Adenofection: En metode til at studere den rolle molekylchaperoner i Cellular morfologiske dynamik ved Udtømmelse-Rescue Eksperimenter

Abstract

Cellulære processer såsom mitose og celledifferentiering er reguleret af ændringer i celleform, der stort set afhængige af korrekt remodellering af celle cytoskeletale strukturer. Dette indebærer montage-adskillelse af højere orden makromolekylære strukturer på et givet tidspunkt og sted, en proces, der er særligt følsomme over for forstyrrelser forårsaget af overekspression af proteiner. Metoder, der kan bevare protein homeostase og opretholde nær-til-normal cellulær morfologi er særdeles ønskeligt at bestemme den funktionelle bidrag af et protein af interesse i en lang række cellulære processer. Forbigående udtømning-redning eksperimenter baseret på RNA-interferens er stærke metoder til at analysere protein funktioner og strukturelle krav. Men genindførelse af målproteinet med minimum afvigelse fra dets fysiologiske niveau er en reel udfordring. Her beskriver vi en fremgangsmåde benævnt adenofection der blev udviklet for at undersøge den rolle af molekylære chaperoner end partnere i den normale drift af delende celler og forholdet til actin remodeling. HeLa-celler blev depleteret for BAG3 med siRNA-duplexer målretning 3'UTR region. GFP-mærkede BAG3 proteiner blev genindført samtidigt i> 75% af cellerne under anvendelse af rekombinante adenovira koblet til transfektionsreagenser. Adenofection mulighed for at udtale BAG3-GFP-proteiner på nær fysiologiske niveauer i HeLa-celler depleteret for BAG3, i mangel af en stress-respons. Ingen effekt blev observeret på niveauerne af endogene Heat Shock Protein chaperoner, de vigtigste stress-inducerbare regulatorer af protein homeostase. Endvidere ved at tilføje baculovira driver ekspressionen af ​​fluorescerende markører på tidspunktet for celle transduktion-transfektion, kunne vi dissekere mitotiske celle dynamik ved tidsforskudt mikroskopisk analyser med minimal forstyrrelse af normal mitotisk progression. Adenofection gælder også for svære at inficere museceller, og egnet til funktionelle analyser af myoblast differentiation ind myorør. adenofection tilvejebringer således en alsidig metode til at udføre struktur-funktion analyser af proteiner involveret i følsomme biologiske processer, der er afhængige af højere orden cytoskeletale dynamik.

Introduction

Funktionel inaktivering af genekspression i pattedyrceller er den gyldne standard for at dissekere proteinfunktioner. Nyudviklede teknologier genom-redigering baseret på anvendelsen af stedspecifikke nucleaser såsom zink-finger nukleaser og grupperet regelmæssigt spatierede korte palindrome gentagelser (CRISPR) / CAS9 nu tillade generering af cellelinier med målrettet gendeletion og mutation ^1,2. Disse nye metoder skal revolutionere den måde, vi studerer protein funktion og vores forståelse af genetik for humane sygdomme. I nogle tilfælde, dog langvarig eller fuldstændige gen knockout ikke er ønskelig og kan provokere sekundære celle kompensationsordninger. Frembringelsen af ​​genetisk modificerede cellelinier kan også være begrænsende i forbindelse med behandlingen primære cellekulturer med begrænset proliferation kapacitet, eller når der søges screening af et stort sæt mutationer i forskellige celletyper. Dette er ofte nødvendigt for at bestemme afhængigheden af ​​en celle biological proces på strukturelle krav til et protein. Med henblik herpå reversibel knockdown af RNA-interferens, der muliggør transient depletion-rednings eksperimenter i forskellige cellulære baggrunde stadig en enkel og effektiv metode til at udføre struktur-funktion analyser af et protein af interesse ^3. Men en væsentlig ulempe ved denne fremgangsmåde er vanskeligheden ved at opnå effektiv lyddæmpning og at genindføre proteinet af interesse eller dets varianter ved nær fysiologiske niveauer i et flertal af cellepopulationen. Dette er afgørende for, at omfattende undersøgelser, der forsøger at korrelere funktionelle virkninger set på niveau med enkelte celler (hypomorphic fænotype) med dem, der ses i celle population assays, f.eks på protein-protein interaktioner.

Brug af klassiske transfektionsmetoder, kan man næppe opnå homogen og lav ekspression af eksogene proteiner i en stor population af celler. Transduktion af celler med rekombinante viraligesom adenovirus ofte giver mere normaliseret udtryk for eksogene proteiner. Alligevel er adenovirus optagelse begrænset af CAR-receptoren, som er fraværende i ikke-humane celler eller kun svagt udtrykt i nogle humane celletyper. Endvidere den cellulære optagelse af adenovira aktiverer signalveje, der regulerer celleform og adhæsion ^4-6. Dette er naturligvis ikke ønskeligt, når studerer reguleringsmekanismer af celle morfologiske dynamik. Vi stod overfor denne problematiske, da vi foretog funktionelle analyser af en chaperone kompleks, BAG3-HSPB8, i celledeling og aktin dynamik. Banebrydende arbejde havde beskrevet en rolle for denne chaperone kompleks på protein kvalitetskontrol og autophagy under stress ^7,8. De fleste af disse undersøgelser har imidlertid påberåbt proteinoverekspression, forudsat at chaperoner normalt opreguleres under stress. Det har efterladt åben hvorvidt BAG3, i kompleks med HSPB8, kan bidrage til den normale drift af delende celler, der udtrykker thESE chaperones ligesom mange kræft celletyper ^9. Især om chaperone komplekset bidrager til ombygningen af actin-baserede strukturer, der styrer mitotisk progression var af stor interesse på grund af de nye forbindelser mellem hspB chaperones og cytoskeletale dynamik ^10. For at løse dette problem, vi søger at udvikle en effektiv metode til udtynding-redning eksperimenter, der ikke ville forstyrre mitotisk progression eller cellulær morfologi, og som ville bevare protein homeostase at undgå sekundær forstyrrelse af dynamikken i makromolekylære komplekser regulerer celle-shape ændringer . Således ideelt set bør udføres depletion-add-back af genet af interesse samtidigt.

