Adenofection: En metode for å studere rollen for molekylær anstand i Cellular Morphodynamics av ​​Nedbryting-redning Eksperimenter

Abstract

Cellulære prosesser som mitose og celledifferensiering er styrt av endringer i cellen form som i stor grad er avhengige av riktig ombygging av celle cytoskeletal strukturer. Dette innebærer montering-demontering av høyere orden makromolekylære strukturer på et gitt tidspunkt og sted, en prosess som er særlig følsom for forstyrrelser forårsaket av overekspresjon av proteinene. Metoder som kan bevare protein homeostase og opprettholde nær-til-normal cellulær morfologi er meget ønskelige for å bestemme den funksjonelle bidraget av et protein av interesse i et bredt utvalg av cellulære prosesser. Forbigående uttynning-redning eksperimenter basert på RNA interferens er effektive metoder for å analysere protein funksjoner og strukturelle krav. Imidlertid er gjeninnføring av målproteinet med et minimum av avvik fra dens fysiologisk nivå en virkelig utfordring. Her beskriver vi en fremgangsmåte betegnet adenofection som ble utviklet for å studere rollen til molekylære anstand end partnere i normal drift av delende celler og forholdet til aktin ombygging. HeLa-celler ble tømt for BAG3 med siRNA tomannsboliger rettet mot 3'UTR regionen. GFP-merket BAG3 proteiner ble gjeninnføres samtidig til> 75% av cellene ved hjelp av rekombinant adenovirus som er koplet til transfeksjon reagenser. Adenofection i stand til å uttrykke BAG3-GFP-proteiner i nærheten av fysiologiske nivåer i HeLa-celler utarmet av BAG3, i fravær av en stressrespons. Ingen effekt ble observert på nivåer av endogene Heat Shock Protein anstand, de viktigste stress-induserbar regulatorer av protein homeostase. Videre, ved å tilsette baculovirus som driver ekspresjonen av fluorescerende markører på tidspunktet for celle transduksjon-transfeksjon, kan vi dissekere mitotiske celle-dynamikk av time-lapse mikroskopiske analyser med minimal forstyrrelse av normal mitotisk progresjon. Adenofection gjelder også vanskelige å infisere museceller, og egner seg for funksjonelle analyser av myoblast diffdifferensieringen inn myotubes. Dermed adenofection gir en allsidig metode for å utføre struktur-funksjonsanalyser av proteiner som er involvert i følsomme biologiske prosesser som er avhengige av høyere orden cytoskeletal dynamikk.

Introduction

Funksjonell inaktivering av genekspresjon i pattedyrceller er gullstandarden for å dissekere protein funksjoner. Nyutviklet teknologi av genom redigering basert på bruk av stedspesifikke nukleaser som sink-finger nukleaser og gruppert regelmessig avbrutt av korte palindromic repetisjoner (CRISPR) / CAS9 nå tillate dannelsen av cellelinjer med målrettet genet sletting og mutasjon ^1,2. Disse nye tilnærminger skal revolusjonere måten vi studerer protein funksjon og vår forståelse av genetikk av menneskelige sykdommer. I noen tilfeller er imidlertid langvarige eller komplette gen knockout ikke ønskelig og kan provosere sekundære celle kompensasjonsmekanismene. Genereringen av genetisk modifiserte cellelinjer kan også være begrensende når håndtere primære cellekulturer med begrenset kapasitet spredning, eller ved screening av et stort sett av mutasjoner i forskjellige celletyper er søkt. Dette er ofte nødvendig for å bestemme avhengigheten av en celle biological prosess på strukturelle krav til et protein. For å nå dette målet, er fortsatt reversible knockdown av RNA-interferens som gjør forbigående utarming-redningsforsøk i ulike cellulære bakgrunn fortsatt en enkel og kraftfull tilnærming til å utføre struktur-funksjonsanalyser av et protein av interesse ^tre. Imidlertid er en stor ulempe for denne fremgangsmåten er vanskeligheten med å oppnå effektiv lyddemping og for å gjeninnføre den proteinet av interesse eller en av variantene på nær fysiologiske nivåer i et flertall av cellepopulasjonen. Dette er viktig for å muliggjøre omfattende studier som forsøker å korrelere funksjonelle effekter sett i nivå med enkeltceller (hypomorphic fenotype) med de som ses i cellepopulasjonsbaserte analyser, for eksempel på protein-protein-interaksjoner.

Ved hjelp av klassiske transfeksjon metoder, kan man neppe oppnå homogen og lavt uttrykk av eksogene proteiner i en stor populasjon av celler. Transduksjon av celler med rekombinante virussom adenovirus gjør ofte mer normalisert uttrykk for eksogene proteiner. Likevel er adenovirus opptak begrenset av CAR-reseptoren, som er fraværende i ikke-humane celler eller bare svakt uttrykt i visse humane celletyper. Videre den cellulære oppføring av adenoviruses aktiverer signalveier som regulerer celleform og heft ^4-6. Dette er åpenbart ikke ønskelig når man studerer reguleringsmekanismer for celle morphodynamics. Vi var overfor dette problematisk når vi foretok funksjonelle analyser av anstand kompleks, BAG3-HSPB8 i celledeling og aktin dynamikk. Pionerarbeid hadde beskrevet en rolle for denne anstand komplekset i protein kvalitetskontroll og autofagi under stress ^7,8. De fleste av disse studiene har imidlertid avhengig av protein overekspresjon, forutsatt at anstand normalt oppregulert under stress. Dette har igjen åpne spørsmålet om BAG3, i kompleks med HSPB8, kan bidra til normal drift av delende celler uttrykker thESE anstand som mange kreftcelletyper ^9. Spesielt om anstand kompleks bidrar til ombygging av aktin-baserte strukturer som styrer mitotisk progresjon var av stor interesse, gitt de nye forbindelser mellom HSPB anstand og cytoskeletal dynamikk ^10. For å løse dette problemet, ble vi søker å utvikle en effektiv metode for uttømming-redning eksperimenter som ikke ville forstyrre mitotisk progresjon eller cellulær morfologi, og som ville bevare protein homeostase for å unngå sekundær forstyrrelse av dynamikken i makromolekylære komplekser som regulerer celle-formen endringer . Således ideelt sett bør uttømming-add-back av genet av interesse bli utført samtidig.

