합체 샘플의 수에 대한) 어떤 샘플 준비가 필요하지 않습니다. CE는 빠르게 분리 된 화합물에 대해 관찰 된 신호는 용액에서의 양에 정비례로 실시간 (예를 들어, 화학 반응 속도)의 혼합물의 방출을 수행하기 위해 사용될 수있다.
여기서, CE 효율이 후속 생의학 애플리케이션 키토산 필름 상 펩티드의 공유 래프팅 모니터링 설명된다. 키토산의 항균 및 생체 특성은 이러한 세포 성장 기판 등 생물 의학 응용 프로그램에 대한 매력적인 소재 확인합니다. 공유 RGDS 펩티드를 (그 래프팅 아르기닌 - 글리신 -아스파르트 산 - 세린) 키토산 필름의 표면에 세포 부착을 향상시키는 것을 목적으로한다. 역사적으로, 크로마토 그래피 및 아미노산 분석 그래프트 펩티드의 양을 직접 측정을 제공하기 위해 사용되어왔다. 그러나 CE 제공하는 샘플 제제의 신속한 분리 부재 펩티드 래프팅 방법의 균등하면서도 정확한 실시간 모니터링을 가능하게한다. CE 분리는 반응 혼합물의 다른 구성 요소를 정량화 할 수있다 : 제 (비 그래프트) 펩타이드와 화학적 커플 링제. 이러한 방식으로 CE의 사용은 하류 어플리케이션에 개선 된 필름을 초래한다.
키토산 필름은 고체 NMR (핵 자기 공명) 분광법을 특징으로 하였다. 이 기술은 많은 시간이 걸린다 실시간으로 적용 할 수 있지만, 펩티드의 직접적인 측정치를 산출하고, 따라서 CE 기술을 검증한다.
Introduction
무료 용액 모세관 전기 영동 (CE)는 그 전하로 마찰 비율 1.2에 기반 솔루션의 화합물을 분리하는 기술이다. 충전 - 투 - 크기 비율은 종종 문헌에 언급되어 있지만,이 단순화는이 작품에서 폴리 펩타이드를 포함하여, 고분자 전해질에 적용되지 않습니다, 또한 작은 유기 분자 3에 적합하지 줬습니다. CE는 정지상 만 배경 전해질 (통상 버퍼)를 갖고 있지 않는 다른 분리 기술과 다르다. 이 기술은 5, 발효 양조주 6 합성 중합체 7 음식 샘플 8 지루한 샘플 준비없이 거의 용해 펩티드 (9) 상에 이식 식물 섬유 등의 복잡한 매트릭스 (4) 샘플의 넓은 범위를 분석 할 수있는 능력의 견고 할 수 정화. 이 용해 문제가 복잡한 고분자 전해질 (들에 특히 중요하다UCH 따라서 키토산 (10)와 젤란 검 11) 및뿐만 집계 또는 용액에 침전 존재하고 성공적으로 샘플 여과없이 분석되고있다. 또한, 아침 시리얼에 설탕의 분석 물 (8)에 침전 아침 시리얼 샘플의 입자 샘플을 주입하고있었습니다. 이것은 또한 분기 고분자 전해질 또는 공중 합체 (12, 13)의 분석을 확장합니다. 많은 작업은 특별히 프로테오믹스 (14), 천연 또는 합성 펩티드 15, 단백질 및 펩티드 (16)의 마이크로 칩 분리의 키랄 분리를위한 단백질의 CE 분석 기술의 개발에 완성되었다. 분리 및 분석 모세관 일어날 때문에, 단지 작은 샘플 볼륨과 용매 크로마토 5,6,17 포함한 다른 분리 기술보다 낮은 운전 비용이 CE 할 수있게하는 데 사용된다. CE 분리하여 고속이기 때문에,이 과정 제어를 허용반응 속도의 반지. 이는 개선 된 세포 부착 18 키토산 필름 상 펩티드의 이식의 경우에서 설명 하였다.
키토산은 키틴의 N의 -deacetylation 유래의 다당류이다. 키토산의 생체 적합성으로 인해 21, 18, 20 19 생체 접착제 및 세포 증식 기질로서 키토산 필름 등 다양한 생물 의학 응용에 사용될 수있다. 피브로넥틴, 콜라겐 및 라미닌 등의 특정 세포 외 기질 단백질에 대한 세포 부착은 직접 셀 (22)의 생존에 연결된다. 특히, 다른 세포 유형은 종종 생존과 적절한 기능에 대해 서로 다른 세포 외 기질 단백질에 부착이 필요합니다. 키토산 필름에 세포 부착은 피브로넥틴 (23)의 접목을 통해 개선 된 것으로 나타났다; 그러나, 제조, 정제 및 대형 단백질의 접목은 경제적으로 실행되지 않습니다. 대안 작은 펩타이드의 범위는 근래E는 많은 세포 외 기질 단백질의 특성을 모방 할 수있는 것으로 나타났다. 예를 들어, 피브로넥틴의 모방 체로서 RGD 펩티드 (아르기닌 - 글리신 - 아스파르트 산) 및 RGDS (아르기닌 - 글리신 - 아스파라긴산 - 세린)을 촉진하고 세포 부착 (24)을 증가시키는 데 사용되어왔다. 키토산 필름 상에 RGDS의 공유 이식은 생체 내 18 피브로넥틴에 연결하는 것으로 알려진 세포에 대한 향상된 세포 부착 결과. 더 큰 단백질을 대체하는 것은 동일한 기능은 상당한 비용 절감을 제공이 작은 펩티드 피브로넥틴을 추천.
