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Biology

Adenofection：用于研究分子伴侣在细胞地貌被耗尽，救援实验中的角色方法

Published: September 16, 2016 doi: 10.3791/54557
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1,2, 1,2, 1,2
1Département de biologie moléculaire, biochimie médicale et pathologie, Faculté de médecine, Centre de recherche sur le cancer de l'Université Laval, 2Oncology, Centre de recherche du CHU de Québec, Université Laval, 3Laboratoire d'études moléculaires des valvulopathies (LEMV), Groupe de recherche en valvulopathies (GRV), Quebec Heart and Lung Institute/Research Center, 4Department of Surgery, Université Laval

Abstract

细胞过程，例如有丝分裂和细胞分化是通过细胞形状的变化在很大程度上依赖于细胞骨架结构的适当改造管辖。这涉及到更高阶的大分子结构的在给定时间和地点的组装拆卸，这个过程是引起的蛋白质的过表达干扰特别敏感。方法，可以保留蛋白质稳态和维持近到正常细胞形态是高度理想的是确定感兴趣的蛋白在广泛的细胞过程的功能的贡献。基于RNA干扰瞬态枯竭救援实验是分析蛋白质的功能和结构要求强大的方法。然而，从它的生理水平最小偏差靶蛋白的重新引入是一个真正的挑战。在这里，我们描述了开发研究的分子伴侣的作用的方法称为adenofection的在分裂细胞的正常d动作伙伴和肌动蛋白重塑的关系。 HeLa细胞耗尽BAG3与siRNA双链体靶向3'UTR区。 GFP标记BAG3蛋白同时再引入使用耦合到转染试剂重组腺病毒的细胞的> 75％。启用Adenofection表示在耗尽BAG3在HeLa细胞中接近生理水平BAG3-GFP蛋白，在不存在应激反应。观察内源性热休克蛋白分子伴侣蛋白动态平衡的主要胁迫诱导监管的水平没有影响。此外，通过添加杆状病毒驱动的荧光标记物的表达在细胞转导转染时，我们可以通过时间推移显微解剖的有丝分裂细胞动力学与正常的有丝分裂进展的最小扰动的分析。 Adenofection也适用于难以感染小鼠细胞，并适合于成肌细胞的diff功能分析erentiation成肌管。因此adenofection提供了一个通用的方法来进行参与依赖于高阶骨架动力学敏感的生物过程的蛋白的结构与功能分析。

Introduction

在哺乳动物细胞中基因表达的功能失活的金标准解剖蛋白质的功能。新开发的基础上，利用位点特异性核酸酶如锌指核酸酶的基因组编辑的技术和聚集定期相互间隔短回文重复序列（CRISPR）/ CAS9现在允许的有针对性的基因缺失和突变1,2-细胞系的产生。这些新的方法应该彻底改变我们正在研究蛋白质的功能和我们人类疾病的遗传学的理解方式。在一些情况下，然而，长期或完整基因敲除是不希望的，并可能会引起二次电池的补偿机制。遗传修饰的细胞系的产生，也可与原代细胞培养用有限增殖的能力，或当一大组在各种细胞类型的突变的筛查寻求处理时限制。这经常需要用于确定小区b的依赖性对蛋白质的结构要求iological过程。为此，通过RNA干扰，能够在各种细胞背景短暂枯竭救援实验可逆击倒仍然是一个简单而强大的方式来执行的利率3蛋白的结构与功能分析。但是，这种方法的主要缺点是难以实现高效的沉默和重新引入的在接近生理水平的兴趣或它的变体的蛋白质中的大多数细胞群。这是至关重要的，以使全面研究试图关联在单个细胞（亚效等位基因表型）与那些在小区基于人口的分析可见，例如在蛋白质 - 蛋白质相互作用的水平可见的作用效果。

使用传统的转染方法，人们很难达到一个人口众多的细胞外源性蛋白质的同质和低表达。重组病毒的细胞转导像腺病毒往往使外源蛋白质的更标准化的表达。然而，腺病毒的摄取是由CAR受体，其是在非人类细胞中不存在或仅在某些人类细胞类型弱表达限定。此外，腺病毒的细胞进入激活信令调节细胞形状和粘附4-6通路。研究细胞地貌的调节机制时，这显然是不理想的。当我们进行了伴侣复杂，BAG3-HSPB8的功能分析，在细胞分裂和肌动蛋白，我们正面临着这个问题。开拓性的工作压力7,8期间描述的蛋白质的质量控制和自噬这个伴侣复合作用。大部分这些研究，然而，依赖于蛋白表达，假定分子伴侣被应力过程中通常上调。这已经离开开放是否BAG3的问题，在与HSPB8复杂，可以向表达个分裂的细胞的正常运行ESE伴侣像许多癌细胞类型9。特别是，无论是伴侣复合有助于控制有丝分裂的进展非常感兴趣，因为HSPB伴侣和细胞骨架的动态10之间的连接出现基于肌动蛋白结构的重塑。为了解决这个问题，我们寻求发展为耗尽救援实验一种有效的方法，将不与有丝分裂进展或细胞形态干扰，并且这将保留蛋白质稳态避免大分子复合物的动力学的二次扰动调节细胞形状的改变。因此理想情况下，应同时进行的感兴趣的基因的耗尽加回。