Anvendelsen av komplekser av adenovirus med en kationisk polymer eller lipider er blitt beskrevet for å fremme genoverføring både in vitro og in vivo ^11,12. For eksempel, kalsiumfosfat (Capi) ser ut til å danne et bunnfall medadenovirus som forbedrer virus binding-entry via en CAR-uavhengig vei ^13. Ja, vi fant at å kombinere adenovirus-baserte celle transduksjon og transfeksjon med kationiske forbindelser kan forbedre effektiviteten av uttømming-redningsforsøk. Dette tillot oss å senke mengden av virus med 3 til 20 ganger, avhengig av cellelinjen og genet av interesse, og dra nytte av et større vindu for å regulere ekspresjon av eksogene proteiner ved i nærheten av endogene nivåer i de fleste av en cellepopulasjon av interesse med minimal innvirkning på mobilnettet morfologi. Under slike forhold, kan vi også oppnå høy virkningsgrad knockdown av endogent protein uttrykk (> 75%). Vi beskriver herved fremgangsmåten trinn for trinn og gir bevis for at proteinet homeostase ikke blir vesentlig forstyrret som vurderes av uendrede nivåer av stress-induserte anstand av varmesjokkprotein familie, noe som gjør fremgangsmåten egnet for funksjonell analyse av fysiologiske role av molekylære anstand av time-lapse video mikroskopi. Protokollen er mottagelig for celle synkroniseringsfremgangsmåter og anvendelse av kommersielt tilgjengelige baculovirus for ko-ekspresjon av lave nivåer av fluorescerende markører, med minimal interferens med normale aktin-baserte og spindel dynamikk i løpet av mitotisk progresjon. Vi viser videre allsidighet av metoden, som er gjeldende for "vanskelig å omsette" muse C2C12 celler, med ingen signifikant innvirkning på myoblast differensiering i myotubes in vitro.

Protocol

1. Utarbeidelse av Medium og løsninger (alle sterilfiltrert)

1. C2C12 mus muskelceller (differensiering studier)
   1. Forbered 500 ml vekstmedium for C2C12 cellekultur vedlikehold: DMEM høy glukose supplert med 10% FBS og 2 mM L-glutamin.
   2. Forbered 100 ml Differensiering Medium (DM) for C2C12 differensiering: DMEM høy glukose supplert med 2% Horse Serum.
2. HeLa-celler (studier i mitotiske celler)
   1. Fremstille 500 ml aMEM for HeLa RFP-H2B cellekultur vedlikehold og eksperimenter: aMEM supplert med 10% FBS og 2 mM L-glutamin (aMEM ^10%).
   2. Fremstille 500 ml aMEM-minus (uten deoksyribonukleosider / ribonukleosider) for HeLa RFP-H2B celle synkronisering: aMEM-minus supplert med 10% FBS og 2 mM L-glutamin (aMEM-minus ^10%).
   3. Forbered 20 ml aMEM uten fenolrødt for HeLa-RFP-H2B live celle oppkjøpet: aMEM uten fenolrødt supplert med 10% FBS og 2 mM L-glutamin.
   4. Forbered 100 mM tymidin: oppløse 24,2 mg i 1 ml _H2O ved 37 ° C med virvling. Filter sterilisere og holde ved 4 ° C.
3. vanlige løsninger
   1. Forbered 0,05% Trypsin / EDTA: 0,05% trypsin, 0,625 mM EDTA i 1 x fosfatbufret saltvann (PBS). Filter sterilisere og lagre alikvoter ved -20 ° C. Tint, holde delmengde ved 4 ° C.
   2. Forbered HBS2x: 280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM Na ₂ HPO _4. Juster pH nøyaktig mellom 07.01 til 07.05 med 10 N NaOH. Filter steril og holde ved 4 ° C.

2. Belegg av cellekultur plater med Fibronectin og plating av HeLa-RFP-H2B Cells

MERK: Før forsøket, bør hver manipulator sette opp det optimale cellepletteringsbetingelser for å oppnå en passende tetthet av celler, siden variasjoner kan Occur mellom hver manipulator og hver annen cellelinje.

1. Dagen før forsøket, utvide HeLa-RFP-H2B celler for å sørge for at de er innenfor den eksponentielle vekstfase på dagen for platekledning. Lag 2 påfølgende 1/3 fortynninger i 10 cm plater med start fra en 80% konfluent 1x10 cm plate.
   MERK: Planlegg antall plater for forsøket. Beregn hver tilstand som duplikater, en for kortsiktig levende celle bildebehandling og en for protein ekstrakter for å fastslå effekten av knockdown og eksogent protein uttrykk ved Western blot analyse. Planlegg en ekstra plate å bestemme celle nummer før virus transduksjon.
2. Før celle plating, frakk glassbunn retter med 10 mikrogram / ml fibronektin. Tilsett 1 ml av en 1: 100 fortynning av 1 mg / ml fibronektin (fortynnet i steril 1 x PBS) pr 35 mm skål til godt dekke hele overflaten og inkuberes i 1 time ved 37 ° C, _5% CO2.
3. Under inkubasjon, pre-varm aMEM supplert with 10% FBS (aMEM ^10%) og 0,05% Trypsin / EDTA ved 37 ° C.
4. Etter 45 minutter med inkubasjon, begynne å forberede den celleløsning. I den sterile hette, aspirere mediet fra en 10 cm plate, skylles forsiktig to ganger med 1,5 ml 0,05% trypsin / EDTA, og la 0,5 ml trypsin / EDTA i siste aspirasjon.
5. Cellene inkuberes i 2-3 minutter ved 37 ° C, _5% CO2. Ved å banke lett på plate og observasjon under mikroskopet, må du kontrollere at alle cellene er blitt løsrevet. Tilsett 10 ml aMEM ^10% og pipettes forsiktig flere ganger for å skille cellene. Telle en 10 pl prøve av cellesuspensjonen ved hjelp av et hemocytometer.
6. Sug fibronektin løsning fra glassbunn retter. Ikke la fibronektin å tørke ut før celle plating.
7. Plate 1.5x10 ⁵ celler per 35 mm tallerken i 2 ml aMEM ^10% og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO _2. Kontroller etter 30-45 minutter under mikroskopet at cellene er godt SEPAvurdert, siden de har tendens til å hope seg opp på midten av platen.
8. Om nødvendig, agitere platene forsiktig cross-klok å omfordele cellene. Plate en 35 mm plate i tillegg til antallet tilstander for å telle celletallet før virus transduksjon.
9. Dyrke cellene til neste dag for å oppnå en celletetthet på minst 50%. En celletetthet lavere enn 50% resulterer i en signifikant reduksjon av virus transduksjon effektivitet, økes variasjoner av proteinekspresjon pr celle, og økt celletoksisitet.
   MERK: Belegg av glass retter med fibronektin forbedrer cellevekst og morfologi og fremmer riktig progresjon av celler gjennom mitose. Generelt kan erstattes med kommersielt tilgjengelig gelatin som er billigere.

