Elettroforesi capillare per monitorare Peptide innesto su Chitosano film in tempo reale
Summary
Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.
Abstract
Free-soluzione elettroforesi capillare (CE) separa analiti, composti generalmente praticati in soluzione mediante l'applicazione di un campo elettrico. Rispetto ad altre tecniche di separazione analitiche quali la cromatografia, CE è economico, robusto e non richiede alcuna preparazione del campione (per un numero di matrici naturali complesse o campioni polimerici) effettivamente. CE è veloce e può essere utilizzata per seguire l'evoluzione delle miscele in tempo reale (per esempio, cinetica di reazione chimica), i segnali osservati per i composti separati sono direttamente proporzionali alla loro quantità in soluzione.
Qui, l'efficienza della CE è dimostrata per monitorare l'innesto covalente di peptidi su film chitosano per successive applicazioni biomediche. proprietà antimicrobiche e biocompatibili di Chitosano rendono un materiale interessante per applicazioni biomediche come substrati di crescita cellulare. Covalente innestando le RGDS peptide (arginina – glicina -acido aspartico – serina) sulla superficie del film chitosano mira a migliorare l'adesione cellulare. Storicamente, cromatografia e analisi amminoacidica sono stati utilizzati per fornire una misura diretta della quantità di peptide innestato. Tuttavia, la separazione rapida e assenza di preparazione del campione è fornito da CE permette il monitoraggio in tempo reale altrettanto precisa ancora del processo di innesto peptide. CE è in grado di separare e quantificare le diverse componenti della miscela di reazione: la (non innestate) peptide e gli agenti di accoppiamento chimici. In questo modo l'uso di CE traduce in film perfezionati per applicazioni a valle.
I film chitosano sono stati caratterizzati mediante spettroscopia NMR allo stato solido (risonanza magnetica nucleare). Questa tecnica è più tempo e non può essere applicato in tempo reale, ma produce una misura diretta del peptide e quindi convalida la tecnica CE.
Introduction
Soluzione libero elettroforesi capillare (CE) è una tecnica che separa composti in soluzioni basate sulla loro carica-attrito rapporto di 1,2. Rapporto Charge-to-size è spesso menzionato nella letteratura, ma questa semplificazione non si applica a polielettroliti, tra cui polipeptidi in questo lavoro, ed è stato anche dimostrato di non essere adatto per piccole molecole organiche 3. CE differisce da altre tecniche di separazione in quanto non hanno una fase stazionaria, solo uno sfondo elettrolita (di solito un buffer). Questo permette la tecnica per essere resistente nella sua capacità di analizzare una vasta gamma di campioni con matrici complesse 4 come fibre vegetali 5, infusi fermentazione 6 innesto su polimeri sintetici 7, campioni alimentari 8, e peptidi difficilmente solubili 9 senza preparazione del campione noioso e purificazione. Ciò è particolarmente significativo per polielettroliti complessi che hanno problemi di dissoluzione (iuch come chitosano 10 e gellano 11) e quindi esiste come aggregato o precipitato in soluzione e sono stati analizzati con successo senza filtrazione campione. Inoltre, l'analisi degli zuccheri in cereali per la colazione coinvolto l'iniezione di campioni con particelle di campioni di cereali per la colazione precipitato in acqua 8. Questo si estende anche all'analisi dei polielettroliti o copolimeri 12,13 ramificati. Un'ampia attività è stata completata nello sviluppo di tecniche CE specificamente per l'analisi di proteine per proteomica 14, separazione chirale di peptidi naturali o sintetici 15 e separazioni microchip di proteine e peptidi 16. Poiché la separazione e l'analisi avvengono in un capillare, solo piccoli volumi di campione e vengono utilizzati solventi che permette CE di avere un costo di esercizio inferiore rispetto ad altre tecniche di separazione compresa cromatografia 5,6,17. Poiché la separazione da CE è veloce, permette il monitoAnello di cinetica di reazione. Questo è stato dimostrato nel caso di innesto di peptidi su film chitosano per una migliore adesione cellulare 18.
Il chitosano è un polisaccaride derivato dal -deacetylation N di chitina. Film chitosano possono essere utilizzati per diverse applicazioni biomediche come bioadesivi 19 e substrati di crescita cellulare 18,20, a causa della biocompatibilità del chitosano 21. Attaccamento cellulare di specifiche proteine della matrice extracellulare, come fibronectina, collagene e laminina, è direttamente legata alla sopravvivenza delle cellule 22. In particolare, differenti tipi cellulari richiedono spesso attaccamento alle diverse proteine della matrice extracellulare per la sopravvivenza e il corretto funzionamento. Adesione cellulare ai film di chitosano ha dimostrato di essere migliorata attraverso l'innesto di fibronectina 23; tuttavia, la preparazione, la purificazione e l'innesto di tali proteine di grandi dimensioni non è economicamente sostenibile. In alternativa una serie di piccoli peptidi have stato dimostrato di essere in grado di imitare le proprietà di grandi proteine della matrice extracellulare. Ad esempio, i peptidi come i RGD mimetici fibronectina (arginina – glicina – acido aspartico) e RGDS (arginina – glicina – acido aspartico – serina) sono stati utilizzati per facilitare e rafforzare il legame delle cellule 24. Covalent innesto di RGDS Onto film chitosano ha migliorato l'adesione delle cellule per cellule conosciute da allegare alla fibronectina in vivo 18. Sostituendo le proteine più grandi piace fibronectina con peptidi più piccoli che hanno la stessa funzionalità fornisce una significativa riduzione dei costi.
