Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.
Fri-oppløsning kapillær elektroforese (CE) skiller analytter, vanligvis ladede forbindelser i oppløsning ved anvendelse av et elektrisk felt. Sammenlignet med andre analytiske separasjonsteknikker, så som kromatografi, er CE billig, robust og effektivt krever ingen prøvepreparering (for en rekke komplekse naturlige matrikser eller polymere prøver). CE er rask og kan brukes til å følge utviklingen av blandinger i sanntid (f.eks kjemisk reaksjonskinetikk), som signalene observert for de separerte forbindelsene er direkte proporsjonal med deres mengde i oppløsning.
Her blir effektiviteten av CE vist for overvåking av kovalent poding av peptider på kitosan filmer for etterfølgende biomedisinske anvendelser. Chitosan er antimikrobielle og biokompatible egenskaper gjør det til et attraktivt materiale for biomedisinske applikasjoner som cellevekst underlag. Kovalent pode peptid RGDS (arginin – glysin -asparaginsyre – serin) på overflaten av kitosan filmer tar sikte på å forbedre cellefesting. Historisk, kromatografi og aminosyreanalyse har vært brukt til å gi en direkte måling av mengden av podet peptid. Men den raske separasjon og fravær av prøveopparbeidelse levert av CE gjør like nøyaktig, men sanntids overvåking av peptidet pode prosessen. CE er i stand til å separere og kvantifisere de forskjellige komponenter i reaksjonsblandingen: den (ikke podet) peptid, og de kjemiske koblingsmidler. På denne måte kan bruk av CE resulterer i forbedrede filmer for nedstrømsapplikasjoner.
Chitosan Filmene ble karakterisert ved fast tilstand NMR (kjernemagnetisk resonans) spektroskopi. Denne teknikken er mer tidkrevende og kan ikke brukes i sann tid, men gir en direkte måling av peptidet og således validerer CE teknikk.
Gratis løsning kapillær elektroforese (CE) er en teknikk som skiller forbindelser i løsninger basert på deres kostnad-til-friksjon ratio 1,2. Charge-til-size-forholdet er ofte nevnt i litteraturen, men denne forenklingen gjelder ikke polyelektrolytter, herunder polypeptider i dette arbeidet, og ble også vist å være passende for små organiske molekyler 3. CE skiller seg fra andre separasjonsteknikker ved at den ikke har en stasjonær fase, bare en bakgrunnselektrolytt (vanligvis en buffer). Dette gjør at teknikken for å være robust i sin evne til å analysere et stort utvalg av prøver med komplekse matriser 4 som plantefibre 5, gjæring trakter 6 poding på syntetiske polymerer 7, matvareprøver 8, og knapt oppløselige peptider 9 uten tidkrevende prøvepreparering og rensing. Dette er spesielt viktig for komplekse polyelektrolytter som har oppløsningsproblemer (rUCH som kitosan 10 og gellangummi 11) og eksisterer derfor som aggregert og utfelt i oppløsning og har blitt analysert uten prøve filtrering. Videre analyse av sukker i frokostblandinger involvert injisere prøver med partikler av frokostblanding prøver utfelt i vann 8. Dette strekker seg også til analysen av forgrenede polyelektrolytter eller kopolymerer 12,13. Omfattende arbeid har også blitt gjennomført i utviklingen av CE teknikker spesielt for analyse av proteiner for proteomikk 14, kiralt separasjon av naturlige eller syntetiske peptider 15 og microchip separasjoner av proteiner og peptider 16. Etter separasjon og analyse finner sted i et kapillar, er bare små volumer av prøve og oppløsningsmidler brukes som muliggjør CE for å ha en lavere driftskostnader enn andre separasjonsteknikker, inkludert kromatografi 5,6,17. Siden separasjon ved CE er rask, gjør det industriering av reaksjonskinetikk. Dette ble demonstrert i tilfelle av podingen av peptider på kitosan filmer for forbedret celleadhesjon 18.
Chitosan er et polysakkarid som stammer fra den N -deacetylation av kitin. Chitosan filmer kan anvendes for forskjellige biomedisinske anvendelser slik som bioadhesiver 19 og celledyrkingsunderlag 18,20, på grunn av kitosan er biokompatibilitet 21. Cellebinding til spesifikke ekstracellulære matriseproteiner, så som fibronektin, kollagen og laminin, er direkte knyttet til overlevelse av cellene 22. Spesielt, ulike celletyper krever ofte tilknytning til forskjellige ekstracellulære matrix proteiner for å overleve og riktig funksjon. Cellebinding til kitosan filmer viste seg å bli forbedret ved poding av fibronektin 23; men er forberedelse, rensing og poding av slike store proteiner ikke økonomisk forsvarlig. Alternativt en rekke små peptider have vist seg å være i stand til å etterligne egenskapene til store ekstracellulære matriksproteiner. For eksempel, peptider så som fibronektin-mimetika RGD (arginin – glycin – asparaginsyre) og RGDS (arginin – glycin – asparaginsyre – serin) har blitt brukt for å lette og øke cellefesting 24. Kovalent poding av RGDS ut mot kitosan filmer resultert i forbedret cellebinding for celler som er kjent for å feste til fibronektin in vivo 18. Erstatte større proteiner liker fibronektin med mindre peptider som har samme funksjonalitet gir en betydelig kostnadsreduksjon.