3. Adenovirus Transduksjon og endogent protein knockdown av siRNA Transfeksjon i HeLa-RFP-H2B Cells hjelp Capi Bunnfallet

Forsiktig! Working med virus krever spesielle forholdsregler og riktig disponering av alt materiale som har vært i kontakt med viruset.

Forsiktig! I våre hender, Capi utfellinger ofte har mer bivirkninger, for eksempel på biologiske prosesser som involverer vesikkel menneskehandel (f.eks autofagi). Følgelig er det anbefalt å bruke et kationisk lipid transfeksjon reagens (se nedenfor) og vente minst 48 timer før analysene.

MERK: En kontroll adenovirus som bærer en ubeslektet-genet (dvs. LacZ) eller ikke-gen blir brukt for å nå en minimal MOI på alle Adenofections (10-20 pfu / celle) ved anvendelse av den laveste mengden av rekombinant adenovirus som bærer genet av interesse.

NB: Denne fremgangsmåten har vist seg å bidra til å normalisere ekspresjon per celle i en stor cellepopulasjon.

1. En dag etter cellepletter telle antallet celler fra den ytterligere belagt fatet. Aspirer medium ogskylles en gang med 1 ml 0,05% trypsin / EDTA. Legg igjen 1 ml av 0,05% trypsin / EDTA og inkuberes ved 37 ° C, _5% CO2 inntil alle celler er frittliggende. Separere cellene brønn med en 1 ml pipette og telle antallet celler pr ml ved hjelp av et hemocytometer.
2. Bestemme den mengde virus som trengs for å transdusere celler ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 2 plaque-dannende enheter (PFU) av proteinet av interesse (POI) per celle og 18 PFU per celle av en tom vektor (f.eks LacZ) for å ha en total på 20 PFU per celle. Samtidig transdusere 4 PFU av hver baculovirus (Actin og αTubulin, GFP og RFP-merket henholdsvis). Transduce cellene ved anvendelse av følgende protokoll adenofection. Virus ble anvendt som beskrevet i Fuchs et al. ¹⁴
3. Forbered i en steril hette en 1,5 ml plastrør for hver tilstand og tilsett 400 mL av varme aMEM-minus ^10%.
4. Tine en alikvot av virusene langsomt på is og, om nødvendig, fortynne than virus lager for å pipettér et volum som er større enn 1 mL å minimalisere feil pipettering.
5. Legge til den beregnede virusmengde pr tilstand til hver 1,5 ml plastrør inneholdende 400 ul aMEM-minus ^10% og bland forsiktig ved pipettering. Plasser viruset lager umiddelbart tilbake ved -80 ° C for å beholde sin aktivitet.
6. Aspirer mediet fra cellene og forsiktig pipette viruset mix drop-klok. Inkuber cellene ved 37 ° C, _5% CO2 og agitere platene forsiktig under sterile panseret hvert 15 min i 1 time til godt dekke cellene med viruset. Ved hjelp av en liten mengde av mellom letter kontakten av viruset med cellene.
7. Etter inkubering ble forsiktig pipette 1,6 ml aMEM-minus ^10% for hver plate for å oppnå et totalt volum på 2 ml, start cellesynkroniseringen ved tilsetning av 2 mM tymidin og inkuberes cellene for en ytterligere 2 timer ved 37 ° C, _5% CO2 .
8. I mellomtiden, forberede siRNA transfeksjon mix following Capi transfeksjon metode (se figur 1). Hvis ingen siRNA er nødvendig, bytt mengden av siRNA av sterilt vann til å utføre en tom transfeksjon.
9. Beregn 200 ul blanding for hver tilstand, noe som resulterer i 400 ul per duplikat. Det følgende eksempel er gitt for en endelig siRNA konsentrasjon på 50 nM, og må tilpasses for hver enkelt protein av interesse. I et 1,5 ml plastrør, pipette 50 pl 1 M CaCl ₂ og 11 mL 20 mM siRNA til 139 mL sterilt H ₂ O og bland ved virvling. Etter en rask runde, legg nøye dråpevis 200 mL HBS2x (280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, pH 7.1 til 7.5).
   MERK: små dråpene på mindre er de bunnfall, noe som resulterer i bedre transfeksjonseffektivitet. Bland forsiktig tre ganger med fly injeksjon ved bruk av en 200 mL-pipette.
10. Inkuber blandingen i 30 minutter ved RT. Legg sakte dråpevis 200 ul transfeksjon mix til hver plate ogagitere cross-klok. Overfør platene ved 37 ° C, _5% CO2 i 16 timer.
11. Den neste dagen, skyll celler to ganger med 2 ml varm HEPES (6,7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,3) og tilsett 2 ml aMEM-minus ^10%. Ikke gå videre med mer enn fire celleplatene på et tidspunkt da variasjoner i temperaturen påvirke lengden av cellesyklus.
12. Visual infeksjonen effektivitet under en invertert fluorescerende mikroskop med en forstørrelse på 20-40x (luft) og skaffe tre representative bilder per tilstand både fluorescerende og overføringskanaler for dokumentasjon. Syv timer senere, tilsett 2 mM tymidin og inkuberes i ytterligere 16 timer ved 37 ° C, _5% CO2.
13. Neste dag, 48 timer etter siRNA transfeksjon og virusinfeksjon, skyll cellene to ganger med 2 ml varm fosfatbuffer saltvann (PBS) og slipp for 7 timer i 2 ml aMEM ^10% w / o fenolrødt for live celle bildebehandling eller med Fenol Red for protein utvinning.
14. Høste celler for hver tilstand 48 timer etter transfeksjon for fremstilling av proteinekstrakter og Western blot-analyse for å bestemme effektiviteten av knockdown og ekspresjon av det endogene protein ^15.
    MERK: Bruk antistoffer mot proteinet av interesse samt aktuelle antistoffer som tjener som lastkontroller. Effektiviteten av knockdown bør bestemmes ved å laste avtagende mengder av kontroll cellelysater (transfektert med kontroll siRNA), for å tilveiebringe en titreringskurven (dvs. 1, ½, ¼, ⅛).