이전 18 공표 여기서, 키토산 래프팅 펩티드 하였다. 이미 증명 된 바와 같이, 이러한 접근법은되도록 RGDS의 카복실산 기능화 할 커플 링제 EDC-HCl을 (1- 에틸 -3- (3- 디메틸 아미노 프로필 ) 카 보디이 미드 ) 및 NHS (N의 -hydroxysuccinimide)를 이용하여 간편하고 효율적으로 식립을 제공 에 이식키토산 필름. 이 래프팅 방법의 두 가지 장점은 키토산 또는 펩티드의 임의의 변형을 필요로하지 않는다는 점이며, 이는 향후의 세포 배양 애플리케이션 (18, 20)과의 호환성을 극대화하는 수성 매질에서 수행된다. 커플 링제와 펩티드가 충전 될 수있는 바와 같이, CE 반응 동력학의 분석에 적합한 방법이다. 중요한 CE 통해 반응 속도 분석 래프팅 반응의 실시간 모니터링을 가능하게하고, 따라서 모두 최적화 래프팅 정도를 정량 할 수 있습니다.
그것은 통상적으로 필요하지 않다하지만, CE 분석 결과는 공유 래프팅을 입증 고체 NMR (핵 자기 공명) 분광학 25, 26를 사용하여 키토산의 필름 상에 그 래프팅 펩타이드의 직접 측정에 의해 오프라인으로 확인 될 수있다 막 (18) 상에 펩타이드. 그러나, 고체 상태 NMR 분광법에 비해 실시간 분석을 제공CE 실시간 펩티드 소모와 반응의 동역학을 평가하는 것이 기능의 정량화 할 수있다.
상술 한 방법은 간단하고, 그 래프팅 정도 간접 정량 키토산 필름 상에 그 래프팅 펩티드를 실시간으로 분석 할 수있다. 입증 된 방법은 다른 화학적 반응만큼 반응물 또는 충전 할 수있는 분석하고자하는 제품의 실시간 정량적 평가로 확장 될 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
키토산 필름 1. 준비
- 초순수로 100 ㎖ 완전한 빙초산 2g을 칭량.
- 2 % m / m 아세트산 수용액 100 ㎖를 추가, 키토산 분말 중 1.7 g을 달아. 어느 알루미늄 박 또는 어둠에 덮여 실온에서 교반 바 및 자기 교반 플레이트 5 일 동안 교반한다.
- 1 시간 동안 23 ° C에서 1,076 XG에서 키토산 분산을 원심 분리기. 주사기와 뜨는을 수집하고 침전물을 버린다.
- 각 막 분취 액을 실온에서 9cm 플라스틱 페트리 접시에 키토산 현탁액 10ml를 들어. 최소 7 일 동안 건조 다루는 영화를 둡니다.
- 사용 가위는 1 × 1cm 사각형으로 건조 필름을 잘라. 참고 : 실험은이 단계에서 일시 중지 할 수 있습니다.
인산염 완충 식염수 2. 준비 (PBS)
- 8g 염화나트륨을 달아, 0.2 g의 염화 칼륨, 1.44 g 소듐 수소 진료 기관 연합phate 0.24 g 인산이 수소 칼륨.
- 초순수 800 ㎖에 이들 칭량 화학 용해시키고, pH 7.4의 농축 염산으로 용액을 적정한다.
참고 : 실험은이 단계에서 일시 중지 할 수 있습니다.
pH가 9.2에서 75 mM의 나트륨 붕산염 완충액 3. 준비
- 붕산의 3.0915 g을 달아. 초순수 75ml를 그것을 녹인다.
- 10 M 이상의 농도의 수산화 나트륨 용액으로 pH가 9.2로 붕산 용액을 적정한다.
주의 : 농축 수산화 나트륨 용액은 부식성와 장갑으로 취급되어야한다. - 초순수 완전한 용액 100 ㎖을 얻었다. 이것은 pH가 9.2에서 500 mM의 붕산 나트륨 완충액을 산출한다.
- 75 mM의 붕산 나트륨 완충액을 초순수로 500 mM의 붕산 나트륨 완충액을 희석. 참고 : 실험은이 단계에서 일시 중지 할 수 있습니다.
키토산 인터넷 4. 준비그 래프팅 반응에 대한 LMS
- 실온에서 배양 접시에서 2 시간 동안 PBS 5ml에 10 평방 키토산 필름 (1 × 1cm)을 헹군다.
- 이 기간 동안, 준비 및 모세관 전기 기기 (5 단계) 유효성.
모세관 전기 영동 장비의 5. 준비 및 검증
- 50㎛의 내부 직경이 43.5 cm 노출 된 용융 실리카 모세관 준비 A의 설정된 길이에서 모세관의 폴리머 외피를 약하게하여 (전체 길이, 검출 윈도우의 유효 길이는 43.5 cm 보통 35 cm이다) 무딘기구는 모세관을 스냅.