腺病毒的复合物与阳离子聚合物或脂质的使用已被描述为促进在体外和体内 11,12基因转移。例如，磷酸钙（CAPI）出现以形成沉淀腺病毒增强通过CAR-独立通路13病毒绑定条目。事实上，我们发现，基于腺病毒的细胞转导和转染结合的阳离子化合物可增强耗尽救援实验的效率。这允许我们通过3-降低病毒的量至20倍，这取决于从更广泛的窗口的细胞系和感兴趣的基因，并从中受益，以便在大多数附近内源水平来调整外源蛋白的表达的对细胞形态的影响降到最低的兴趣的细胞群。在这种情况下，我们也可以实现内源蛋白质表达（> 75％）的高效率击倒。我们特此通过步骤描述了方法步骤，并提供证据表明，由热休克蛋白家族的应激诱导的分子伴侣的不变的水平所评估蛋白质稳态不显著扰动，使得该方法适于生理RO的功能分析按时间推移视频显微镜分子伴侣乐。该协议是适合于细胞的同步程序，并有丝分裂进展过程中使用可商购的杆状病毒为低水平荧光标记的，与正常的肌动蛋白为基础的和主轴动力学干扰最小的共表达。我们进一步显示的方法中，这是适用于“硬转导”小鼠C2C12细胞，对成肌细胞分化无显著影响到体外肌管的通用性。

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Protocol

1.中等和解决方案的准备（所有无菌过滤）

  1. C2C12小鼠肌肉细胞（分化的研究）
    1. 制成500毫升之生长培养基中对C2C12细胞培养维护：补充有10％FBS和2mM L-谷氨酰胺的DMEM高糖。
    2. 对C2C12分化制备100ml分化培养基（DM）：补充有2％马血清的DMEM高糖。
  2. HeLa细胞（在有丝分裂细胞研究）
    1. 制成500毫升之αMEM对于海拉RFP-H2B细胞培养维持和实验：αMEM补充有10％FBS和2mM L-谷氨酰胺（αMEM10％）。
    2. 制成500毫升之αMEM-减去（无脱氧核糖核苷/核糖核苷），用于海拉RFP-H2B细胞同步：αMEM-减去补充有10％FBS和2mM L-谷氨酰胺（αMEM减10％）。
    3. 准备20毫升αMEM无酚红的海拉-RFP-H2B升IVE细胞采集：αMEM无酚红补充有10％FBS和2mM L-谷氨酰胺。
    4. 准备100毫米胸苷：涡旋1毫升水2 O溶解24.2毫克，37℃。过滤消毒，并保持在4℃。
  3. 共同的解决办法
    1. 制备0.05％胰蛋白酶/ EDTA：0.05％胰蛋白酶，0.625毫摩尔EDTA于1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。过滤消毒和储存等分在-20℃。一旦解冻，等分保持在4℃。
    2. 制备HBS2x：280毫摩尔NaCl，50毫米的HEPES，1.5毫摩尔的 Na 2 HPO 4。调节pH恰好之间7.01-7.05用10N的NaOH。过滤消毒，并保持在4℃。

2.海拉-RFP-H2B细胞纤维连接蛋白和电镀细胞培养板的涂层

注意：在此之前的实验中，每个操作器应设置的最佳细胞电镀条件的细胞达到一个适当的密度，因为变化可以OC每个机械手和每个不同的细胞线之间CUR。

  1. 在实验的前一天，展开的HeLa-RFP-H2B细胞，以确保它们的增长上电镀的天指数期之内。使10厘米板块连续2 1/3稀释从80％汇合1×10厘米板开始。
    注：计划在实验板的数量。计算每个条件为重复，一个用于短期活细胞成像，一个用于蛋白提取物，以确定击倒和外源蛋白的表达通过Western印迹分析的效力。计划一个附加板，以确定前，病毒转导的细胞数。
  2. 事先用10微克/毫升纤连蛋白与细胞电镀，涂层玻璃底菜肴。 1ml的1加100稀释的1mg / ml的纤连蛋白？35毫米（稀释在无菌1×PBS中）菜以及覆盖整个表面，并在37℃，5％的CO 2下孵育1小时。
  3. 在培育期间，预温αMEM补充的Wi第10％FBS（αMEM10％）和0.05％胰蛋白酶/ EDTA中，在37℃。
  4. 孵育45分钟后，开始准备的细胞溶液。在无菌罩，吸从10cm平板培养基中，用1.5ml 0.05％胰蛋白酶/ EDTA轻轻漂洗两​​次，并留下0.5毫升胰蛋白酶/ EDTA的在最后愿望。
  5. 孵育2-3分钟将细胞在37℃，5％ 的 CO 2。轻轻拍打在显微镜下板和观察，验证所有细胞已被分离。加入10毫升αMEM10％和吸管轻轻几次以分离细胞。算使用血球细胞悬液的10微升样品。
  6. 从玻璃底菜吸纤维连接蛋白的解决方案。不要让纤连蛋白细胞接种之前干。
  7. 板1.5×10每35mm培养皿5个细胞于2mlαMEM10％，并在37℃，5％的CO 2下孵育。后在显微镜下30-45分钟验证细胞以及国家环保总局额定的，因为它们在板的中心积聚的倾向。
  8. 如果有必要，搅动板轻轻交叉方式重新分配细胞。板一次35毫米的钢板附加一些条件才能算之前，病毒转导的细胞数量。
  9. 生长细胞直到第二天，以达到至少50％的细胞密度。的细胞密度在病毒转导效率显著降低低于50％的结果，增加每细胞的蛋白表达的变化，以及增加的细胞毒性。
    注：使用纤连蛋白的玻璃涂层的菜肴改善细胞的生长和形态，促进有丝分裂细胞的正常发展。它通常可通过市售的明胶是便宜更换。