4. Adenovirus Transduksjon og endogent protein knockdown av siRNA Transfeksjon i HeLa celler ved hjelp av et kationisk lipid Transfeksjon Reagens

MERK: Her presenterer vi en protokoll som var tilpasset for eksperimenter som ikke involverer cellesynkronisering og / eller når siRNA transfeksjon ikke kan utføres ved Capi metode, for eksempel for å unngå uønskede toksiske effekter i noen celle lines. Denne protokollen inneholder også en celle replating skritt etter adenofection for å jobbe på en passende celletetthet. Vi har bare testet det kationiske lipid transfeksjon reagens.

Forsiktig! Arbeide med virus krever spesielle forholdsregler og riktig disponering av alt materiale som har vært i kontakt med viruset.

1. Plate 1,75 x 10 ⁵ celler per 35 mm tallerken i 2,5 ml aMEM ^10% og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO _2. Plate en 35 mm plate i tillegg til antallet tilstander for å telle celletallet før virus transduksjon.
2. Dyrke cellene til neste dag for å oppnå en celletetthet på minst 50%. En celletetthet på mindre enn 50% resulterer i en betydelig reduksjon av virus transduksjon effektivitet, økes variasjoner av proteinekspresjon pr celle, og økt celletoksisitet.
3. En dag etter cellepletter telle antallet celler fra den ytterligere belagt fatet. Sugmediet og skyll en gang med 1 ml 0,05% Trypsin / EDTA. Legg igjen 1 ml av 0,05% trypsin / EDTA og inkuberes ved 37 ° C, _5% CO2 inntil alle celler er frittliggende. Separate celler brønn ved bruk av en 1 ml pipette og telle antallet celler pr ml.
4. Bestemme den mengde virus som trengs for å omsette en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 20-40 plakkdannende enheter (PFU) av proteinet av interesse (POI) per celle og 0-20 PFU per celle av en tom vektor (f.eks LacZ) for å ha en total på 40 PFU per celle.
5. Forbered i en steril hette en 1,5 ml plastrør for hver tilstand og tilsett 400 mL av varm aMEM ^10%.
6. Tine en alikvot av virusene langsomt på is og, om nødvendig fortynne viruset lager for å pipettér et volum som er større enn 1 mL å minimalisere feil pipettering.
7. Legg den beregnede virus mengde per tilstanden til hver 1,5 ml plastrør som inneholder 400 mL aMEM ^10% og bland forsiktig ved pipettering. Plasser the virus lager umiddelbart tilbake ved -80 ° C for å beholde sin aktivitet.
8. Aspirer mediet fra cellene og forsiktig pipette viruset mix drop-klok. Inkuber cellene ved 37 ° C, _5% CO2 og agitere platene forsiktig under sterile panseret hvert 15 min i 1 time til godt dekke cellene med viruset fortynning. Ved hjelp av en liten mengde av mellom letter kontakten av viruset med cellene.
9. I mellomtiden forbereder siRNA transfeksjon mix etter transfeksjon metode. Hvis ingen siRNA er nødvendig, bytt mengden av siRNA etter medium uten serum til å utføre en tom transfeksjon.
   1. Det følgende eksempel er gitt for en endelig siRNA konsentrasjon på 50 nM, og må tilpasses for hver enkelt protein av interesse. For hver adenofection, utarbeide en 1,5 ml plastrør som inneholder 416 nM siRNA i 150 mL medium uten serum (f.eks 6,25 mL 20 mikrometer siRNA + 144 mL medium uten serum) og en 1,5 ml plastrør containing 6,25 mL kationisk lipid transfeksjon reagens + 144 mL medium uten serum.
   2. Bland innholdet i hver plastrør ved å pipettere opp og ned flere ganger med en 200 ul pipette. Kombiner innholdet av begge rør og bland ved å pipettere opp og ned flere ganger med en 200 ul pipette. Inkuber i 5 min ved RT.
10. Etter inkubasjon med viruset, forsiktig pipette 1,8 ml aMEM ^10% for hver plate for å oppnå et totalt volum på 2,2 ml og straks legge langsomt dråpevis siRNA transfeksjon blandingen til hver plate og agitere tversgående. Overfør platene ved 37 ° C, _5% CO2 i 24 timer.
11. Den neste dag, re-plate cellene fra hver 35 mm skål i fire nye 35 mm plater i 2,5 ml aMEM ^10% hver og inkuberes i ytterligere 24 timer ved 37 ° C, _5% CO2.
12. Neste dag, 48 timer etter siRNA transfeksjon og virusinfeksjon, slakte celler fra en plate for hver tilstand for utarbeidelse avproteinekstrakter og Western blot-analyse for å bestemme effektiviteten av knockdown og ekspresjon av det endogene protein ^15.
    MERK: Med de resterende platene, fortsette med cellefiksering ved hjelp av protokollen av valg og utsette prøvene til immunfluorescens analyse med antistoffer av interesse ^14.