- 입구에서 8.5 cm의 폴리머 코팅을 구울 라이터를 사용하여 모세관을위한 창을 만들고이를 냉각 한 후 에탄올로 깨끗하게 닦아냅니다. 라이터와 함께 몇 밀리미터의 각 끝 부분에있는 모세관의 코팅 굽기, 그것은 냉각 후 에탄올로 깨끗하게 닦아냅니다.
- 장소 모세관 INSI드 검출 창은 입구와 출구가 동일한 길이로 그 배치 및 카세트의 스핀들 주위를 감아 모세관 카세트에 설치하고. 그런 다음, 모세관 전기 영동 기기에서 카세트를 설치합니다.
- 각 분리 방법의 파라미터를 설정한다. 소프트웨어 메뉴에서 "전체 방법을 편집"다음 "방법"을 선택합니다. (예를 들면 25 ° C, 10 분, 30 kV로) 분리에 이용되는 온도, 시간, 전압, 바이알을 설정한다.
- (수중) 1 M 수산화 나트륨 (물), 0.1 M 수산화 나트륨, 초순수로 5 분, 75 mM의 나트륨 붕산염 완충액으로 5 분 5 분 10 분 : 프리 컨디셔닝 섹션 연속 플러시 세트 분석의 시리즈의 첫 번째 방법의 pH 9.2에서.
- (수중) 1 M 수산화 나트륨, pH가 9에서 75 mM의 나트륨 붕산염 완충액으로 5 분 1 분 : 연속 방식의 경우, 세트를 프리 컨디셔닝 섹션의 연속 플러시를 설정한다.2.
- 주입 섹션에서 모든 방법을 10 초 동안 30 mbar의 압력을 가진 유체 분사에 대한 매개 변수를 설정합니다. 상기 분리 부에서 모든 방법 9 분 동안 25 ° C에서 30 kV로의 분리 조건을 설정한다.
주 : 제조 업체 사이에 다를 수 있습니다 CE 기기를 조작하기위한 절차로 특정 CE 기기의 사용자 설명서를 참조하십시오. 하루에 1 M 수산화 나트륨 용액을 준비한다.
- 주사하고 (75 mM의 나트륨 붕산염 완충액 450 μL로 희석하고 물, 10 % v / v의 디메틸 술폭 시드 10 μL (DMSO)) 중성 내부 표준 물질을 분리한다. 주입 한 후 동일한 방법에 oligoacrylate 표준 분리, 모세관의 유효성을 확인하기 위해 (10g ∙ L -1로 초순수에 용해 된 물질을 목록 참조). 그 래프팅 반응이 시작할 준비가 될 때까지 여기 순서를 일시 중지합니다.
키토산 필름에 RGDS 6. 손톱
- 펩타이드를 체중 (1 mg을 RGDS)상기 커플 링제 (3 mg의 EDC-HCl을 2 mg을 NHS).
- 2 시간 PBS에서 키토산 막 균열의 개시 후, 상기 펩티드 및 PBS 5ml에 커플 링 에이전트를 녹인다.
- 이 솔루션의 50 μL 나누어지는 가져 가라. 표본에 내부 중립 표준으로 물에 10 % V / V의 DMSO의 2 μl를 추가합니다. CE로 나누어 분석 (7 단계 참조).
- PBS의 5 ㎖를 페트리 접시에서 키토산 필름을 세척하는 데 사용 제거합니다. 키토산 필름을 포함하는 페트리 접시에 펩타이드 커플 링 에이전트의 5 ml의 솔루션을 추가합니다.
- 파라핀 필름 페트리 접시를 덮고 실온에서 궤도 통에 놓습니다. 설정 한 시간에 반응 미디어의 50 μl의 분취 량을 가져 가라.
주 : CE으로 총 분석 시간은 15 분이며, 따라서 분취 액을 15 분마다 (또는 두 반응이 병렬로 모니터하는 경우 30 분마다 등)를 취할 수있다.- 각각의 알에 내부 중립 표준으로 물에 10 % V / V의 DMSO의 2 μl를 추가iquot.
참고 : 분취 량은 즉시이 촬영으로 CE와 함께 분석해야한다 (7 단계 참조).
- 각각의 알에 내부 중립 표준으로 물에 10 % V / V의 DMSO의 2 μl를 추가iquot.
- 흔들어 나누어지는 제거의 4 시간 후, 진탕 기에서 페트리 접시를 제거합니다. 페트리 접시에서 반응 매질을 제거합니다. 키토산 필름을 씻어 PBS의 5 ML을 추가합니다.
- , 페트리 접시에서 PBS를 제거 초순수와 키토산 필름을 세척하고 밤새 건조 할 수 있습니다. 초순수를 제거하고 플라스틱 페트리 접시에서 -20 ° C에서 영화를 저장합니다.
그 래프팅 반응의 제 모니터링 CE 사용
- 주사 즉시 5.2 절과 분석 조건을 사용하여 배양 접시로부터 분리 한 후 반응 매질의 별개 분취.