3.腺病毒转导和内源蛋白通过siRNA转染在HeLa-RFP-H2B细胞击倒使用CAPI沉淀

注意！工作与病毒ING需要特殊的预防措施，并且一直在与病毒接触的所有材料的妥善处置。

注意！在我们的手中，CAPI沉淀往往有更多的不良影响，例如对涉及囊泡运输（ 例如 ，自噬）生物过程。因此，建议使用阳离子脂质转染试剂（见下文）和分析前等待至少48小时。

注：对照腺病毒携带不相关的基因（ 即，LacZ基因）或没有基因被用来达到使用重组腺病毒携带目的基因的最低量的最小的MOI在所有Adenofections（10-20 PFU /细胞）。

注意：此过程已被证明有助于在大细胞群体每个细胞正火表达。

  1. 细胞铺板后一天，计数细胞从额外镀盘的数目。吸出介质并用1ml 0.05％胰蛋白酶/ EDTA冲洗一次。加再次1毫升0.05％胰蛋白酶/ EDTA中，并在37℃，5％CO 2孵育，直到所有的细胞脱离。分离细胞使用1ml的吸管孔和计数使用血球每毫升的细胞数。
  2. 确定转导的细胞所需的病毒的量在感染复数的兴趣点（POI）的蛋白质的每单元2噬斑形成单位（PFU），并每一个空载体的细胞18 PFU（MOI）（ 例如，LacZ基因）有一个总每个细胞20 PFU的。同时转导各杆状病毒（肌动蛋白和αTubulin，GF​​P和RFP标记分别）的4 PFU。使用以下adenofection协议转导的细胞。如在Fuchs 等人所述，使用病毒。14
  3. 在无菌罩准备1.5毫升的塑料管各自的条件，并添加400微升温暖αMEM减10％。
  4. 在冰上解冻的病毒的等分试样慢慢和，如果需要的话，稀释吨他病毒的股票，以吸取体积大于1微升，以尽量减少移液错误。
  5. 每个条件计算出的病毒量加入含400微升αMEM减10％，每次1.5毫升的塑料管中，吹打轻轻拌匀。放置病毒库存立即回在-80℃，以保持它的活性。
  6. 吸从细胞培养基中并轻轻吸取病毒混合逐滴。孵育细胞在37℃，5％的CO 2，并仔细搅动板无菌罩下每15分钟1小时，以及覆盖该病毒的细胞。使用介质的少量促进病毒与细胞的接触。
  7. 孵育后，轻轻吸取1.6毫升αMEM减10％至各板，以获得为2ml的总体积，加入2毫胸苷开始单元同步，并孵育另外2小时的细胞在37℃，5％CO 2的。
  8. 同时，准备转染混合followi纳克的CAPI转染方法（ 见图1）。如果没有的siRNA是必要的，通过无菌水取代的siRNA的量来执行空转染 。
  9. 计算200微升混合物为每个条件，导致400微升每重复。下面的例子给出了为50nM的终siRNA的浓度，并以适于每个感兴趣的蛋白质。在1.5ml的塑料管，移液管加入50μl1M的氯化钙2和11微升20μM的siRNA导入139微升无菌的 H 2 O和通过涡旋混合。一个快速旋转后，小心加入逐滴加入200μlHBS2x（280毫米氯化钠，50毫米的HEPES，1.5毫米的 Na 2 HPO 4，pH值7.01-7.05）。
    注：较小的液​​滴越小是析出物，从而得到更好的转染效率。轻轻空气喷射用200μl移液器混合三次。
  10. 在室温下孵育30分钟的混合。缓慢加入逐滴加入200μl转染混合物到每个板搅拌交叉明智的。传送板在37℃，5％CO 2的16小时。
  11. 第二天，冲洗细胞两次用2毫升温的HEPES（6.7毫米氯化钾，150mM的氯化钠，10mM的HEPES，pH值7.3）和加2mlαMEM减10％。具有四个以上的细胞板在一时间不继续进行，因为在温度变化影响的细胞周期的长度。
  12. 可视化倒置荧光显微镜下的感染效率在20-40x（空气）的放大倍数，并在文档荧光和传输信道获取每个条件三个有代表性的图像。七小时后，在37℃，5％CO 2的添加2mM的胸苷并孵育另外16小时。
  13. 第二天，转染和病毒感染后48小时，冲洗细胞两次用2毫升温的磷酸盐缓冲盐水（PBS），并在2毫升αMEM10％释放7小时的w / o酚红对活细胞成像或酚红蛋白的提取。
  14. 收获细胞每个条件48小时转染后用于制备蛋白质提取物和Western印迹分析，以确定击倒的效率和内源性蛋白15的表达。
    注意：使用抗体对感兴趣的蛋白质以及作为装载对照适当抗体。击倒的效率应通过加载控制细胞裂解物减少量（与对照siRNA转染的）来确定，以提供一个滴定曲线（即 1，½，¼，⅛）。