Anvendelsen af komplekser af adenovirus med en kationisk polymer eller lipider er blevet beskrevet at fremme genoverførsel in vitro og in vivo ^11,12. For eksempel calciumphosphat (CaPi) synes at danne et bundfald medadenovirus at forbedre virus binding-indrejse via en CAR-uafhængig vej ^13. Faktisk fandt vi, at kombinere adenovirus-baserede celle transduktion og transfektion med kationiske forbindelser kunne øge effektiviteten af ​​de udtømning-redning eksperimenter. Dette tillod os at sænke mængden af ​​virus ved 3- til 20-fold, afhængigt af cellelinjen og genet af interesse, og drage fordel af et bredere vindue for at tilpasse ekspressionen af ​​eksogene proteiner på nær endogene niveauer i flertal af en cellepopulation af interesse med minimal indvirkning på cellemorfologi. Under sådanne betingelser, kan vi også opnå høj effektivitet knockdown af endogent protein-ekspression (> 75%). Vi beskriver hermed den metode trin for trin og bevise, at protein homeostase ikke væsentligt forstyrres som vurderet af de uændrede niveauer af stress-induceret chaperones af Heat Shock Protein familie, hvilket gør metoden velegnet til funktionelle analyser af den fysiologiske role af molekylære chaperoner efter tid-lapse video mikroskopi. Protokollen er modtagelig for celle synkronisering procedurer og anvendelsen af ​​kommercielt tilgængelige baculovira for co-ekspression af lave niveauer af fluorescerende markører, med mindst mulig gene med normale actin-baserede og spindel dynamik under mitotisk progression. Vi viser yderligere alsidighed af metoden, der gælder for "svært at transducere" mus C2C12 celler, uden nogen væsentlig indvirkning på myoblast differentiering i myorør in vitro.

Protocol

1. Udarbejdelse af Medium og Solutions (alle sterilt filtreret)

1. C2C12 mus muskelceller (differentiering studier)
   1. Forbered 500 ml vækstmedium for C2C12 cellekultur vedligeholdelse: DMEM høj glucose suppleret med 10% FBS og 2 mM L-Glutamin.
   2. Forbered 100 ml Differentiering Medium (DM) til C2C12 differentiering: DMEM høj glucose suppleret med 2% Horse Serum.
2. HeLa-celler (studier i mitotiske celler)
   1. Forbered 500 ml aMEM for HeLa RFP-H2B cellekultur vedligeholdelse og eksperimenter: aMEM suppleret med 10% FBS og 2 mM L-Glutamin (aMEM ^10%).
   2. Forbered 500 ml aMEM-minus (uden deoxyribonucleosider / ribonukleosider) til HeLa RFP-H2B cellesynkronisering: aMEM-minus suppleret med 10% FBS og 2 mM L-glutamin (aMEM-minus ^10%).
   3. Forbered 20 ml aMEM uden phenolrødt for HeLa-RFP-H2B live erhvervelse celle: aMEM uden phenolrødt suppleret med 10% FBS og 2 mM L-Glutamin.
   4. Forbered 100 mM thymidin: opløs 24,2 mg i 1 ml _H2O ved 37 ° C ved hvirvelbehandling. Filter sterilisere og holde ved 4 ° C.
3. fælles løsninger
   1. Forbered 0,05% trypsin / EDTA: 0,05% trypsin, 0,625 mM EDTA i 1 x phosphatbufferet saltvand (PBS). Filtersteriliser og lagre alikvoter ved -20 ° C. Efter optøning holde alikvot ved 4 ° C.
   2. Forbered HBS2x: 280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM Na ₂ HPO _4. Indstil pH nøjagtigt mellem 7,01-7,05 med 10 N NaOH. Filter steril og holde ved 4 ° C.

2. Belægning af Cell Culture Plader med Fibronectin og Plating af HeLa-RFP-H2B Cells

BEMÆRK: Før forsøget, bør hver manipulator etablere de optimale celleudpladning betingelser for at opnå en ordentlig tæthed af celler, idet variationer kan oCcur mellem hver manipulator og hver forskellig cellelinie.

1. Dagen før eksperimentet, udvide HeLa-RFP-H2B celler for at sikre, at de er inden for den eksponentielle vækstfase på dagen for plating. Lav 2 successive 1/3 fortyndinger i 10 cm plader startende fra en 80% sammenflydende 1x10 cm plade.
   BEMÆRK: Planlæg antallet af plader til eksperimentet. Beregn hver betingelse som dubletter, en for kortvarig live-cell imaging og én til proteinekstrakter at fastlægge effekten af ​​knockdown og eksogent protein ekspression ved Western blot analyse. Planlægge en yderligere plade til bestemmelse af celletallet før virus transduktion.
2. Før celleudpladning, frakke glasbund retter med 10 ug / ml fibronectin. Tilsæt 1 ml af en 1: 100 fortynding af 1 mg / ml fibronectin (fortyndet i sterilt 1x PBS) pr 35 mm skål til godt dække hele overfladen og inkuberes i 1 time ved 37 ° C, _5% CO2.
3. Under inkubationen, præ-varm aMEM suppleret with 10% FBS (aMEM ^10%) og 0,05% trypsin / EDTA ved 37 ° C.
4. Efter 45 minutters inkubation, begynde at forberede cellen opløsning. I den sterile hætte, aspireres mediet fra en 10 cm plade, skylles forsigtigt to gange med 1,5 ml 0,05% trypsin / EDTA, og efterlade 0,5 ml trypsin / EDTA ved den sidste aspiration.
5. Inkubér cellerne i 2-3 min ved 37 ° C, _5% CO2. Ved forsigtigt at banke på pladen og observation under mikroskop, kontrollere, at alle celler er blevet løsrevet. Der tilsættes 10 ml aMEM ^10% og pipette forsigtigt flere gange for at adskille cellerne. Tæl en 10 pi prøve af cellesuspensionen ved anvendelse af et hæmocytometer.
6. Aspirer fibronektin løsning fra glasbund retter. Lad ikke fibronektin at tørre ud før celleudpladning.
7. Plade 1,5x10 ⁵ celler pr 35 mm skål i 2 ml aMEM ^10% og inkuberes ved 37 ° C, _5% CO2. Kontrollere efter 30-45 minutter under mikroskopet, at cellerne er godt SEPAvurderet, da de har tendens til at ophobe sig i midten af ​​pladen.
8. Hvis det er nødvendigt, agitere pladerne forsigtigt over kors at omfordele cellerne. Plade én 35 mm plade ud over række betingelser for at tælle antallet af celler før virus transduktion.
9. Grow celler indtil den næste dag for at opnå en celletæthed på mindst 50%. En celle densitet lavere end 50% resulterer i en signifikant reduktion af virus transduktion effektivitet, øget variationer af proteinekspression per celle, og øget celletoksicitet.
   BEMÆRK: Belægning af glas retter med fibronektin forbedrer cellevækst og morfologi og fremmer ordentlig progression af celler gennem mitose. Det kan generelt erstattes af kommercielt tilgængelig gelatine, der er billigere.