Qui, peptide innesto di chitosano è stato eseguito come precedentemente pubblicato 18. Come precedentemente dimostrato, questo approccio fornisce innesto semplice ed efficace utilizzando agenti di accoppiamento EDC-HCl (1-etil-3 (3- dimetilaminopropil) carbodiimide ) e NHS (N -hydroxysuccinimide) per funzionalizzare l'acido carbossilico dei RGDS essere innestato sullapellicola chitosano. Due vantaggi di questo metodo sono innesto che non richiede alcuna modifica del chitosano o del peptide, e sono realizzati nel mezzo acquoso per massimizzare la compatibilità con le future applicazioni di coltura cellulare 18,20. Mentre gli agenti di accoppiamento e il peptide può essere caricata, CE è un metodo adatto per l'analisi delle cinetiche di reazione. È importante sottolineare che l'analisi delle cinetiche di reazione tramite CE consente il monitoraggio in tempo reale della reazione di innesto, e quindi permette sia ottimizzando e quantificare il grado di innesto.
Mentre non è normalmente necessaria, i risultati dell'analisi CE possono essere convalidati off-line da una misura diretta del peptide innesto su film chitosano utilizzando allo stato solido NMR (risonanza magnetica nucleare) spettroscopia 25,26 per dimostrare l'innesto covalente del peptide sulla pellicola 18. Tuttavia, rispetto a stato solido spettroscopia NMR, l'analisi in tempo reale fornito daCE consente la quantificazione del consumo peptide in tempo reale e quindi la capacità di valutare la cinetica di reazione.
Il suddetto metodo è semplice e consente l'analisi in tempo reale di peptide innesto su film chitosano con quantificazione indiretta del grado dell'innesto. Il metodo illustrato può essere esteso alla valutazione quantitativa in tempo reale di diverse reazioni chimiche purché i reagenti oi prodotti da analizzare può essere caricato.
Protocol
Representative Results
Discussion
La semplicità del protocollo qui descritto rende ideale per applicazione diffusa. Tuttavia, particolare attenzione deve essere prestata ai seguenti passaggi chiave.
Preparazione strumento adeguato CE
È importante separare uno standard noto immediatamente prima della separazione di campioni sconosciuti (così come al termine di una serie di separazioni) per verificare la validità del capillare e strumento il giorno. Questo standard può essere …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MG, MO’C and PC thank the Molecular Medicine Research Group at WSU for Research Seed Funding, as well as Michele Mason (WSU), Richard Wuhrer (Advanced Materials Characterisation Facility, AMCF, WSU) and Hervé Cottet (Montpellier) for discussions.
Materials
| Water | Millipore | All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality | |
| Chitosan powder (medium molecular weight) | Sigma-Aldrich | 448877 | lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides |
| Acetic acid – Unilab | Ajax Finechem | 2-2.5L GL | laboratory reagent |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | laboratory reagent, corrosive |
| RGDS | Bachem | H‐1155 | peptide, bought from Auspep Pty Ltd |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | Irritant to skin |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | Irritant to skin |
| Sodium chloride | Ajax Finechem | 466-500G | laboratory reagent |
| Potassium chloride – Univar | Ajax Finechem | 384-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Disodium hydrogen phosphate – Unilab | Ajax Finechem | 1234-500G | laboratory reagent, slight skin irritant |
| Potassium dihydrogen phosphate – Univar | Ajax Finechem | 4745-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Oligoacrylate standard | custom made | See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46 | |
| Boric acid | BDH AnalR, Merck Pty Ltd | 10058 | Corrosive |
| Hydrochloric acid – Unilab | Ajax Finechem | A1367-2.5L | laboratory reagent, corrosivie |
| Fused silica tubing | Polymicro (Molex) | TSP050375 | Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies | G7100CE | Capillary electrophoresis instrument |
| Orbital shaker | IKA | KS260 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo | MS204S | |
| Milli-Q Synthesis | Millipore | ZMQS5VF01 | Ultrapure water filtration system |
| Parafilm | Labtek | PM966 | Parrafin wax |
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