4.腺病毒转导和内源蛋白通过siRNA转染中使用阳离子脂质转染试剂HeLa细胞击倒

注意：在这里，我们提出了适于不涉及细胞同步实验的协议和/或当siRNA转染不能由CAPI的方法进行，例如，以避免在某些细胞林不希望的毒性作用上课。该协议还包括为了在合适的细胞密度工作adenofection后的细胞replating步骤。我们只测试了阳离子脂质转染试剂。

注意！有病毒的工作需要特殊的预防措施，并且一直在与病毒接触的所有材料的妥善处置。

  1. 板每35mm培养皿1.75×10 5个细胞在2.5mlαMEM10％，并在37℃下孵育，5％ 的 CO 2。板一次35毫米的钢板附加一些条件才能算之前，病毒转导的细胞数量。
  2. 生长细胞直到第二天，以达到至少50％的细胞密度。在病毒转导效率的显著下降小于50％的结果的细胞密度，增加每细胞的蛋白表达的变化，以及增加的细胞毒性。
  3. 细胞铺板后一天，计数细胞从额外镀盘的数目。吸气培养基并用1ml 0.05％胰蛋白酶/ EDTA冲洗一次。加再次1毫升0.05％胰蛋白酶/ EDTA中，并在37℃，5％CO 2孵育，直到所有的细胞脱离。单独的细胞以及用1毫升移液管和计数每ml的细胞数。
  4. 确定病毒的转导的感染复数的兴趣点（POI）的蛋白质的每个细胞20-40空斑形成单位（PFU），并每一个空载体的细胞0-20 PFU（MOI）所需的量（ 例如， LacZ的）有一个总的每个细胞40 PFU的。
  5. 在无菌罩准备1.5毫升的塑料管各自的条件，并添加400微升温暖αMEM10％。
  6. 在冰上解冻的病毒的等分试样慢慢和，如果需要的话，稀释的病毒原液以吸取的体积大于1微升，以尽量减少移液误差。
  7. 每个条件计算出的病毒量加入含400微升αMEM10％，每次1.5毫升的塑料管中，吹打轻轻拌匀。第广场病毒的股票立刻回在-80°C至保持其活性。
  8. 吸从细胞培养基中并轻轻吸取病毒混合逐滴。孵育细胞在37℃，5％的CO 2，并仔细搅动板无菌罩下每15分钟1小时，以及覆盖该病毒稀释细胞。使用介质的少量促进病毒与细胞的接触。
  9. 同时，准备下转染法的siRNA转染组合。如果没有的siRNA是必要的，由介质替换的siRNA的量无血清来执行空转染 。
    1. 下面的例子给出了为50nM的终siRNA的浓度，并以适于每个感兴趣的蛋白质。对于每个adenofection，准备一份1.5毫升含416纳米的siRNA在150微升培养基无血清（ 例如 ，6.25微升20μM的siRNA + 144微升无血清培养基）和一个1.5毫升塑料管containi塑料管NG 6.25微升阳离子脂质体转染试剂+ 144无血清培养基微升。
    2. 通过上下吹打数次用200微升吸管混合各塑料管的内容。结合两管的内容和通过上下吹打数次用200微升吸管混合。在室温下孵育5分钟。
  10. 与病毒孵育后，轻轻吸取1.8毫升αMEM10％至各板，以获得2.2毫升总体积，并立即添加慢慢逐滴所述siRNA转染混合物，以每盘和搅拌交叉明智的。传送板在37℃，5％CO 2的24小时。
  11. 第二天，再培养板上的细胞，从35个毫米的钢板成四个新35毫米板在2.5mlαMEM各占10％和孵育另外24小时，在37℃，5％ 的 CO 2。
  12. 第二天，转染和病毒感染，由一个板收获细胞用于制备的每个条件后48小时蛋白质提取物和Western印迹分析，以确定击倒的效率和内源性蛋白15的表达。
    注意：对于其余板块，继续进行细胞固定，使用所选的协议，并接受了样品与关注14抗体免疫荧光分析。