- 분판 종료 후 10 분간 초순수 모세관을 헹군다. 10 분 동안 빈 유리 병 (공기)와 플러시를 통해 건조.
주 : 실험은이 단계에서 일시 중지 할 수 있습니다.
8. 데이터 누 CE에 대한 tment
- 분리시의 전류 (이 경우 DMSO) 상기 전기 이동 마커의 이동 시간 모두 oligoacrylate 표준 분리 관찰 된 것과 유사하다는 것을 확인하여, 각각 분리의 유효성을 확인한다.
주 : 변화가 50 μA 1.3 분의 이동 시간 값의 예상 전류 값으로부터 허용 10-15%까지 (더 높은 재현성이 요구되는 경우, 전기 영동 이동도의 값이 아닌 이동 시간으로 표기). - 각각의 성공적인 분리를 들어, 오른쪽 수출 클릭하고 적절한 신호를 선택, 특정 데이터 세트를 선택하여 모세관 전기 영동 소프트웨어의 원시 데이터를 내보낼 수 있습니다.
- 세륨에 의해 기록 된 원시 데이터를 변환 (이동 시간의 함수로서 UV 흡광도로 표시). 수학 식 1에 따라, 전기 영동 이동도 μ에 X 축 (이동 시간 t의 m)를 변환 :
n은 1 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 54549 / 54549eq1.jpg "/> (1)
L (D)가 상기 검출기의 길이이고, L의 t는 모세관의 총 길이는, V는 전압이고, t의 EO 중성 종 (이 경우 DMSO 내부 표준 물질) (27)의 이동 시간이다.
28 : 다음의 수학 식 2의 전기 영동 이동성의 W (μ)의 분포에 대한 원시 데이터 (AU의 흡광도)의 Y 축 변환
(2)
(2) 펩타이드 이식 필름 (18) 9. 추가 특성
- 4mm의 고체 NMR 로터에 자신의 주위에 롤 펩타이드 이식 키토산 필름을 삽입합니다. 영화를 팽창하고, 회 전자를 닫 인산 완충 식염수로 로터를 입력합니다. 몇 시간 동안 기다립니다.
- (13) 필름 분석 </ SUP> C NMR 스펙트럼 (18).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CE 키토산 필름 상 펩티드 (예, RGDS)의 이식을 모니터링에 적합하다. 적합한 커플 링제는 키토산에 이식 할 (그림 1) 펩티드를 활성화 EDC 염산 및 NHS를 포함한다. CE는 반응 매질로부터 관심있는 다른 분자를 분리 할 수있다. electropherogram에 피크를 지정하려면, 순수한 RGDS는, EDC-HCl을하고 NHS는, 용해 주입 별도로 분리 하였다. 피크 할당 한 후, 반응 매질을 주입하고, 다양한 반응물 (도 2)를 발견 하였다. (- (((에틸) (히드 록시 페닐) 메틸렌) 아미노) - N, N-1 -dimethylpropan 아민 3) EDC-HCl을 사이드 생성물 EDH 염산으로 반응시켰다. 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)는 CE 분리하기위한 내부 표준으로서 사용된다. 키토산은 수용성 필름의 형태로 이식 실험에서 존재하고, 따라서 주사 또는 CE에서 관찰되지 않는다. 모든 원시 데이터, t 참고그는 이동 시간 축이 전기 영동 이동도의 W (μ) (식 2)의 분포에 전기 영동 이동성 축 (식 1) 및 UV 흡광도 축으로 변환되어 기록된다.
분취 액이 반응 매질에서 가져옵니다으로 그들은 CE 기기에 넣고 주입된다. 반응의 정도는 RGDS (도 3)와 관련된 피크의 감소를 통해 모니터링된다. 또한, EDC-HCl을 피크 시간 이상 동안 EDH 염산 피크 증가 감소한다는 것을 알 수있다. 따라서 그것은 RGDS는 키토산 필름 상에 그 래프팅되는 반응 매질로부터 제거되는 것으로 가정하고, 펩티드의 부반응에서 제품에 할당 할 수있는 신호가없는 것이 중요하다. 오버레이 electropherograms (도 3A)을 반응의 시작부터 종료까지의 펩티드 소비 정량을 허용한다. 또한 주목해야한다반응 속도는 처음 18 시간 (그림 3B)을 측정 하였다 있지만 반응이 최대 범위로 진행하는, 4 시간은 충분하다고 판단했다. 정량화 할 수 있도록 최적의 주입 부피가 과부하 방지하면서 비가 충분히 높은 신호 - 대 - 잡음 (도 4A)을 보장하기 위해 필요하며 RGDS의 경우이고, 주사는 중축 (도 4b 방지 실시간으로 완료 될 필요가 있었다 ).
은 CE 기반 기술은 빠르고 간단 키토산 필름에 접목 펩타이드를 분석하기 위해 여기에 설명; 그러나, 직접 이식 과정을 정량화하지 않는다. NMR 스펙트럼은 래프팅을 입증하기 위해 사용된다; 이 측정은 실시간으로 수행 될 수 없다 (이는 통상적으로 몇 시간 정도), 후 반응을 완료 할 필요가있다. 전 및 이식 후에 키토산 필름의 질적 비교는 펩티드의 성공적인 식립을 죽 도시우 키토산 펩티드 (도 5) 사이의 아마이드 결합에 대응하는 그래프트 막 70 ppm에서의 신호의 외관.