3. Adenovirus Transduktion og endogent protein knockdown af siRNA Transfektion i HeLa-RFP-H2B celler under anvendelse CaPi Præcipitater

Forsigtig! Arbejdeing med virus kræver særlige forholdsregler og en korrekt bortskaffelse af alt materiale, der har været i kontakt med virus.

Forsigtig! I vores hænder, CaPi udfældes ofte har mere bivirkninger, for eksempel på biologiske processer, der involverer vesikeltrafik (f.eks autofagi). Følgelig er det anbefales at anvende et kationisk lipid transfektionsreagens (se nedenfor) og vente mindst 48 timer før analyserne.

BEMÆRK: En kontrol-adenovirus bærer et ubeslægtet gen (dvs. LacZ) eller ingen gen anvendes til at nå en minimal MOI i alle Adenofections (10-20 pfu / celle) ved anvendelse af laveste mængde rekombinant adenovirus, der bærer genet af interesse.

BEMÆRK: Denne procedure har vist sig at hjælpe normaliserende ekspression per celle i en stor cellepopulation.

1. En dag efter celleudpladning, tælle antallet af celler fra den yderligere belagt skålen. Aspirer mediet ogskylles en gang med 1 ml 0,05% trypsin / EDTA. Tilføj again 1 ml 0,05% trypsin / EDTA og inkuberes ved 37 ° C, _5% CO2, indtil alle celler er fritliggende. Separere cellerne brønd med en 1 ml pipette og tælle antallet af celler pr ml ved anvendelse af et hæmocytometer.
2. Bestemme mængden af virus til at transducere celler ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 2 plaquedannende enheder (PFU) af proteinet af interesse (POI) per celle og 18 PFU per celle i en tom vektor (f.eks LacZ) at have i alt 20 PFU per celle. Samtidig transducere 4 PFU af hver baculovirus (Actin og αTubulin, GFP og RFP-mærkede henholdsvis). Transducere cellerne ved anvendelse af følgende adenofection protokol. Vira blev anvendt som beskrevet i Fuchs et al. ¹⁴
3. Forbered i en steril hætte et 1,5 ml plastrør for hver tilstand, og der tilsættes 400 pi varm aMEM-minus ^10%.
4. Tø en alikvot af viraene langsomt på is og, om nødvendigt fortynde than virus lager for at pipetteres et volumen på mere end 1 pi at minimere pipetteringsfejl.
5. Tilsæt beregnede virus mængde pr betingelse for hver 1,5 ml plastrør indeholdende 400 pi aMEM-minus ^10% og bland forsigtigt ved pipettering. Anbring virus lager straks tilbage ved -80 ° C for at holde dets aktivitet.
6. Aspirer mediet fra cellerne og forsigtigt pipetteres virus mix dråbevis. Inkuber cellerne ved 37 ° C, _5% CO2 og agitere pladerne omhyggeligt under sterile hætte hver 15 min i 1 time til godt dække cellerne med viruset. Ved hjælp af en lille mængde medium letter kontakt af virusset med cellerne.
7. Efter inkubation forsigtigt pipetteres 1,6 ml aMEM-minus ^10% til hver plade til opnåelse af et samlet volumen på 2 ml, starte cellesynkronisering ved tilsætning af 2 mM thymidin og inkuberes cellerne i yderligere 2 timer ved 37 ° C, _5% CO2 .
8. Mellemtiden forbereder siRNA transfektion mix following CAPI transfektion metode (se figur 1). Hvis der ikke siRNA er nødvendigt udskiftes mængden af siRNA af sterilt vand til at udføre en tom transfektion.
9. Beregn 200 pi mix for hver betingelse, hvilket resulterer i 400 pi pr duplo. Det følgende eksempel er givet for en afsluttende siRNA koncentration på 50 nM og skal tilpasses til hvert protein af interesse. I et 1,5 ml plastrør, pipette 50 pi 1 M _CaCl2 og 11 pi 20 pM siRNA i 139 pi sterilt _H2O og vortexes. Efter en hurtig centrifugering, forsigtigt tilsættes dråbevis 200 pi HBS2x (280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, pH 7,01-7,05).
   BEMÆRK: mindre dråberne den mindre er bundfaldene, hvilket resulterer i bedre transfektionseffektivitet. Bland forsigtigt tre gange med fly injektion under anvendelse af en 200 pi-pipette.
10. Inkuber blandingen i 30 minutter ved stuetemperatur. Tilsæt langsomt dråbevis 200 pi transfektion mix til hver plade ogagitere cross-wise. Overfør pladerne ved 37 ° C, _5% CO2 i 16 timer.
11. Den næste dag, skylles cellerne to gange med 2 ml varm HEPES (6,7 mM KCI, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7.3), og der tilsættes 2 ml aMEM-minus ^10%. Fortsæt ikke med mere end fire celleplader ad gangen, da variationer i temperaturen påvirke længden af ​​cellecyklussen.
12. Visualiser infektionen effektivitet under et omvendt fluorescerende mikroskop ved en forstørrelse på 20-40x (luft) og erhverve tre repræsentative billeder pr tilstand i både fluorescerende og transmission kanaler til dokumentation. Syv timer senere, der tilsættes 2 mM thymidin og inkuberes i yderligere 16 timer ved 37 ° C, _5% CO2.
13. Den følgende dag, 48 timer efter siRNA transfektion og virusinfektion, skylles cellerne to gange med 2 ml varm phosphatpuffer saltvand (PBS), og slip i 7 timer i 2 ml aMEM ^10% w / o Phenol Red for levende celler eller med phenol Rød for protein udvinding.
14. Harvest celler for hver betingelse 48 timer efter transfektion til fremstilling af proteinekstrakter og Western blot-analyse for at bestemme effektiviteten af knockdown og ekspressionen af det endogene protein ^15.
    BEMÆRK: Brug antistoffer mod proteinet af interesse og relevante antistoffer tjener som lastning kontrol. Effektiviteten af knockdown bør bestemmes ved at indlæse faldende mængder af kontrol cellelysater (transficeret med kontrol siRNA), for at tilvejebringe en titreringskurven (dvs. 1, ½, ¼, ⅛).