5. Live-Cell Imaging mitotisk celler og dataanalyse

1. Utfør kortsiktige levende celle bildebehandling eksperimenter på mitotiske celler med en invertert mikroskop utstyrt med en fuktet / 5% CO ₂ / termoregulert kammer.
   MERK: I denne studien, en roterende disk confocal mikroskop (40X, 0,75 NA) ble brukt, utstyrt med en EMCCD avkjølt charge-coupled kamera ved -50 ° C.
2. Før oppkjøpet bekrefte at kammeret har nådd riktig temperatur på 37 ° C.
   MERK: Det kan ta flere timer, avhengig av mikroskopiske system.
3. Plasser kultur retter i microscope kammeret 1 time før anskaffelse for å muliggjøre riktig likevekt av mediet og unngå fokus drivende på grunn av temperaturendringer. Overvåk den mitotiske status av cellene. På dette punktet, bør 10-15% av cellene være i de tidlige stadier av mitose (prophase-prometafase).
4. I løpet av likevekt tid, sette opp oppkjøpet parametere som bestemmes i tidligere forsøk. Vanligvis en eksponeringstid for begge kanaler (488 og 594) i 0,2 til 3 sek med en laser intensitet på 100% og en sensitivitet på 121-130 er egnede parametre i våre hender.
   MERK: Første tester bør gjøres for å bestemme minimum laser intensitet og oppkjøp tid / intervall som resulterer i en passende oppløsning med minimum fotobleking som forårsaker celleskader og perturbs mitotisk progresjon.
5. Velge flere felt pr betingelse for å oppnå et betydelig antall celler for å analysere uten å overskride kjøpet intervallet. Ved hjelp av en spinnende disk confocal system, vil et typisk oppsett iavleiringer fire ulike forhold, 7 felt per plate og 2 fargekanalene (488 og 594) med en 1,5-2 min intervall over en 75 min periode.
6. Velg celler som er i mitotisk oppføring, re-satt i fokus når alle feltene er valgt og starte kjøp så fort som mulig.
7. Overvåke stabiliteten i systemet i minst tre tidspunkter og tilbakestille den avstand om nødvendig.
8. Etter at den første kortvarig levende celle avbildning av 75 min, kan det nye felt av mitotiske celler velges for å skaffe seg et andre sett av filmer for å øke antall celler blir analysert.
9. Bestemme veldefinerte kriterier for å analysere de mitotiske fenotyper celler, som vil avhenge av de fluoriserende markører som brukes. Defekter i mitose kan omfatte forlenget tid i mitose (fra atom sammenbrudd før anaphase), kromosom forskyvning, spindel rocking, og cortex blebbing ^14.

6. LifeAct-TagGFP2 Adenovirus Transduksjon i Differentiating C2C12 Muse myoblasts

MERK: adenofection protokollen er også gjeldende for vanskelige å infisere mus C2C12 myoblasts gjennomgår differensiering.

1. Plate 2 x 10 ⁵ C2C12 celler i 35 mm kultur retter i vekstmedium på plast eller på et substrat av valget.
   MERK: celledifferensiering er forbedret på gelatine- eller Matrigel-belagte retter. Planlegg en ekstra plate å bestemme celle nummer før virus transduksjon.
2. Den følgende dag ble celler skulle ha nådd 80% av sammenflytning. Indusere differensiering myoblast ved vasking av cellene to ganger med varm PBS og tilsetning av 2 ml av differensieringsmedium (DM).
3. Den neste dagen, merket som dag 1 (D1) for differensiering, transduce muskelceller med adenovirus LifeAct-TagGFP2 å visualisere aktin cytoskjelettet i levende celler. Telle celle nummer fra den ekstra platen som beskrevet under 3.2. Beregn 5 PFU / celle av LifeAct-TagGFP2 adenovirus og 45 PFU / celle AdLacZ etter eksamenple beskrevet i Tabell 1. Den totale virusmengden er 50 PFU / celle. Virus ble anvendt som beskrevet ¹⁴
4. Forbered i en steril hette en 1,5 ml plastrør for hver tilstand og tilsett 400 mL av varm DM.
5. Tine en alikvot av virusene langsomt på is og, om nødvendig fortynne viruset lager for å pipettér et volum som er større enn 1 mL å minimalisere feil pipettering.
6. Tilsett passende mengde viruspartikler pr tilstand til hver 1,5 ml plastrør inneholdende 400 ul DM og bland forsiktig ved pipettering. Plasser viruset lager umiddelbart tilbake ved -80 ° C for å beholde sin aktivitet.
7. Aspirer medium fra retter og forsiktig pipette viruset mix drop-klok. Inkuber cellene ved 37 ° C, _5% CO2 og agitere platene forsiktig under sterile panseret hver 15 minutter for en total av 1 time til godt dekke cellene med viruset.
8. Etter inkubering ble forsiktig pipette 1,6 ml DM på hver plate, og fortsetter på iinkuberingstiden i ytterligere 2 timer ved 37 ° C, _5% CO2.
9. I mellomtiden forbereder en tom transfeksjon mix følge Capi transfeksjon metode. Beregn 200 mL mix for hver tilstand. Bruke følgende eksempel for et totalvolum på 400 ul blanding.
   1. I et 1,5 ml plastrør, pipette 50 pl 1 M _CaCI2 i 150 ul sterilt _H2O, og bland ved virvling. Etter en rask runde, legg nøye dråpevis 200 mL HBS2x (280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, pH 7.1 til 7.5). Bland forsiktig med fly injeksjon tre ganger ved hjelp av en 200 mL pipette.
10. Inkuber blandingen i 30 minutter ved RT. Legg sakte dråpevis 200 ul av transfeksjon mix til hver plate og agitere cross-klok. Overfør platene ved 37 ° C, _5% CO2 i 16 timer.
11. Den neste dagen, skyll cellene to ganger med 2 ml varm HEPES (6,7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,3) og tilsett 2 ml DM. Visualisere infeDette skjer effektivitet under en invertert fluorescerende mikroskop med en forstørrelse på 20-40X (luft) og skaffe tre representative bilder per tilstand både fluorescerende og overføringskanaler for dokumentasjon.
12. Avhengig av ønsket eksperimentoppsettet, følg differensiering i myotubes i flere dager. Celler kan fikseres og deretter underkastet immunofluorescensanalyse eller levende celle imaging studier kan utføres.