그 래프팅 반응 그림 1. 계획. EDC - 염산과 키토산의 필름 표면에의 접목 다음 RGDS의 카르 복실 산 작용기의 NHS에 의한 활성화를 나타낸 화학 반응식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
반응 매질에 존재하는 종의도 2 피크의 지정. 부분적으로 가수 분해 된 EDC의 솔루션에 대한 A. 분리 및 피크 할당 -HCl (분홍색), RGDS과 PBS (보라색)에 대한 (적색), NHS (청색), 및 반응 매질 (검정). 이동 시간의 함수로서 제시 반응 매체 (블랙)의 B. Electropherograms (전기 영동 이동성이 이전 시대에 가난한 반복)을 극복하기 위해 사용되어야한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
RGDS 소비 그림 3. CE 모니터링. (A)는 반응 시간 30 분 (보라색 실선), 60 분 (마젠타 대시 라인), 90 분 (파란색 실선), 120 분 (녹색 점선)에서 펩타이드 피크를 입혔다 이식의 150 분 (적색 실선)와 (B) 반응 속도는 복제 (광장 및 원)에서 18 시간에 걸쳐 완성했다.PLOAD / 54549 / 54549fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 차선의 결과를 보여주는 반응 매체 4. 오버레이 펩타이드 피크 (A) 변하는 (유체) 주입 시간 :. 5 초 (파란 선), 10 초 (검은 선), 20 초 (레드 라인), 30 초 (마젠타 라인) . 주입하기 전에 오랜 기간 동안 CE 유리 병에 남아있는 (B) 반응 매체 :. 30 분 (레드 라인), 90 분 (파란색 선) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 13키토산 필름의 C 부어 상태 NMR 스펙트럼. 영화 전 (검은 선)의 비교 및 후 (파란색 선) 펩타이드 이식. 단지 별표로 표시됩니다 이식 후 기록 된 스펙트럼에 존재하는 신호. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜의 단순함은 광범위한 애플리케이션에 이상적으로 적합하다. 그러나, 특별한주의는 다음과 같은 주요 단계에 지불해야합니다.
적절한 CE 악기 준비
이는 하루에 모세관 및 기기의 정당성을 확인하는 미지 시료의 분리 직전에 공지 된 표준 (뿐만 아니라 분리의 일련의 끝)를 분리하는 것이 중요하다. 이 표준은 oligoacrylate 27 회 이전의 넓은 범위에 걸쳐 다수의 피크를 제공하는 공지 된 임의의 샘플 일 수있다. 모든 분리시 전류를 모니터링하고 각 분리에 중립 마커의 이동을 분석은 문제를 파악하기위한 주요 단계입니다. 현재의 고원 값에 불안정한 전류 또는 큰 변화 (이상 10-15%)은 완충액 (pH 또는 농도)의 불일치에 기인 할 수있다. 이것은 지연된 migratio 뒤에 있다면n은 중립 메이커의 시간은 또한 모세관이 충분히 청소되지 않는 원인 일 수 있습니다. 버퍼의 pH 및 (갓 제조) 1 M 수산화 나트륨을 10 분 동안 모세관의 추가 플러시 정기 점검 / 예방이 문제를 정정하기 위해 사용될 수있다. 실험이 진행되는 동안, 추가적인 세척 단계는 일반적으로 포함하거나, 퓨즈 실리카 모세관 표면을 다시 농축하여 수산화 나트륨 수용액으로 플러시 길어, 최적의 분리를 보장하기 위해 사용될 수있다.
적절한 데이터 처리
결과를 비교하면, 실험의 결론에서, 원 데이터의 적절한 처리가 필수적이다. 이것은 CE 기기 (단계 8.3)에서 획득 된 X 및 Y 축에의 변환을 포함한다. CE 결정 마이그레이션 시간은 상대적으로 가난한 반복성을 가지고 우리는 훨씬 더 반복으로 이어지는 대신 전기 영동 이동도를 사용하는 것이 좋습니다. 올바르게의 중요성 t reating 데이터 분리 및 특성화 키토산 10 폴리 (아크릴산) (29), 블록 공중 합체 (13)의 8 이동 시간보다 이동도에 대한 실험 사이에서 관찰 된 작은 표준 편차 (RSD)를 통해 아침 곡물 당류의 검출에 앞서 도시 된 . 또한, CE는 복잡한 매트릭스 5 단당류의 분리 HPLC로보다 더 강력한 것으로 나타났다. 최적화의 다른 단계는 정량화 방지 할 과부하시키지 않고 양호한 감도 분리를 허용하는 분사량 (분사 시간)을 조정하는 것을 포함 할 수있다. 긴 주입 시간은 모세관 오버로딩 나타내는 피크 형상의 왜곡을 초래할 동안 짧은 분사 시간은 감소 된 감도 리드 : 10 초 사출 시간은 30 밀리바 (도 4b)에서 최적으로 간주된다.