4. Adenovirus Transduktion og endogent protein knockdown af siRNA Transfektion i HeLa celler under anvendelse et kationisk lipid transfektionsreagens

BEMÆRK: Her præsenterer vi en protokol, der blev tilpasset til eksperimenter, der ikke involverer celle synkronisering og / eller når siRNA transfektion ikke kan udføres af CAPI-metoden, for eksempel for at undgå uønskede toksiske virkninger i nogle celle lines. Denne protokol omfatter også en celle -genudpladning trin efter adenofection for at arbejde ved en passende celledensitet. Vi har kun testet det kationiske lipid transfektionsreagens.

Forsigtig! Arbejde med virus kræver særlige forholdsregler og en korrekt bortskaffelse af alt materiale, der har været i kontakt med virus.

1. Plade 1,75 x 10 ⁵ celler pr 35 mm skål i 2,5 ml aMEM ^10% og inkuberes ved 37 ° C, _5% CO2. Plade én 35 mm plade ud over række betingelser for at tælle antallet af celler før virus transduktion.
2. Grow celler indtil den næste dag for at opnå en celletæthed på mindst 50%. En celle densitet på mindre end 50% resulterer i et signifikant fald i virus transduktion effektivitet, øget variationer af proteinekspression per celle, og øget celletoksicitet.
3. En dag efter celleudpladning, tælle antallet af celler fra den yderligere belagt skålen. Aspirermediet og skyl gang med 1 ml 0,05% trypsin / EDTA. Tilføj again 1 ml 0,05% trypsin / EDTA og inkuberes ved 37 ° C, _5% CO2, indtil alle celler er fritliggende. Separate celler brønd med en 1 ml pipette og tælle antallet af celler pr.
4. Bestemme mængden af virus til at transducere en infektionsmultiplicitet (MOI) på 20-40 plaquedannende enheder (PFU) af proteinet af interesse (POI) per celle og 0-20 PFU pr celle i en tom vektor (f.eks LacZ) at have i alt 40 PFU per celle.
5. Forbered i en steril hætte et 1,5 ml plastrør for hver tilstand, og der tilsættes 400 pi varm aMEM ^10%.
6. Tø en alikvot af viraene langsomt på is og, om nødvendigt fortynde virusstamopløsningen for at pipetteres et volumen på mere end 1 pi at minimere pipetteringsfejl.
7. Tilsæt beregnede virus mængde pr betingelse for hver 1,5 ml plastrør indeholdende 400 pi aMEM ^10% og bland forsigtigt ved pipettering. Place the virus lager straks tilbage ved -80 ° C for at holde dets aktivitet.
8. Aspirer mediet fra cellerne og forsigtigt pipetteres virus mix dråbevis. Inkuber cellerne ved 37 ° C, _5% CO2 og agitere pladerne omhyggeligt under sterile hætte hver 15 min i 1 time til godt dække cellerne med viruset fortynding. Ved hjælp af en lille mængde medium letter kontakt af virusset med cellerne.
9. Mellemtiden forbereder siRNA transfektion mix efter transfektion metode. Hvis der ikke siRNA er nødvendigt udskiftes mængden af siRNA ved medium uden serum til at udføre en tom transfektion.
   1. Det følgende eksempel er givet for en afsluttende siRNA koncentration på 50 nM og skal tilpasses til hvert protein af interesse. For hver adenofection, forberede en 1,5 ml plastrør indeholdende 416 nM siRNA i 150 pi medium uden serum (f.eks, 6,25 pi 20 pM siRNA + 144 pi medium uden serum) og en 1,5 ml plastrør containing 6,25 pi kationisk lipid transfektionsreagens + 144 pi medium uden serum.
   2. Bland indholdet af hvert plastrør ved pipettering op og ned adskillige gange med en 200 pi pipette. Kombiner indholdet af begge rør og blandes ved pipettering op og ned adskillige gange med en 200 pi pipette. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
10. Efter inkubering med virus, forsigtigt pipetteres 1,8 ml aMEM ^10% til hver plade til opnåelse af et samlet volumen på 2,2 ml og straks tilføje langsomt dråbevis siRNA transfektion mix til hver plade og agitere cross-wise. Overfør pladerne ved 37 ° C, _5% CO2 i 24 timer.
11. Den næste dag, re-plade cellerne fra hver 35 mm plade i fire nye 35mm plader i 2,5 ml aMEM ^10% hver og inkuberes i yderligere 24 timer ved 37 ° C, _5% CO2.
12. Den næste dag, 48 timer efter siRNA transfektion og virusinfektion, høst celler fra én plade for hver betingelse for fremstilling afproteinekstrakter og Western blot-analyse for at bestemme effektiviteten af knockdown og ekspressionen af det endogene protein ^15.
    BEMÆRK: Med de resterende plader, fortsætte med celle fiksering, ved anvendelse af protokollen af valg og underkaste prøverne til immunofluorescens analyse med antistofferne af interesse ^14.