Representative Results

Transfeksjon av BAG3-GFP plasmid-DNA ved hjelp av kationiske lipider var assosiert med heterogene ekspresjon i HeLa-celler, noen celler som viser knapt påvisbare nivåer av proteinet og andre lager meget høye BAG3 nivåer (figur 2A). I disse celler ble det tap av protein homeostase vist ved akkumulering av BAG3-GFP til perinukleære aggregater (figur 2A, piler). I motsetning til dette, celle transduksjon med adenovirus som bærer BAG3-GFP oppviste mer homogent lav ekspresjon og nøyaktig lokalisering av BAG3-GFP (figur 2B, infeksjon alene). Bemerkelsesverdig, tilsetning av kationiske lipider i løpet av adenovirus transduksjon (det vil si, transfeksjon av adenovirus partikler) signifikant øket BAG3-GFP uttrykk per celle ved lignende MOI, mens det tillates holder homogent uttrykk i de fleste celler (figur 2B, Adenofection).

utfelles eller liposom-baserte forbindelser for å øke transduksjon-transfeksjonseffektiviteten i HeLa-celler. Figur 3 viser et typisk eksperiment med villtype BAG3 (WT) -GFP eller en BAG3 (IPV) -GFP variant som bærer mutasjoner som avskaffe binding til en av dens anstand partnere HSPB8 (figur 3A, 3B). I samsvar med en rolle for BAG3 i stabilisering av HSPB8 ^7, stanse av BAG3 ført til en nedgang i nivåene av HSPB8, som ble restaurert til normale nivåer ved gjeninnføring av BAG3 WT ~ 50%, men ikke ved uttrykk for tilsvarende nivåer av mutant av BAG3 (IPV) -GFP eller av GFP alene. Under disse betingelsene ble BAG3-GFP proteiner hensiktsmessig lokalisert innenfor ~ 75-90% av cellene, blir anriket på perinukleære-centrosomal områder (figur 3C, 3D). dette Suggsert at adenofection bevart dynamikken i BAG3 og av BAG3-HSPB8 kompleks i cellene.

HSPB8 og BAG3 blir oppregulert ved ulike proteotoxic påkjenninger som også forurolige cytoskeletal proteostasis ^10. Derfor overekspresjon av anstand kan potensielt forstyrre montering-demontering av makromolekylære strukturer som styrer celle morphodynamics. For å vurdere rollen BAG3-HSPB8 under ikke-stresset forhold, var det viktig å kontrollere at protein homeostase var minimal opprørt av adenofection prosedyren. For dette formål, å overvåke variasjoner i nivåene av anstand av varmesjokkproteinfamilie er en god indikasjon på status av protein homeostase. Som vist i figur 4, adenofection av Capi eller liposom-baserte metoder var ikke signifikant øke nivåene av endogent HSPB8 og BAG3, eller som av de store HSP70 / HSPA1 anstand system. I motsetning til dette, typiskproteotoxic behandlinger som varme sjokk eller MG132, en proteasominhibitor, økte nivåer av anstand-cochaperone proteiner i HeLa celler.

Vi deretter søkt å finne ut om den adenofection prosedyre kombineres med baculovirus som driver ekspresjon av aktin, og tubulin fluorescerende prober (BacMam-RFP-aktin og GFP-αtubulin) var egnet for sporing av mitotiske celle dynamikk. Som vist i figur 5, gjorde adenofection av HeLa celler med en kontroll siRNA (siCTL) ikke forstyrre mitotiske spindel dynamikk (grønn) eller gjennomsnittlig tid brukt i mitose (figur 5A, representative confocal time-lapse-sekvenser). Andelen av disse cellene som viser unormale mitotiske hendelser var i samsvar med nivåene av mitotiske defekter som generelt observeres i kreftcellelinjer (~ 30% -40%, figur 5B). I motsetning til cellene adenofected med BAG3 spesifikke siRNA alene (siBAG3) viste en ~ 2-dobling i level av mitotiske fenotypiske defekter, som ble gjenopprettet til nær nivået i kontrollceller ved BAG3-GFP (WT), men ikke ved GFP alene. Dette validert egnetheten av adenofection for funksjonell analyse av virkningen av BAG3 og dens tilhørende anstand på cytoskeletal dynamikk som regulerer riktig progresjon av celler i og ut av mitose, som vist ved Fuchs et al ^14.

For å verifisere allsidighet av adenofection metoden, vi deretter tilpasset protokollen for å muliggjøre visualisering av F-aktin under differensiering av mus C2C12 muskelceller, ved hjelp av kommersielt tilgjengelige adenovirus-LifeAct-GFP å merke F-aktin ^16. C2C12 celler ble overtalt til å skille for en dag før Adenofection. Ved hjelp av Capi baserte adenofection protokoll, bemerkelsesverdig lave mengder av Adenovirus-LifeAct-GFP strukket for å uttrykke sonden på et nivå som er lett påvises ved fluorescens mikroskopi i en signifikant andel av differe ntiating myocytter (~ 3-5 PFU / celle, figur 6). Dette var i markert kontrast til den ekstremt høy infeksjonsmultiplisitet rapportert i litteraturen for å transdusere mus C2C12-celler (i størrelsesorden 250-400 MOI) ^17-19. Videre, ved å overvåke differensieringsprosessen i 7 dager, etablert vi at myotube dannelsen ikke ble betydelig svekket ved prosedyren. Dette antydet at myocyte fusjon, en prosess som er avhengig av finstemt actin dynamikk ^20, ikke ble opprørt av uttrykk for lave nivåer av LifeAct-GFP (Figur 6, dag 6 og dag 7). Siden fluoriserende fargestoff kan fortsatt bli oppdaget mange dager etter adenofection av C2C12 celler, mener vi at denne metoden vil være egnet for funksjonelle analyser av virkningen av anstand på aktin dynamikk på ulike stadier av C2C12 myogenesen.

jove_content "fo: keep-together.within-page =". 1 "> Tabell 1. Beregning av adenovirus MOI Vist er et eksempel på hvordan man skal beregne antall adenovirus plakkdannende enheter (PFU) er nødvendig for infeksjon av et definert antall celler vurderer ulike Virustitere.