실시간 모니터링의 중요성
ove_content ">이 CE 기반 방법의 중요한 강도를 실시간으로 반응을 모니터링 할 수있는 능력이다.이 검출하고, 관련 반응 (들)의 분리 및 / 또는 제품 (들). 또한,이 대 최적 CE 조건을 필요 적절한 시간 제로 반응의 기준으로 취해 져야 화학 반응의 분석]. 이는 일반적으로, 반응 직전이 시작 칭량 반응물의 분리 특정 반응물이 도입되기 이전의 예에 대해 수행 될 수 있고, 이전에 이루어져 온도 증가 또는 UV 조사 전에 반응을 유발하기 시작한다.(다른 기판 상 키토산 또는 상) RGDS 펩티드의 이식의 경우에, 펩티드는 중축 내지 18의 선형 또는 분 지형 올리고머 구조를 생성하기 위해 그 자체로 반응 할 수있다. RGDS 아민과 카르 복실 산 작용기가 모두 포함되어 있기 때문입니다. 이러한 펩티드 올리고머 동일한 전자 없어lectrophoretic 초기 펩타이드 RGDS로 이동하기 때문에 다른 종 예를 공동 마이그레이션을 통해 부정확 한 정량의 원인이 될 수 있습니다. 이 반응 매질의 분취 액을 주입하고, 반응 매질 (도 4b)에서 촬영되는 몇 분 이내에 분리되는 것을 보장하는 것이 중요하다.
키토산 필름의 적절한 준비
특히 키토산 필름을 처리 할 때 준수하기 위해 여러 단계가있다. 키토산 필름의 제조 중에, 필름은 최소 7 일 (바람직하게는 그 이상) 동안 건조 남아있을 필요가있다. 이 완료되지 않으면, 필름을 PBS 버퍼에 배치하는 경우가 아닌 용해 후 다음 단계를 방해하는 부푼 필름을 형성한다 린스한다. 또한, 필름 밖으로 침출과 경쟁 할 수있다 나머지 아세트산을 제거하기 위해 그 래프팅 반응 전에 필름을 중화하는 것이 중요그 래프팅 반응 18 펩티드. 이 묽은 수산화 나트륨 수용액 또는 PBS에 침지 통해 수행 될 수있다. 그 래프팅 반응 용매로 사용되는 버퍼의 pH는 또한 중요하다 : 그것은 필름을 부분적으로 또는 완전히 용해 너무 산성 인 경우. 그 래프팅 반응 중에 필름을 반응 용액 최대 접촉을 할 수있는 것이 중요하다. 따라서, 필름 및 반응 혼합물을 함유하는 페트리 접시 쉐이커 상에 배치된다. 이는 부정확 정량화의 결과로 제어되지 않는 농도의 변동을 방지하기 위해 반응 혼합물의 증발을 방지하는 것이 필수적이다; 페트리 접시를 덮는 파라핀 필름의 사용을 방지하는 것이 효과적이다.
세륨 기술의 주요 제한은 개별적으로 그 래프팅 방법을 확인할 수 없다는 것이다. 상술 한 화학적 그 래프팅 방법의 맥락에서, 펩티드 래프팅의 정량은 간접적이다. 이전술 한 바와 같은 고체 상태 NMR 분광법으로 보완 기술을 이용하여 극복 될 수있다. 세륨 기술의 다른 한계는 관심의 화합물을 청구하는 데 필요한 포함되어 있습니다. 따라서 중성 종 동시에 이주된다. 어떤 경우에는이 붕산과 관심 착체 화합물의 경우 극복 될 수있다. 관심있는 화합물은 UV 발색단 이외에 검출을 포함하지 않는 경우 최종적으로 전도성 같은 사용될 필요가있다. 이 최적화를 필요로하는 전도도 검출기의 추가 구입이 필요합니다.
다른 분석 방법 대 CE를 통해 분석 펩타이드 이식의 장점
세륨 방법은 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC), 아미노산 분석 (AAA) 및 NMR 분광법의 직접적인 방법을 포함하여 다른 간접적 인 방법에 비해 여러 가지 장점을 갖는다. AAA에 비해 그것은 높은 처리량 강력한 방법 whic시간은 지루한 샘플 준비없이 효율적으로 복잡한 시료를 분석 할 수 있습니다. 이것은 특히 실시간 화학 반응의 분석에 유리하다. HPLC는 펩티드 분석 (30) 접목을 위해 이전에 사용 된, 그러나 그것은 단지 반 정량적 인 것으로 간주되었다. CE는 HPLC보다 낮은 운전 비용이 샘플 (5)의 손실을 최소화, 분석 전에 샘플을 여과를 필요로하지 않는다. 13 C NMR 스펙트럼 직접 관심있는 제품을 측정 할 수 있지만, 비용이 많이 드는 기법과 실시간으로 측정 할 수 없다.