5. Levende Cell Imaging af mitotiske celler og Data Analysis

1. Udføre kortvarige levende celler eksperimenter på mitotiske celler med et inverteret mikroskop udstyret med et befugtet / _5% CO2 / termo-reguleret kammer.
   BEMÆRK: I denne undersøgelse blev en roterende skive konfokalt mikroskop (40X, 0,75 NA) anvendes, udstyret med en EMCCD afkølet ladningskoblet kamera ved -50 ° C.
2. Forud for overtagelsen, kontrollere, at kammeret har nået en passende temperatur på 37 ° C.
   BEMÆRK: Det kan tage flere timer, afhængigt af den mikroskopiske system.
3. Placer kultur retter i microscope kammer 1 time før overtagelsen for at muliggøre korrekt balance af mediet og undgå fokus drifting på grund af temperaturændringer. Overvåg mitotiske status af cellerne. På dette tidspunkt bør 10-15% af cellerne være i de tidlige stadier af mitose (profase-prometafasen).
4. Under ligevægtstidspunktet, oprettet parametre erhvervelse som bestemt i tidligere eksperimenter. Typisk en eksponeringstid for begge kanaler (488 og 594) på ​​0,2-3 sek med en laser intensitet på 100% og en følsomhed på 121-130 er egnede parametre i vores hænder.
   BEMÆRK: Første test bør foretages for at bestemme den mindste laser intensitet og erhvervelse tid / interval, der resulterer i en passende opløsning med minimum fotoblegning der forårsager celle skader og forstyrrer mitotisk progression.
5. Vælg flere felter pr betingelse for at opnå et betydeligt antal celler for at analysere uden at overskride erhvervelse interval. Ved hjælp af en roterende disk konfokal system, et typisk opsætning vil i, kan nævnes fire forskellige betingelser, 7 felter pr plade og 2 farvekanaler (488 og 594) med en 1,5-2 min interval over en 75 min periode.
6. Vælg celler, der ved mitotisk indgang, re-sat fokus er valgt, når alle felter og start købet så hurtigt som muligt.
7. Overvåg stabiliteten af ​​systemet i mindst tre tidspunkter og re-indstille fokus om nødvendigt.
8. Efter den første kortsigtede levende celler af 75 min, kan nye områder mitotiske celler vælges til at erhverve et andet sæt af film til at øge antallet af celler, der analyseres.
9. Bestem veldefinerede kriterier til at analysere de mitotiske fænotyper af celler, der vil afhænge af de fluorescerende markører, der anvendes. Fejl i mitose kan omfatte forlænget tid i mitose (fra nuklear nedbrydning indtil anafase), kromosom forskydning, spindel vuggende, og cortex blebbing ^14.

6. LifeAct-TagGFP2 Adenovirus transduktion i Differentiating C2C12 Mouse Myoblaster

BEMÆRK: adenofection protokol gælder også for svære at inficere mus C2C12 myoblaster gennemgår differentiering.

1. Plade 2 x 10 ⁵ C2C12 celler i 35 mm dyrkningsskåle i vækstmedium på plast eller på et substrat af valg.
   BEMÆRK: Cell differentiering er forbedret på gelatine- eller Matrigelcoatede retter. Planlægge en yderligere plade til bestemmelse af celletallet før virus transduktion.
2. Den følgende dag celler skal have nået 80% konfluens. Inducerer myoblast differentiering ved vask af cellerne to gange med varm PBS og tilsætning af 2 ml differentiering medium (DM).
3. Den næste dag, mærket som dag 1 (D1) af differentiering, transducere myocytter med adenovirus LifeAct-TagGFP2 at visualisere actincytoskelettet i levende celler. Tæl celletallet fra den ekstra plade som beskrevet under 3.2. Beregn 5 PFU / celle i LifeAct-TagGFP2 adenovirus og 45 PFU / celle AdLacZ efter eksamenPLE beskrevet i tabel 1. Den samlede virus mængde er 50 PFU / celle. Vira blev anvendt som beskrevet ¹⁴
4. Forbered i en steril hætte et 1,5 ml plastrør for hver tilstand, og der tilsættes 400 pi varm DM.
5. Tø en alikvot af viraene langsomt på is og, om nødvendigt fortynde virusstamopløsningen for at pipetteres et volumen på mere end 1 pi at minimere pipetteringsfejl.
6. Tilsæt passende mængde viruspartikler pr betingelse til hver 1,5 ml plastrør indeholdende 400 pi DM og blandes forsigtigt ved pipettering. Anbring virus lager straks tilbage ved -80 ° C for at holde dets aktivitet.
7. Aspirer mediet fra skålene og forsigtigt pipetteres virus mix dråbevis. Inkuber cellerne ved 37 ° C, _5% CO2 og agitere pladerne omhyggeligt under sterile hætte hver 15 min i i alt 1 time til godt dække cellerne med viruset.
8. Efter inkubation forsigtigt pipette 1,6 ml DM på hver plade og fortsætte incubation i yderligere 2 timer ved 37 ° C, _5% CO2.
9. Mellemtiden forbereder en tom transfektion mix efter CaPi-transfektion. Beregn 200 pi mix for hver betingelse. Benytte følgende eksempel for et samlet volumen på 400 pi blanding.
   1. I en 1,5 ml plastikrør, pipette 50 pi 1 M _CaCl2 i 150 pi sterilt H ₂ O og vortexes. Efter en hurtig centrifugering, forsigtigt tilsættes dråbevis 200 pi HBS2x (280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, pH 7,01-7,05). bland forsigtigt ved lufttilførsel tre gange under anvendelse af en 200 pi pipette.
10. Inkuber blandingen i 30 minutter ved stuetemperatur. Tilsæt langsomt dråbevis 200 pi af Transfektionsblandingen til hver plade og agitere cross-wise. Overfør pladerne ved 37 ° C, _5% CO2 i 16 timer.
11. Den næste dag, skylles cellerne to gange med 2 ml varm HEPES (6,7 mM KCI, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7.3), og der tilsættes 2 ml DM. Visualiser infeIndsatsen effektivitet under et omvendt fluorescerende mikroskop ved en forstørrelse på 20-40X (luft) og erhverve tre repræsentative billeder pr tilstand i både fluorescerende og transmission kanaler til dokumentation.
12. Afhængigt af den ønskede eksperimentopsætningen Følg differentiation til myotuber i flere dage. Celler kan fikseres og efterfølgende udsat for immunfluorescens analyse eller levende celler studier kan udføres.