有丝分裂细胞和数据分析的5活细胞成像

  1. 用配有加湿/ 5％CO 2 /调温室的倒置显微镜上执行分裂细胞短期活细胞成像实验。
    注意：在此研究中，使用了旋转盘共聚焦显微镜（40X，0.75 NA），配备有EMCCD冷却电荷耦合照相机在-50℃下。
  2. 到收购前，请检查室已经达到37℃，适宜的温度。
    注意：这可能需要几个小时，这取决于微观系统。
  3. 放置在培养皿中的MICR的Oscope腔室采集前1小时，以使媒体的适当的平衡，并避免焦点因温度变化漂流。监测细胞的有丝分裂的状态。此时，该细胞的10-15％应在有丝分裂（前期-前中期）的早期阶段。
  4. 在平衡时间，如在现有实验确定设置的采集参数。典型地，曝光时间为.2-3秒的两个通道（488和594）为100％的激光强度和121-130灵敏度是在我们手中合适的参数。
    注意：首先测试应确定最小激光强度和采集时间/间隔导致与最小光漂白的适当的分辨率，导致细胞损伤和扰动丝分裂进程。
  5. 选择每种条件几个字段来获得细胞的显著数不超过采集间隔来分析。使用旋转盘共聚焦系统，一个典型的安装将在CLUDE四种不同的条件下，每板7场和2个颜色通道（488和594）与1.5-2分钟的时间间隔超过75分钟周期。
  6. 选择是在进入有丝分裂的细胞，重新设置，一旦所有字段已被选择的焦点并尽可能快地开始采集。
  7. 监视系统的稳定性为至少三个时间点，并在必要重新设置的焦点。
  8. 的75分钟的第一个短线活细胞成像后，有丝分裂细胞的新字段可被选择以获得第二组的电影的增加所分析细胞的数量。
  9. 确定良好定义的标准来分析所使用的细胞的有丝分裂的表型，这取决于荧光标记。在有丝分裂的缺陷可能包括延长在有丝分裂所花费的时间（从核击穿，直到后期），染色体错位，主轴摇摆，和皮层起泡14。

6. LifeAct-TagGFP2腺病毒转导Differentiatin摹C2C12成肌细胞鼠

注：adenofection协议也适用于难以感染小鼠C2C12细胞进行分化。

  1. 板2×10 5的C2C12细胞35毫米培养皿中生长培养基上的塑料或选择的基片上。
    注：细胞分化是在gelatine-或基质胶涂层的菜肴改善。计划一个附加板，以确定前，病毒转导的细胞数。
  2. 次日，将细胞应已达到会合的80％。用温热的PBS洗涤细胞两次，并加入2ml的分化培养基（DM）的诱导成肌细胞分化。
  3. 第二天，标记为分化的第1天（D1），转导腺病毒LifeAct-TagGFP2肌细胞可视化在活细胞肌动蛋白细胞骨架。根据3.2的描述从附加板计数细胞数。计算考试下面LifeAct-TagGFP2腺病毒5 PFU /细胞和45 PFU /细胞AdLacZPLE 表1中描述，总病毒量是50 PFU /细胞。描述14用于病毒
  4. 在无菌罩准备1.5毫升的塑料管各自的条件，并添加400微升温暖的DM。
  5. 在冰上解冻的病毒的等分试样慢慢和，如果需要的话，稀释的病毒原液以吸取的体积大于1微升，以尽量减少移液误差。
  6. 每种条件的病毒颗粒的适量添加到含有400微升的DM每次1.5毫升的塑料管中并通过移液轻轻混匀。放置病毒库存立即回在-80℃，以保持它的活性。
  7. 吸从菜介质，轻轻吸管混合病毒滴。孵育细胞在37℃，5％的CO 2，并仔细搅动板无菌罩下每15分钟，共1小时，以良好覆盖的病毒的细胞。
  8. 孵育后，轻轻吸取1.6毫升DM到每个板，并继续我在37℃下ncubation另外2小时，5％ 的 CO 2。
  9. 同时，准备继CAPI转染法空染混合物。计算每个条件200微升组合。使用下面的示例为400μl的混合物的总体积。
    1. 在1.5ml的塑料管，移液管加入50μl的1M的CaCl 2到150微升无菌的 H 2 O和通过涡旋混合。一个快速旋转后，小心加入逐滴加入200μlHBS2x（280毫米氯化钠，50毫米的HEPES，1.5毫米的 Na 2 HPO 4，pH值7.01-7.05）。轻轻空气喷射三次用200μl移液器混匀。
  10. 在室温下孵育30分钟的混合。慢慢地加入逐滴加入200μl转染混合物到每个板块和搅拌交叉明智的。传送板在37℃，5％CO 2的16小时。
  11. 第二天，冲洗细胞两次用2毫升温的HEPES（6.7毫米氯化钾，150mM的氯化钠，10mM的HEPES，pH值7.3）和加2ml DM。可视化INFE在20-40X（空气）的放大倍数倒置荧光显微镜下ction效率，并在文档荧光和传输信道获取每个条件三个有代表性的图像。
  12. 根据所需的实验设置，请分化成肌管了好几天。细胞可以是固定的，并随后进行免疫荧光分析或活细胞成像的研究可以进行。

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Representative Results

使用阳离子脂质BAG3-GFP的质粒DNA的转染HeLa细胞与异质表达相关，一些细胞显示的蛋白质的勉强可检测的水平和其他轴承很高BAG3水平（ 图2A）。在这些细胞中，蛋白稳态损耗由BAG3-GFP的积累成核周聚集体（ 图2A，箭头）证明。与此相反，用携带BAG3-GFP腺细胞转导显示更均匀的低表达和BAG3-GFP的精确定位（ 图2B，单独感染）。值得注意的是，除了腺病毒转导过程中的阳离子脂质（ 如腺病毒颗粒的转染）在类似的MOI显著增加每个细胞BAG3-GFP表达，而允许它保持在大多数细胞（ 图2B，Adenofection）的均匀表达。