Figur 1. Planlegging av en typisk adenofection protokollen. Påfølgende trinn av et typisk eksperiment er vist for protokollen med Capi utfellinger (understreket i grått) eller protokollen ved hjelp av et kationisk lipid transfeksjon reagens (uthevet i gult), inkludert celle plating, transduksjon av adenovirus og baculovirus, transfeksjon av siRNA tomannsboliger, og celle synkronisering med en dobbel tymidin blokk. Tid linjer i timer for begge protokollene er vist på høyre side av figuren.fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. ensartet og effektiv uttrykk for BAG3-GFP hjelp Adenofection. (A) Representative epifluorescence bilder av HeLa-celler som var blitt transfektert med BAG3-GFP plasmid-DNA, viser perinukleære aggregater av proteinet ved høye ekspresjonsnivåer (betegnet ved piler), og heterogene ekspresjon i cellepopulasjonen. Western blot viser økt ekspresjon av BAG3-GFP i forhold til endogene BAG3 nivåer i den totale cellepopulasjonen, noe som indikerer at proteinet er i stor grad overuttrykt i enkelte celler. (B) Representative epifluorescence bilder av HeLa-celler som hadde blitt omsatte eneste eller adenofected bruker økende mengder av Ad-BAG3-GFP viruspartikler. Bilderble anskaffet ved hjelp identiske parametere og ble like behandlet for bakgrunnen subtraksjon og intensitet; Bar:. 50 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Effektiv knockdown av BAG3 og gjeninnføring av BAG3-GFP-proteiner i nærheten av endogene nivåer. (AB), HeLa-celler som uttrykker RFP-H2B (A) eller paren HeLa-celler (B) ble adenofected med de angitte sirnas og rekombinante adenovirus ved hjelp av Capi fremgangsmåte (A) eller liposom-baserte forbindelser som transfeksjon reagens (B). Celler ble synkronisert ved den doble tymidin blokken fremgangsmåte og et totalcelleekstrakter ble fremstilt i løpet av den andre fasen av frigjørings. Weste rn blotter vise BAG3 utarming nivåer (BAG3 endogene), nivåene av adenofected BAG3-GFP proteiner og endogene nivåer av HSPB8; GAPDH nivåer: lasting kontroll. Nedbryting ble anslått til> 75% ved å laste avtagende mengder av kontroll ekstrakter (adenofected med kontroll siRNA-siCtl og BAG3-GFP WT, dvs. ½, ¼). Legg merke til at enkelte BAG3-GFP proteiner ble introdusert på nær den endogene nivået av BAG3 og at villtype BAG3-GFP, men ikke BAG3 (IPV) -GFP eller GFP alene, restaurert HSPB8 nivåer i BAG3-utarmet celler. (CD) Representative epifluorescence bilder av HeLa-celler som hadde blitt adenofected med den indikerte rekombinant Ad-BAG3-GFP hjelp Capi eller kationisk lipid transfeksjon reagens. Barer: 20 mikrometer. Representative resultater som er vist i (A) og (C) er modifisert fra Fuchs et al., Plos Genet. 2015 23 oktober, 11 (10): e1005582, doi: 10,1371 / journal.pgen.1005582 ^14.iles / ftp_upload / 54557 / 54557fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Adenofection ikke induserer en stressrespons i HeLa celler Western blot av total celle ekstrakter fremstilt fra kontroll HeLa celler. (NT: ikke behandlet) eller HeLa celler transfektert med kontroll siRNA alene (siCtl, ingen adenovirus), eller adenofected med siCtl og Ad-GFP ved hjelp av enten Capi eller kationisk lipid transfeksjon reagens, eller fra HeLa-celler som sendes inn til typiske proteotoxic behandlinger (HS: varmesjokk på 44 ° C i 60 min, etterfulgt av 16 timers gjenvinning ved 37 ° C; MG132: proteasominhibitor, 5 mikrometer for 16 timer), som viser nivåene av BAG3, HSPB8 og andre stress-induserbar anstand, nemlig HSP70 / HSPA / og HSP27 / HSPB1; GAPDH: lasting kontroll. Legg merke til at mens nivåene av alle proproteiner unntatt GAPDH ble økt på proteotoxic stressbehandlinger, forble de uendret ved adenofection. Protein nivåvariasjoner ble vurdert ved å laste varierende mengder HS celleekstrakter som bærer typiske økninger i HSP. (HS: 1, ½, ¼, ⅛, for eksempel, ble HSP70 indusert av mer enn åtte ganger som svar på proteotoxic stress) Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Progresjon av HeLa celler gjennom mitose ikke er betydelig forstyrret av Adenofection. (A) Representant confocal time-lapse-sekvenser fra HeLa-celler som hadde blitt adenofected med en kontroll siRNA (siCtl) sammen med BacMam- GFP-α-tubulin og BacMam -RFP-aktin og avbildes ved å spinne disk confocal mikroskop,py for 60 til 90 minutter ved ~ 1,5 minutters intervaller. Hvit og gul stjerne utpeke plasseringen av spindel stolper som forble relativt stabil. Bar: 10 mikrometer. (B) Kvantifisering av celler adenofected med siCtl eller BAG3 spesifikk siRNA, med eller uten de indikerte GFP proteiner (GFP alene eller villtype BAG3-GFP: WT). Grafen viser hvor mange prosent av cellene med unormal celledeling definert som spindel rocking og stanset i mitosen +/- eller kromosom forskyvning. Vist er midler +/- SE. Representative resultater som er vist i (B) ble tatt fra Fuchs et al., Plos Genet. 2015 23 oktober, 11 (10): e1005582, doi: 10,1371 / journal.pgen.1005582 ^14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Klikk her for å vise filmen i forbindelse med panel (A).