Her, peptid poding til kitosan ble utført som tidligere utgitt 18. Som tidligere vist, gir denne fremgangsmåten enkel og effektiv poding ved hjelp av koblingsmidler EDC-HCl (1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid) og NHS (N-hydroksysuccinimid) for å funksjonalisere karboksylsyren av RGDS å være podet påkitosan film. To fordeler ved denne podefremgangsmåten er at den ikke krever noen modifikasjon av chitosan eller av peptidet, og det er foretatt i vandig medium for å maksimere kompatibilitet med fremtidige cellekultur anvendelser 18,20. Som koblingsmidler og peptidet kan lades, er CE en egnet metode for analyse av reaksjonskinetikken. Viktigere, analyse av reaksjonskinetikken via CE muliggjør sanntidsovervåking av pode reaksjon, og dermed gjør det mulig både å optimalisere og kvantifisere graden av pode.
Selv om det ikke er rutinemessig er nødvendig, kan resultatene av CE-analyse valideres off-line ved en direkte måling av peptidet poding på kitosan filmene ved hjelp av faststoff NMR (kjernemagnetisk resonans) spektroskopi 25,26 for å demonstrere den kovalente pode av peptidet på filmen 18. Men sammenlignet med faststoff-tilstand NMR-spektroskopi, analyse av sanntids levert avCE muliggjør kvantifisering av peptidet forbruk i sanntid, og dermed evnen til å vurdere reaksjonskinetikken.
Den ovennevnte metode er enkel og gjør det mulig for sanntids analyse av peptid poding på kitosan filmer med indirekte kvantifisering av graden av poding. Den viste metode kan utvides til den virkelige tid kvantitativ vurdering av forskjellige kjemiske reaksjoner så lenge reaktantene eller produktene som skal analyseres kan belastes.
Enkelheten av protokollen beskrevet her gjør den ideell til omfattende søknad. Men trenger spesiell oppmerksomhet rettes mot følgende viktige skritt.
Riktig CE instrument forberedelse
Det er viktig å skille en kjent standard umiddelbart før separeringen av ukjente prøver (så vel som ved enden av en serie separasjoner) for å kontrollere gyldigheten av kapillaren og instrumentet på dagen. Denne standarden kan være en oligoacrylate 27…
The authors have nothing to disclose.
MG, MO’C and PC thank the Molecular Medicine Research Group at WSU for Research Seed Funding, as well as Michele Mason (WSU), Richard Wuhrer (Advanced Materials Characterisation Facility, AMCF, WSU) and Hervé Cottet (Montpellier) for discussions.
Water | Millipore | All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality | |
Chitosan powder (medium molecular weight) | Sigma-Aldrich | 448877 | lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides |
Acetic acid – Unilab | Ajax Finechem | 2-2.5L GL | laboratory reagent |
Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | laboratory reagent, corrosive |
RGDS | Bachem | H‐1155 | peptide, bought from Auspep Pty Ltd |
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | Irritant to skin |
N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | Irritant to skin |
Sodium chloride | Ajax Finechem | 466-500G | laboratory reagent |
Potassium chloride – Univar | Ajax Finechem | 384-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
Disodium hydrogen phosphate – Unilab | Ajax Finechem | 1234-500G | laboratory reagent, slight skin irritant |
Potassium dihydrogen phosphate – Univar | Ajax Finechem | 4745-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
Oligoacrylate standard | custom made | See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46 | |
Boric acid | BDH AnalR, Merck Pty Ltd | 10058 | Corrosive |
Hydrochloric acid – Unilab | Ajax Finechem | A1367-2.5L | laboratory reagent, corrosivie |
Fused silica tubing | Polymicro (Molex) | TSP050375 | Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter |
Agilent 7100 CE | Agilent Technologies | G7100CE | Capillary electrophoresis instrument |
Orbital shaker | IKA | KS260 | |
Electronic balance | Mettler Toledo | MS204S | |
Milli-Q Synthesis | Millipore | ZMQS5VF01 | Ultrapure water filtration system |
Parafilm | Labtek | PM966 | Parrafin wax |