沉淀或基于脂质体的化合物，以增加在HeLa细胞中的转导的转染效率。 图3示出了用野生型BAG3典型的实验中（WT）-GFP或BAG3（IPV）-GFP变种轴承突变废除结合的一个其伴侣伙伴HSPB8（ 图3A，3B）。与BAG3在HSPB8 7的稳定化作用相一致，BAG3的沉默导致其在BAG3 WT的再引入恢复到正常水平的HSPB8，水平一〜50％的下降，而不是由突变体的水平相似的表达的BAG3（IPV） - GFP或GFP独自一人。在这些条件下，BAG3-GFP蛋白适当内〜细胞的75-90％的局部，在核周-中心体区域（ 图3C，3D）富集。这sugg相关捐资该adenofection保存BAG3的和在细胞中的BAG3-HSPB8复杂的动态。

HSPB8和BAG3是由不同proteotoxic压力也扰乱细胞骨架proteostasis 10上调。因此，伴侣的过度表达可能潜在地扰乱大分子结构控制细胞地貌的组装，拆卸。为了评估BAG3-HSPB8非胁迫条件下的作用，它以确认蛋白质动态平衡被最低限度地由adenofection过程扰动是很重要的。为此，在热休克蛋白家族的分子伴侣的水平监测变化是蛋白稳态的状态的良好指示。如在图4中 ，由CAPI或adenofection所示脂质为基础的方法并没有显著增加内源性HSPB8和BAG3，或者说，主要的HSP70 / HSPA1伴侣系统的水平。与此相反，典型的像热休克或MG132，蛋白酶体抑制剂proteotoxic治疗，增加了在HeLa细胞中的分子伴侣cochaperone蛋白的水平。

然后我们试图确定是否adenofection过程与杆状病毒驱动肌动蛋白和微管蛋白荧光探针（BacMam-RFP肌动蛋白和GFP-αtubulin）的表达组合是适合于跟踪的有丝分裂细胞动力学。 如图5所示，HeLa细胞用对照siRNA（siCTL）的adenofection不干扰有丝分裂纺锤体动力学（绿），或在有丝分裂（ 图5A，代表共焦时间推移序列）所花费的平均时间。这些细胞显示异常的有丝分裂事件的比例为符合在癌细胞系通常观察到的有丝分裂的缺陷（〜30％-40％， 图5B）的水平。与此相反，细胞adenofected单独用特定BAG3-siRNA转（siBAG3）表现出在LEVE 1〜2倍的增加升的有丝分裂的表型的缺陷，这是单独恢复到接近水平在对照细胞由BAG3-GFP（WT），而不是由绿色荧光蛋白。此验证adenofection的适合的BAG3及其相关伴侣对调节进出有丝分裂的细胞的适当的进展，如图Fuchs等人 14细胞骨架动力学的影响的功能分析。

为了验证adenofection方法的通用性，我们随后适于协议鼠标C2C12肌细胞的分化过程中，以使F-肌动蛋白的可视化，使用可商购的腺病毒- LifeAct-GFP标记F-肌动蛋白16。 C2C12细胞被诱导分化为Adenofection前一天。使用基于CAPI-adenofection协议，非常低量的腺病毒LifeAct-GFP的足以表达的水平的探针很容易通过荧光显微镜在各色的显著比例检测 ntiating肌细胞（〜3-5 PFU /细胞; 图6）。这是明显的对比文献报道感染的极高多重转导小鼠C2C12细胞（在250-400 MOI次序）17-19。此外，通过监控分化过程持续7天，我们建立了肌管形成未显著由过程受损。这表明，肌细胞融合，它依赖于细微调整肌动蛋白动力学20的方法，不是由LifeAct-GFP的低水平（ 图6，第6天第7天）的表达扰动。因为荧光标记物仍然可以C2C12细胞的adenofection后许多天检测到，我们认为，这种方法将是适合的伴侣对肌动蛋白动力学在C2C12成肌的不同阶段的影响功能分析。

表格1

jove_content“FO：保together.within页=”1“>表1.计算腺病毒MOI的显示的是如何计算的腺病毒蚀斑形成单位（PFU）所必需的数量规定数量的感染的例子考虑的不同的病毒滴度的细胞。