Representative Results

Transfektion af BAG3-GFP-plasmid-DNA under anvendelse af kationiske lipider var forbundet med heterogen ekspression i HeLa-celler, nogle celler viser knap nok detekterbare niveauer af proteinet og andre, der bærer meget høje BAG3 niveauer (figur 2A). I disse celler blev tab af protein homeostase påvist ved akkumulation af BAG3-GFP i perinukleære aggregater (figur 2A, pile). I modsætning hertil celle transduktion med adenoviruser transporterer BAG3-GFP udviste mere homogen lav ekspression og nøjagtig lokalisering af BAG3-GFP (figur 2B, infektion alene). Bemærkelsesværdigt, tilsætning af kationiske lipider under adenovirus transduktion (dvs. transfektion af adenoviruspartikler) signifikant forøget BAG3-GFP-ekspression per celle på lignende MOI, mens det tillades holde homogen ekspression i de fleste celler (figur 2B, Adenofection).

udfælder eller liposombaserede forbindelser til at øge transduktionen-transfektionseffektivitet i HeLa-celler. Figur 3 viser et typisk forsøg med vildtype BAG3 (WT) -GFP eller en BAG3 (IPV) GFP variant bærer mutationer, som ophæver binding til en af dens chaperone partnere HSPB8 (figur 3A, 3B). I overensstemmelse med en rolle for BAG3 i stabilisering af HSPB8 ^7, lyddæmpning af BAG3 førte til et fald i niveauet af HSPB8, der blev gendannet til normale niveauer efter genindførelse af BAG3 WT ~ 50%, men ikke ved ekspression af samme indhold af mutant af BAG3 (IPV) -GFP eller GFP alene. Under disse betingelser blev BAG3-GFP-proteiner passende lokaliseret i ~ 75-90% af cellerne, beriges ved perinukleære-centrosomal regioner (figur 3C, 3D). Denne Suggseret, at adenofection bevaret dynamikken i BAG3 og den BAG3-HSPB8 kompleks i celler.

HSPB8 og BAG3 opreguleres af forskellige proteotoxic understreger, at også forstyrrer cytoskeletal proteostasis ^10. Derfor overekspression af chaperoner kan potentielt forstyrre montage-adskillelse af makromolekylære strukturer styrer cellulære morfologiske dynamik. For at vurdere den rolle, BAG3-HSPB8 under ikke-stressede vilkår, var det vigtigt at kontrollere, at protein homeostase var minimalt forstyrres af den adenofection procedure. Med henblik herpå, overvågning variationer i niveauet af chaperones af varmechokproteinet familie er en god indikation af status af protein homeostase. Som vist i figur 4, adenofection af CAPI eller liposom-baserede metoder ikke signifikant øger niveauerne af endogene HSPB8 og BAG3, eller hvad angår den hyppigste HSP70 / HSPA1 chaperone-system. I modsætning hertil typiskproteotoxic behandlinger som varme stød eller MG132, en proteasominhibitor, øgede niveauer af chaperone-cochaperone proteiner i HeLa-celler.

Vi forsøgte derpå at bestemme, om adenofection procedure kombineret med baculovira køre ekspression af actin og tubulin fluorescerende prober (BacMam-RFP-actin og GFP-αtubulin) var egnet til sporing mitotiske celle dynamik. Som vist i figur 5, har adenofection af HeLa celler med en kontrol siRNA (siCTL) ikke forstyrre mitosespindelen dynamik (grøn) eller den gennemsnitlige tid tilbragt i mitosen (figur 5A, repræsentativt konfokale time-lapse sekvenser). Andelen af disse celler, der viser unormale mitotiske begivenheder var i overensstemmelse med niveauerne af mitotiske defekter generelt observeret i kræft cellelinjer (~ 30% -40%, figur 5B). I modsætning hertil celler adenofected med BAG3-specifikke siRNA alene (siBAG3) udviste en ~ 2-fold stigning i nivl af mitotiske fænotypiske defekter, som blev gendannet til nær niveauet i kontrolceller ved BAG3-GFP (WT), men ikke af GFP alene. Dette valideret egnethed adenofection til funktionel analyse af virkningen af BAG3 og dens tilknyttede chaperones på cytoskeletale dynamik, der regulerer ordentlig progression af celler i og ud af mitose, som det fremgår af Fuchs et al ^14.

For at verificere alsidighed adenofection metode, vi så tilpasset den protokol for at muliggøre visualisering af F-actin under differentiering af mus C2C12 myocytter, ved hjælp af kommercielt tilgængelige adenovirus-LifeAct-GFP at mærke F-actin ^16. C2C12-celler blev induceret til at differentiere til en dag før Adenofection. Brug af CaPi-baserede adenofection protokol, bemærkelsesværdigt lave mængder af adenovirus-LifeAct-GFP tilstrækkeligt til at udtrykke proben på et niveau, der let blev detekteret ved fluorescens mikroskopi i en betydelig del af differe ntiating myocytter (~ 3-5 PFU / celle, figur 6). Dette var i skarp kontrast til den ekstremt høje infektionsmultiplicitet rapporteret i litteraturen til at transducere muse C2C12 celler (i størrelsesordenen 250-400 MOI) ^17-19. Endvidere ved overvågning af differentieringsprocessen i 7 dage, vi etableret, at myotube dannelse ikke blev væsentligt forringet ved fremgangsmåden. Dette antydede, at myocyt fusion, en proces, der beror på fint afstemte actin dynamik ^20, ikke var forstyrres af ekspression af lave niveauer af LifeAct-GFP (figur 6, Day 6 og dag 7). Da stadig kan detekteres fluorescerende markør mange dage efter adenofection af C2C12 celler, mener vi, at denne metode vil være egnet til funktionelle analyser af virkningen af ​​chaperoner på actin dynamik på forskellige stadier af C2C12 myogenese.

jove_content "fo: holde-together.within-page =". 1 "> Tabel 1. Beregning af adenovirus MOI Vist er et eksempel på, hvordan man beregner antallet af adenovirus plakdannende enheder (PFU) er nødvendige til infektion af et defineret antal af celler overvejer forskellige virustitere.