Figur 6. Adenofection av C2C12 muskelceller med Ad-LifeAct-GFP og myotube formasjon. Representative epifluorescence bilder av C2C12 celler som hadde blitt overtalt til å differensiere og bearbeidet for adenofection en dag senere ved hjelp av fem PFU / celle av LifeAct-GFP og 45 PFU / celle av LacZ. Bildene viser ekspresjon av GFP markør under differensieringsprosessen (dag 2, dag 6 og dag 7). Barer:. 20 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Her, beskrev vi en fremgangsmåte som muliggjør uttømming-redningsforsøk som skal utføres, noe som er anvendelig for funksjonelle analyser av celle biologiske prosesser som er spesielt følsomme for overekspresjon av proteinene som påvirker støkiometri og dynamikken i proteinkomplekser og makromolekylære strukturer. Mitotisk celledeling er et ekstremt eksempel på finstemt celle morphodynamics som involverer de mest dramatiske og spektakulære endringer i den overordnede strukturen i en celle. Bruke adenofection kombinert med kommersielt tilgjengelige BacMam reagenser for å innføre lave, men målbare mengder av aktin og tubulin markører for celle bildebehandling, kan bidraget av anstand komplekse BAG3-HSPB8 til riktig mitotiske celle ombygging være tydelig demonstrert. I en fersk undersøkelse utført av Fuchs et al., Har vi vist at uttømming av BAG3 forårsaker defekter i spindelorientering som er relatert til en manglende evne til å etablere et rigid mitotisk aktin cortex og montere aktin-rikeinntrekk av fibre ^14. Riktig spindel dynamikk kan gjenopprettes ved gjeninnføring av villtype BAG3-GFP, som også rettet nedgang sett i HSPB8 nivåer ved BAG3 lyddemping. Dette innebærer at adenofection muliggjør utvinning av en fysiologisk relevant anstand kompleks som korrelerer med funksjonelle utvinning av spindel dynamikk.

Bruk av adenofection for uttømming-redningsforsøk gir en fordel i forhold til plasmid DNA-transfeksjon eller nucleofection, noe som kan resultere i en potent induserer en stressrespons i noen celletyper (dvs. Autophagy) ^21, noe som gjør det praktisk talt umulig å analysere virkningen av en gitt anstand og dens fysiologiske rolle. Faktisk, i vårt hånd, er transfeksjon av BAG3 plasmid DNA assosiert med høyere ekspresjon per celle, aggregatdannelse, og effekter på celle apoptose / overlevelse i flere celletyper (figur 2). BAG3 er et modulært cochaperone med stillas aktivitet, som may spille flere roller avhengig av partnerproteiner ^9. Derfor kan forstyrrelser av komplekse støkiometri ved overekspresjon av BAG3 ha uønskede dominerende negative effekter og indusere toksisitet. Høy kapasitet rekombinant adenovirus er en ideell kjøretøy for transient og sikkerhet levering av store gener i både delende og ikke-delende celler i kultur som det ikke integreres i vertscellegenomet, i motsetning til lentivirus-baserte vektorer for hvilken noen sikkerhet bekymringer fortsatt. Potensiell ulempe ved bruk av adenoviruser for uttømming-rednings eksperimenter er at de krever gjentatt bearbeiding, noe som kan være tidkrevende. De stoler også på forsiktig titrering av smittsomme partikler for reproduserbar transduksjon effekt.

Bruke adenofection å skjerme bidrag kjent BAG3 funksjonelle domener, fikk vi den første bevis, så vidt vi vet, for eksistensen av en HSPB8 avhengig BAG3 funksjon i normal driftå dele celler som ikke krever sin interaksjon med HSP70 / HSPA1 anstand system. Adenofection bør være aktuelt å spore F-aktin under prosessen med myocyte differensiering til myotubes, som foreslått av dataene som er presentert her. Dermed vår metode gir en allsidig og effektiv protokoll for siRNA-baserte uttømming-redning forsøk med minimal innvirkning på celle morphodynamics som bør være nyttig i en rekke prosjekter der struktur-funksjon analyse av et gen av interesse blir forfulgt.

Utnyttelse kationiske forbindelser-lipider for å oppnå effektiv transfeksjon-transduksjon av celler med lavest mengde av viruspartikler er nøkkelen til denne metoden. Selv om det gir et større vindu for å kontrollere nivået av eksogene proteiner per celle, mener vi at det tillater videre å minimalisere potensielle bivirkninger på signaloverføringsreaksjonsveier som fører fra adenovirus cellebindings-inngang, som skal dempe virkningen av aprotein av renter på morfogenetiske veier.

Det bør bemerkes at forskjellige reagenser for å øke adenovirus transduksjon effektivitet er kommersielt tilgjengelige, slik som CAR-reseptoren booster. Slike reagenser er kostbare, imidlertid, og er forventet å fremme binding virus-inngang i celler på en måte som krever CAR-reseptoren, som som nevnt ovenfor er blitt vist å aktivere signalveier assosiert med celleform og adhesjon. Mens capi er billigere enn kationiske liposomer som et middel for å forsterke adenovirus inngang via en CAR-uavhengig reaksjonsvei, er det også mer toksisk for noen cellelinjer. Det anbefales før testing av en tom adenofection å orientere valget mellom Capi vs kationisk lipid reagens, avhengig av hvilken cellelinje som brukes, og den biologiske utlesning av interesse.

Sammen med nye bioteknologiske verktøy av genom redigering, RNA interferens-baserte knockdown-redning tilnærminger slik som den er beskrevet her har en array av kraftige molekylære verktøy for å avdekke gen-funksjon i celler, som kan nå være optimalt valgt av etterforskere avhengig av spesifikke applikasjoner ^3. Vi tror at adenofection gir en forholdsvis rask og enkelt system for å skape hypomorphic knock-out for struktur-funksjonsanalyser av bidraget av et protein av interesse i flere cellebakgrunn.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C2C12 Mouse Myoblasts	ATCC	CRL-1772
Adenovirus custom design	Welgen	Custom design
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose	Thermo Fisher	11965-092
EDTA	Sigma	E5134
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
Fibronectin	Sigma	F1141
Glass bottom dishes, 35 mm	MatTek Corperation	P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B	Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada		Klebig C et al. 2009
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
Horse Serum, New Zealand	Thermo Fisher	16050-122
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher	13778-150
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha	Wisent	310-101-CL
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides	Thermo Fisher	12000-022
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red	Thermo Fisher	41061-029
Na2HPO4	Biobasic	S0404
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
OptiMEM	Thermo Fisher	11058-021
rAVCMV-LifeAct-TagGFP2	IBIDI	60121
siRNA duplexes	Dharmacon	Custom design
Thymidine	Sigma	T9250
Trypsine 2.5%	Thermo Fisher	15090-046