图1
图1. 规划一个典型的adenofection协议。一个典型的实验的连续步骤显示了使用CAPI沉淀物用阳离子脂质转染试剂（以黄色高亮显示），包括细胞接种，转导协议（灰色下划线）或协议siRNA双链的腺和杆状病毒，转染，和细胞同步双胸苷块。在两种协议小时时间线被显示在该图的右侧。fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图2
使用Adenofection BAG3-GFP的 图2. 均匀和高效的表达。（A）中的HeLa细胞的代表性落射荧光图像 已被转染BAG3-GFP质粒DNA，显示出在高表达水平的蛋白质的核周聚集物（由箭头表示）和细胞群中异源表达。蛋白质印迹显示相对于在整体细胞群内源性BAG3水平BAG3-GFP高表达，这表明该蛋白在一些细胞中基本上过表达。 （B）中已被仅转导或使用Ad-BAG3-GFP病毒颗粒的增加量adenofected HeLa细胞的代表性落射荧光图像。图片使用相同的参数被收购，背景扣除和强度都同样处理;酒吧：50微米请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3. BAG3高效击倒和在邻近内源性水平BAG3-GFP蛋白的重新引入。（AB）的HeLa细胞中表达的RFP-H2B（A）或亲HeLa细胞（B）的用所示siRNA和使用CAPI重组腺病毒进行adenofected方法（A）或基于脂质体的化合物作为转染试剂（B）中。细胞通过双胸苷块方法进行同步和期间释放的第二阶段中制备总细胞提取物。 Weste氡印迹显示BAG3消耗水平（BAG3内源），adenofected BAG3-GFP蛋白的水平，和HSPB8的内源性水平; GAPDH水平：装载控制。耗竭是通过加载控制提取物的减少量（与对照siRNA-siCtl和BAG3-GFP WT， 即 ½，¼adenofected）估计为> 75％。需要注意的是个别BAG3-GFP蛋白在附近BAG3的内源性水平和野生型BAG3-GFP出台，但不BAG3（IPV） - GFP单独或GFP，在BAG3耗尽细胞恢复HSPB8水平。 （CD）已被使用CAPI或阳离子脂质转染试剂adenofected用所示重组腺病毒-BAG3-GFP HeLa细胞的代表性落射荧光图像。酒吧：20微米。在（A）和（C）所示的代表性结果，从Fuchs等人，公共科学图书馆遗传学修饰。 2015年10月23日; 11（10）：e1005582，DOI：10.1371 / journal.pgen.1005582 14。尔斯/ ftp_upload / 54557 / 54557fig3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4. Adenofection不诱导HeLa细胞应激反应的控制HeLa细胞制备的总细胞提取物的Western印迹：与单纯对照siRNA（siCtl，无腺病毒），转染或siCtl adenofected（NT未处理）或HeLa细胞和Ad-GFP使用或者CAPI或阳离子脂质转染试剂，或者从提交到典型proteotoxic治疗（HS HeLa细胞：在44热休克 ℃60分钟，随后16小时恢复，在37℃; MG132：蛋白酶体抑制剂，5μM16小时），显示BAG3，HSPB8和其他胁迫诱导伴侣，即HSP70 / HSPA / HSP27和/ HSPB1的水平; GAPDH：加载控制。请注意，虽然所有职业水平除了GAPDH teins在proteotoxic胁迫处理均增加，他们仍通过adenofection不变。蛋白质水平的变化是由加载不同量的HS细胞提取物的该承担的HSP典型的增加进行评估。（HS：1，½¼，⅛;例如，HSP70响应诱导超过8倍至proteotoxic应力） 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5.级数HeLa细胞通过有丝分裂的细胞不会被Adenofection显著扰动：（A）从HeLa细胞已被adenofected用对照siRNA（siCtl）代表共焦时间推移序列与BacMam- GFP-α微管蛋白和BacMam一起-RFP肌动蛋白和旋转盘共聚焦成像microsco吡啶在〜1.5分钟的时间间隔为60〜90分钟。白色和黄色的星号指定主轴极点保持相对稳定的位置。酒吧：10微米。 adenofected与siCtl或特定BAG3-siRNA转，有或没有指定的GFP蛋白（：WT单独GFP或野生型BAG3-GFP）细胞（B）的定量。该图表示与定义为主轴摇摆和停滞在有丝分裂异常的有丝分裂+/-或染色体不对细胞百分比。示出的是该装置+/- SE。在（B）中所示的代表性结果，从Fuchs等人，公共科学图书馆遗传学取。 2015年10月23日; 11（10）：e1005582，DOI：10.1371 / journal.pgen.1005582 14。 请点击此处查看该图的放大版本。 请点击此处查看与面板（A）相关的电影。


图6. C2C12细胞与Ad-LifeAct-GFP和肌管形成的Adenofection。已被诱导分化并处理adenofection 1天后使用LifeAct-GFP的5 PFU /细胞和45 PFU /细胞C2C12细胞的代表性图像落射荧光的LacZ的。图像显示，在分化过程中（第2天，第7天6天）的GFP标记的表达。酒吧：20微米请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

在这里，我们描述的方法使得能够进行耗尽救援实验，这是适用于那些对影响的化学计量和蛋白质复合物和大分子结构的动力学的蛋白质的过表达特别敏感细胞生物学过程的功能分析。有丝分裂的细胞分裂是涉及在细胞中的整体结构的最引人注目的和引人注目的变化微调细胞地貌的一个极端的例子。使用adenofection用市售BacMam试剂相结合，引进低，但检测的量的肌动蛋白和微管蛋白标志物细胞成像，分子伴侣复合BAG3-HSPB8适当的有丝分裂细胞重塑的贡献可以清楚地证明。在最近的一项研究由富克斯等人 ，我们已经表明BAG3的耗竭导致主轴定向与相关的无力的缺陷，建立刚性的有丝分裂的肌动蛋白皮质和组装丰富肌动蛋白回缩纤维14。合适的主轴动力学可以通过野生型BAG3-GFP，也纠正了在BAG3沉默水平HSPB8看到下降的重新引入恢复。这意味着adenofection，可允许与主轴动力学功能恢复相关生理相关分子伴侣复合物的回收。