여기 descripted 프로토콜은 키토산 막 이식 펩티드를 최적화하기위한 신속하고 효율적 저렴하고 신뢰할 수있는 방법을 제공한다. 이 새로운 방법은 이와 같은 크로마토 그래피 및 AAA와 같은 전통적으로 사용되는 방법에 비해, 키토산 필름의 세포 부착 성을 조정하는 중요한 장점을 제공한다. 이 방법은 CE들을 감시하는데 사용될 수있다실시간으로 다른 화학 반응의 일반적 반응은 반응물이 / 관심의 제품을 충전 할 수있는 몇 시간의 기간에 발생. 이 경우, CE 방법 성공적인 분석을 허용하는 다양한 화학 반응의 분석 이전에 최적화되어야한다는 것을주의하는 것이 중요하지만. 이것은 그들을 식별하고 검출 및 분리 될 수있는 것을 보장 할 수 있도록, 그리고 어떠한 오염물 정량을 방지하지 않을 수 있도록 반응에 앞서 순수한 반응물 및 생성물의 분석을 포함한다. 분리 향상시킬 수 있으며, 총 분석 시간은 모세관 길이, 버퍼 조성물 및 전압 변화 및 잠재적으로 코팅 벽 모세관을 사용하여 변경. 검출은 시료가 충전 된 반응물을 유리하게 주입되는 조건을 수정하거나 모세관으로 샘플의 더 큰 양을 주입함으로써 개선 될 수있다. 또한, UV 검출에서 떨어져 다른 검출기는 수 b형광 비접촉 전도성 감지기 또는 CE 포함 채용 전자는 질량 분석에 연결될 수있다. 실시간으로 반응을 모니터링 할 수있는 능력은 기판 용액이며 CE 분석 할 수있는 경우 CE 바이알에 직접 수행되는 그 래프팅 반응을 가능하게한다. 우리는 최근에 폴리 (아크릴산)의 안티피린의 그 래프팅을 위해 수행 이것은도 7은 부가 적으로, 방법은 그래프트 반응에 한정되지 않고, 다양한 화학 반응을 모니터링하기 위해 확장 될 수 있고, CE 기기 내부에서 직접 일어날 수있다. 또한, 반응의 모니터링이 반응의 최적화를 허용하며, 반응의 생성물을 검증하기 위해 사용될 수있다. 관심있는 화합물이 용해 충전 할 수있는 한, CE 방법은 빠르고, 저렴하고 강력한 분리, 검출 및 정량화 할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water | Millipore | All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality | |
| Chitosan powder (medium molecular weight) | Sigma-Aldrich | 448877 | lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides |
| Acetic acid - Unilab | Ajax Finechem | 2-2.5L GL | laboratory reagent |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | laboratory reagent, corrosive |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | Irritant to skin |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | Irritant to skin |
| Sodium chloride | Ajax Finechem | 466-500G | laboratory reagent |
| Potassium chloride - Univar | Ajax Finechem | 384-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Disodium hydrogen phosphate - Unilab | Ajax Finechem | 1234-500G | laboratory reagent, slight skin irritant |
| Potassium dihydrogen phosphate - Univar | Ajax Finechem | 4745-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Oligoacrylate standard | custom made | See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46 | |
| Boric acid | BDH AnalR, Merck Pty Ltd | 10058 | Corrosive |
| Hydrochloric acid - Unilab | Ajax Finechem | A1367-2.5L | laboratory reagent, corrosivie |
| Fused silica tubing | Polymicro (Molex) | TSP050375 | Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies | G7100CE | Capillary electrophoresis instrument |
| Orbital shaker | IKA | KS260 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo | MS204S | |
| Milli-Q Synthesis | Millipore | ZMQS5VF01 | Ultrapure water filtration system |
| Parafilm | Labtek | PM966 | Parrafin wax |
References
- Muthukumar, M. Theory of electrophoretic mobility of a polyelectrolyte in semidilute solutions of neutral polymers. Electrophoresis. 17, 1167-1172 (1996).
- Barrat, J. L., Joanny, J. F. in Advances in Chemical Physics, Vol Xciv Vol. 94 Advances in Chemical Physics. , John Wiley & Sons Inc. 1-66 (1996).
- Fu, S. L., Lucy, C. A. Prediction of electrophoretic mobilities. 1. Monoamines. Anal. Chem. 70, 173-181 (1998).
- Harvey, D. Modern Analytical Chemistry. , McGraw Hill. (2000).
- Oliver, J. D., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust determination of monosaccharides in plant fibers in complex mixtures by capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 1291, 179-186 (2013).
- Oliver, J. D., Sutton, A. T., Karu, N., Phillips, M., Markham, J., Peiris, P., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust monitoring of ethanol fermentations by capillary electrophoresis. Biotechnology and Applied Biochemistry. 62, 329-342 (2015).
- Thevarajah, J. J., Sutton, A. T., Maniego, A. R., Whitty, E. G., Harrisson, S., Cottet, H., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantifying the Heterogeneity of Chemical Structures in Complex Charged Polymers through the Dispersity of Their Distributions of Electrophoretic Mobilities or of Compositions. Anal. Chem. 88, 1674-1681 (2016).
- Toutounji, M. R., Van Leeuwen, M. P., Oliver, J. D., Shrestha, A. K., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantification of sugars in breakfast cereals using capillary electrophoresis. Carbohydr. Res. 408, 134-141 (2015).