Figur 1. Planlægning af en typisk adenofection protokol. Successive trin et typisk forsøg er vist for den protokol under anvendelse CaPi præcipitater (understreget i gråt) eller protokollen ved anvendelse af en kationisk lipid transfektionsreagens (fremhævet med gult), herunder celleudpladning, transduktion af adeno- og baculovira, transfektion af siRNA-duplexer, og celle synkronisering med en dobbelt thymidin blok. Tidslinier i timer for begge protokoller er vist på højre side af figuren.fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Homogen og effektiv ekspression af BAG3-GFP ved anvendelse Adenofection. (A) Repræsentative epifluorescens billeder af HeLa-celler som var blevet transficeret med BAG3-GFP plasmid-DNA, der viser perinukleære aggregater af proteinet ved høje ekspressionsniveauer (betegnet ved pile) og heterogen ekspression i cellepopulationen. Western blots viser højere ekspression af BAG3-GFP i forhold til endogene BAG3 niveauer i den samlede cellepopulation, hvilket indikerer, at proteinet i høj grad er overudtrykt i nogle celler. (B) Repræsentative epifluorescens billeder af HeLa-celler, der kun var blevet transduceret eller adenofected hjælp stigende mængder af Ad-BAG3-GFP viruspartikler. Billederblev erhvervet ved hjælp af identiske parametre og var lige behandlet for baggrunden subtraktion og intensitet; Bar:. 50 um Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Effektiv knockdown af BAG3 og genindførelse af BAG3-GFP-proteiner på nær endogene niveauer. (AB) HeLa-celler, der udtrykker RFP-H2B (A) eller parentale HeLa-celler (B) blev adenofected med de angivne siRNA'er og rekombinante adenovira hjælp af CaPi fremgangsmåde (A) eller liposombaserede forbindelser som transfektionsreagens (B). Cellerne blev synkroniseret med den dobbelte thymidin blok metode og totale celleekstrakter blev udarbejdet under den anden fase af frigivelsen. Weste rn blots viser BAG3 udtynding niveauer (BAG3 endogene), niveauerne af adenofected BAG3-GFP proteiner og endogene niveauer af HSPB8; GAPDH niveauer: lastning kontrol. Udtømning blev anslået til> 75% ved at indlæse faldende mængder kontrol ekstrakter (adenofected med kontrol siRNA-siCtl og BAG3-GFP WT, dvs ½, ¼). Bemærk, at enkelte BAG3-GFP proteiner blev introduceret på nær den endogene niveau af BAG3 og at vildtype BAG3-GFP, men ikke BAG3 (IPV) GFP eller GFP alene, restaureret HSPB8 niveauer i BAG3-udtømte celler. (CD) Repræsentative epifluorescens billeder af HeLa-celler, der var blevet adenofected med den angivne rekombinante Ad-BAG3-GFP ved hjælp CaPi eller kationisk lipid transfektionsreagens. Stænger: 20 pm. Repræsentative resultater vist i (A) og (C) er modificeret fra Fuchs et al., PLoS Genet. 2015 okt 23; 11 (10): e1005582, doi: 10,1371 / journal.pgen.1005582 ^14.Iles / ftp_upload / 54.557 / 54557fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Adenofection ikke inducerer en stress reaktion i HeLa celler Western blots af totale celleekstrakter fremstillet ud fra kontrol HeLa-celler. (NT: ikke behandlet) eller HeLa-celler transficeret med kontrol siRNA alene (siCtl, ingen adenovirus), eller adenofected med siCtl og Ad-GFP ved hjælp af enten CaPi eller kationiske lipid transfektion reagens, eller fra HeLa-celler indsendt til typiske proteotoxic behandlinger (HS: varmechok ved 44 ° C i 60 minutter efterfulgt af 16 timer genvinding ved 37 ° C; MG132: proteasominhibitor, 5 uM i 16 timer), der viser niveauerne af BAG3, HSPB8 og andre stress-inducerbare chaperoner, nemlig HSP70 / HSPA / og HSP27 / HSPB1; GAPDH: lastning kontrol. Bemærk, at mens niveauerne af alle proproteiner undtagen GAPDH blev forøget på proteotoxic stress behandlinger, forblev de uændrede ved adenofection. Protein niveau variationer blev vurderet ved at indlæse varierende mængder af HS celleekstrakter der bærer typiske stigninger i HSP'er. (HS: 1, ½, ¼, ⅛, for eksempel, var HSP70 induceret med mere end 8 gange i svar på proteotoxic stress) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Progression af HeLa-celler gennem mitose ikke væsentligt forstyrres af Adenofection. (A) Repræsentant konfokale time-lapse sekvenser fra HeLa-celler, der var blevet adenofected med en kontrol siRNA (siCtl) sammen med BacMam- GFP-α-tubulin og BacMam -RFP-actin og afbildes af roterende skive konfokal microscopy for 60 til 90 minutter ved ~ 1,5 minutters intervaller. Hvide og gule asterisk udpege placeringen af ​​spindel poler, der forblev relativt stabil. Bar: 10 pm. (B) Kvantificering af celler adenofected med siCtl eller BAG3-specifik siRNA, med eller uden de angivne GFP-proteiner (GFP alene eller vildtype BAG3-GFP: WT). Grafen viser de procentdele af celler med unormal mitose defineret som spindel rocking og gået i stå i mitose +/- eller kromosom forskydning. Vist er midlet +/- SE. Repræsentative resultater er vist i (B) blev taget fra Fuchs et al., PLoS Genet. 2015 okt 23; 11 (10): e1005582, doi: 10,1371 / journal.pgen.1005582 ^14. Klik her for at se en større version af dette tal. Klik her for at se filmen i forbindelse med panel (A).