adenofection为耗尽救援实验的使用提供了对质粒DNA转染或核转染的优点，这可能会导致在某些类型的细胞（ 即，自噬）21应激反应的一种有效的诱导，使得它实际上不可能分析的冲击给伴侣和它的生理作用。事实上，在我们手中，BAG3质粒DNA转染与每个细胞高表达，聚集体形成，并且在数种细胞类型上的细胞凋亡/存活效应（ 图2）相关联。 BAG3是一个模块化cochaperone与支架的活性，其中m唉取决于它的伙伴蛋白质9扮演多重角色。因此，在BAG3的表达复杂的化学计量的扰动可能有不良显性负面影响，并导致毒性。高容量重组腺病毒是用于在两个分割和非分裂中培养细胞，因为它不整合入宿主细胞基因组中，而相比之下，基于慢病毒载体的瞬时和安全递送大的基因的理想载体的量一定的安全担忧仍然存在。使用腺病毒为耗尽救援实验的潜在缺点是，它们需要反复制剂，其可以是耗时的。他们还依托感染颗粒可重复传导有效性的谨慎滴定。

使用adenofection筛选已知BAG3功能域的贡献，我们在正常操作中得到的第一个证据，就我们所知，对于一个HSPB8依赖性BAG3功能的存在的分割，不需要其与HSP70 / HSPA1伴侣系统相互作用的细胞。 Adenofection应当适用肌细胞分化的过程为肌管期间跟踪F-肌动蛋白，通过这里给出的数据的建议。因此，我们的方法提供了对细胞地貌应在广泛的，其中感兴趣的基因的结构与功能分析被追求的项目是有用的影响最小基于siRNA的耗尽救援实验一种通用和高效的协议。

为了实现与病毒粒子的最低量的细胞的有效转染转导利用阳离子化合物脂质的关键是这种方法。虽然它提供了一个较大的窗口，用于控制每个细胞的外源蛋白的水平，我们认为，它进一步允许降低对信号转导途径的潜在副作用，从腺病毒的细胞结合入，这应该减轻AP的影响导致对形态发生途径利息rotein。

应当注意的是，不同的试剂来提高腺病毒转导效率是市售的，如汽车受体助推器。这种试剂是昂贵的，但是，并有望促进病毒结合位进入细胞在需要的CAR受体，其如上所述已经显示激活信号与细胞的形状和粘附相关途径的方法。而CAPI比阳离子脂质体，以使可能经由CAR-依赖性途径腺病毒条目的装置更便宜，但也更具毒性的一些细胞系。我们建议空adenofection之前测试定向CAPI之间的选择VS阳离子脂质试剂，这取决于所使用的细胞系和感兴趣的生物读数。

加上基因组编辑的新的生物技术工具，RNA干扰技术为基础的击倒救援的方法，如这里所描述的提供了一个AR强大的分子工具射线揭开细胞，可现在这取决于具体应用3研究者进行优化选择基因的功能。我们认为，adenofection提供相对快速和简单的系统来创建亚效等位基因击倒为在多个蜂窝背景目的蛋白质的贡献的结构​​ - 功能分析。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
C2C12 Mouse Myoblasts ATCC CRL-1772
Adenovirus custom design Welgen Custom design
Calcium Chloride Fisher Scientific C79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0 Thermo Fisher C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0 Thermo Fisher C10614
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose Thermo Fisher 11965-092
EDTA Sigma E5134
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher 12483-020
Fibronectin Sigma F1141
Glass bottom dishes, 35 mm MatTek Corperation P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada Klebig C et al. 2009
HEPES Fisher Scientific BP310-1
Horse Serum, New Zealand Thermo Fisher 16050-122
KCl Fisher Scientific BP366-500
L-Glutamine Thermo Fisher 25030081
Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent Thermo Fisher 13778-150
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha Wisent 310-101-CL
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides Thermo Fisher 12000-022
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red Thermo Fisher 41061-029
Na2HPO4 Biobasic S0404
NaCl Fisher Scientific BP358-10
OptiMEM Thermo Fisher 11058-021
rAVCMV-LifeAct-TagGFP2 IBIDI 60121
siRNA duplexes Dharmacon Custom design
Thymidine Sigma T9250
Trypsine 2.5% Thermo Fisher 15090-046

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References

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Tags

分子生物学，第115，腺病毒，细胞转导，RNA干扰，细胞转染，活细胞成像，细胞骨架动力学，LifeAct-GFP，微管蛋白的RFP，有丝分裂，肌细胞分化，HeLa细胞，C2C12细胞
Adenofection：用于研究分子伴侣在细胞地貌被耗尽，救援实验中的角色方法
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Fuchs, M., Boulanger, M. C., Lambert, H., Landry, J., Lavoie, J. N. Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments. J. Vis. Exp. (115), e54557, doi:10.3791/54557 (2016).

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