- Miramon, H., Cavelier, F., Martinez, J., Cottet, H. Highly Resolutive Separations of Hardly Soluble Synthetic Polypeptides by Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 82, 394-399 (2010).
- Mnatsakanyan, M., Thevarajah, J. J., Roi, R. S., Lauto, A., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of chitosan by degree of acetylation using simple free solution capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 405, 6873-6877 (2013).
- Taylor, D. L., Ferris, C. J., Maniego, A. R., Castignolles, P., in het Panhuis, M., Gaborieau, M. Characterization of Gellan Gum by Capillary Electrophoresis. Australian Journal of Chemistry. 65, 1156-1164 (2012).
- Thevarajah, J. J., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation and characterization of synthetic polyelectrolytes and polysaccharides with capillary electrophoresis. Adv. Chem. 2014, 798503 (2014).
- Sutton, A. T., Read, E., Maniego, A. R., Thevarajah, J., Marty, J. -D., Destarac, M., Gaborieau, M., Castignolles, P. Purity of double hydrophilic block copolymers revealed by capillary electrophoresis in the critical conditions. J. Chromatogr. A. 1372, 187-195 (2014).
- Righetti, P. G., Sebastiano, R., Citterio, A. Capillary electrophoresis and isoelectric focusing in peptide and protein analysis. Proteomics. 13, 325-340 (2013).
- Ali, I., Al-Othman, Z. A., Al-Warthan, A., Asnin, L., Chudinov, A. Advances in chiral separations of small peptides by capillary electrophoresis and chromatography. J. Sep. Sci. 37, 2447-2466 (2014).
- Kasicka, V. Recent developments in capillary and microchip electroseparations of peptides (2011-2013). Electrophoresis. 35, 69-95 (2014).
- JoVE Science Education Database. Capillary Electrophoresis (CE). Essentials of Analytical Chemistry. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/10226/capillary-electrophoresis-ce (2016).
- Taylor, D. L., Thevarajah, J. J., Narayan, D. K., Murphy, P., Mangala, M. M., Lim, S., Wuhrer, R., Lefay, C., O'Connor, M. D., Gaborieau, M., Castignolles, P. Real-time monitoring of peptide grafting onto chitosan films using capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 407, 2543-2555 (2015).
- Rinaudo, M. Chitin and chitosan: Properties and applications. Prog. Polym. Sci. 31, 603-632 (2006).
- Li, Z., Leung, M., Hopper, R., Ellenbogen, R., Zhang, M. Feeder-free self-renewal of human embryonic stem cells in 3D porous natural polymer scaffolds. Biomaterials. 31, 404-412 (2010).
- Domard, A. A perspective on 30 years research on chitin and chitosan. Carbohydr. Polym. 84, 696-703 (2011).
- Shekaran, A., Garcia, A. J. Nanoscale engineering of extracellular matrix-mimetic bioadhesive surfaces and implants for tissue engineering. Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj. 1810, 350-360 (2011).
- Custodio, C. A., Alves, C. M., Reis, R. L., Mano, J. F. Immobilization of fibronectin in chitosan substrates improves cell adhesion and proliferation. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 316-323 (2010).
- Boateng, S. Y., Lateef, S. S., Mosley, W., Hartman, T. J., Hanley, L., Russell, B. RGD and YIGSR synthetic peptides facilitate cellular adhesion identical to that of laminin and fibronectin but alter the physiology of neonatal cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 288, C30-C38 (2005).
- Lefay, C., Guillaneuf, Y., Moreira, G., Thevarajah, J. J., Castignolles, P., Ziarelli, F., Bloch, E., Major, M., Charles, L., Gaborieau, M., Bertin, D., Gigmes, D. Heterogeneous modification of chitosan via nitroxide-mediated polymerization. Polym. Chem. 4, 322-328 (2013).
- Gartner, C., Lopez, B. L., Sierra, L., Graf, R., Spiess, H. W., Gaborieau, M. Interplay between Structure and Dynamics in Chitosan Films Investigated with Solid-State NMR, Dynamic Mechanical Analysis, and X-ray Diffraction. Biomacromolecules. 12, 1380-1386 (2011).
- Castignolles, P., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Sprong, E., Ferguson, C. J., Gilbert, R. G. High resolution separation of oligo(acrylic acid) by capillary zone electrophoresis. Macromol. Rapid Commun. 27, 42-46 (2006).
- Chamieh, J., Martin, M., Cottet, H. Quantitative Analysis in Capillary Electrophoresis: Transformation of Raw Electropherograms into Continuous Distributions. Anal. Chem. 87, 1050-1057 (2015).
- Maniego, A. R., Ang, D., Guillaneuf, Y., Lefay, C., Gigmes, D., Aldrich-Wright, J. R., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of poly(acrylic acid) salts according to topology using capillary electrophoresis in the critical conditions. Anal. Bioanal. Chem. 405, 9009-9020 (2013).
- Chung, T. W., Lu, Y. F., Wang, S. S., Lin, Y. S., Chu, S. H. Growth of human endothelial cells on photochemically grafted Gly-Arg-Gly-Asp (GRGD) chitosans. Biomaterials. 23, 4803-4809 (2002).