Figur 6. Adenofection af C2C12 myocytter med Ad-LifeAct-GFP og myotube formation. Repræsentative epifluorescens billeder af C2C12 celler, der var blevet induceret til at differentiere og behandles til adenofection 1 dag senere med 5 PFU / celle i LifeAct-GFP og 45 PFU / celle af LacZ. Billeder viser ekspression af GFP markør under differentieringsprocessen (dag 2, dag 6 og dag 7). Barer:. 20 pm Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Her beskrev vi en metode muliggør udtømning-redning eksperimenter, der skal udføres, som finder anvendelse på funktionelle analyser af celle biologiske processer, der er særligt følsomme over for overekspression af proteiner, der påvirker støkiometri og dynamik protein komplekser og makromolekylære strukturer. Mitotisk celledeling er et ekstremt eksempel på fint afstemte celle morfologiske dynamik, der involverer de mest dramatiske og spektakulære ændringer i den overordnede struktur i en celle. Brug adenofection kombineret med kommercielt tilgængelige BacMam reagenser til at indføre små men påviselige mængder af actin og tubulin markører for cell imaging, kunne bidrag chaperone komplekse BAG3-HSPB8 til ordentlig mitotisk celle remodeling klart demonstreret. I en nylig undersøgelse fra Fuchs et al., Har vi vist, at udtømning af BAG3 forårsager defekter i spindelorientering der er relateret til en manglende evne til at etablere en stiv mitotisk actin cortex og samle actin-rigetilbagetrækningsmekanismer fibre ^14. Korrekt spindel dynamik kunne genoprettes ved genindførelse af vildtype BAG3-GFP, som også korrigeret faldet set i HSPB8 niveauer upon BAG3 lyddæmpning. Dette indebærer, at adenofection muliggør genvinding af en fysiologisk relevant chaperone kompleks, der korrelerer med funktionel genopretning af spindel dynamik.

Anvendelse af adenofection for depletion-redningsforsøg tilvejebringer en fordel i forhold plasmid DNA-transfektion eller nucleofection, hvilket kan resultere i en potent induktion af en stressreaktion i nogle celletyper (dvs. autophagy) ^21, hvilket gør det næsten umuligt at analysere virkningen af et givet chaperone og dens fysiologiske rolle. Ja, i vores hånd, transfektion af BAG3 plasmid-DNA er forbundet med højere ekspression per celle, aggregatdannelse, og virkninger på celle apoptose / overlevelse i flere celletyper (figur 2). BAG3 er et modulært cochaperone med stillads aktivitet, hvor May spille flere roller afhængigt af dets partnerlande proteiner ^9. Derfor kan forstyrrelser af komplekse støkiometri ved overekspression af BAG3 have uønskede dominerende negative virkninger og fremkalde toksicitet. Høj kapacitet rekombinant adenovirus er et ideelt middel til den forbigående og sikkerhed levering af store gener i både dividere og ikke-delende celler i kultur, da den ikke integrere i værtscelle-genomet, i modsætning til lentivirus-baserede vektorer, hvor nogle sikkerhed bekymringer stadig. Potentiel ulempe ved brugen af ​​adenovirus til udtømning-redning eksperimenter er, at de kræver gentagne forberedelse, hvilket kan være tidskrævende. De er også afhængige af omhyggelig titrering af infektiøse partikler for reproducerbar transduktion effektivitet.

Brug adenofection at screene bidrag kendte BAG3 funktionelle domæner, opnåede vi de første beviser, at vores viden, for eksistensen af ​​en HSPB8-afhængig BAG3 funktion i normal driftaf delende celler, der ikke kræver sin interaktion med HSP70 / HSPA1 chaperone system. Adenofection bør gælde for spore F-actin under processen med myocyt differentiering i myorør, som foreslået af de data, der præsenteres her. Således vores metode giver en alsidig og effektiv protokol for siRNA-baserede udtynding-redning eksperimenter med minimal påvirkning af celle morfologiske dynamik, der bør være nyttige i en lang række projekter, hvor struktur-funktion analyse af et gen af ​​interesse forfølges.

Udnyttelse kationiske forbindelser-lipider for at opnå effektiv transfektion-transduktion af celler med den laveste mængde af viruspartikler er nøglen til denne fremgangsmåde. Mens det tilvejebringer et større vindue til styring af niveauet af eksogene proteiner per celle, mener vi, at det muliggør endvidere minimere potentielle bivirkninger på signaltransduktionsveje der skyldes adenovirus cellebindende-entry, som bør afbøde virkningerne af aprotein af renter på morfogenetiske veje.

Det skal bemærkes, at forskellige reagenser for at øge adenovirus transduktionseffektivitet er kommercielt tilgængelige, såsom CAR receptor booster. Sådanne reagenser er dyre, men, og forventes at fremme virusbinding-indtrængen i celler på en måde, som kræver CAR-receptoren, der som nævnt ovenfor har vist sig at aktivere signalveje forbundet med celleform og adhæsion. Mens CaPi er billigere end kationiske liposomer som et middel til at potensere adenovirus indtastning via en CAR-uafhængige vej, er det også mere toksisk for nogle cellelinjer. Vi anbefaler forudgående afprøvning af en tom adenofection at orientere valget mellem CaPi vs kationisk lipid reagens, afhængigt af den anvendte cellelinie og den biologiske udlæsning af interesse.

Sammen med nye bioteknologiske værktøjer genom redigering, RNA-interferens-baserede knockdown-redning tilgange som den er beskrevet her tilbyde en array af kraftfulde molekylære værktøjer til at afdække genfunktion i celler, som nu kan optimalt valgt af efterforskere afhængigt specifikke applikationer ^3. Vi mener, at adenofection tilvejebringer en relativt hurtig og enkelt system til at skabe hypomorphic knockdowns for struktur-funktion analyser af bidraget fra et protein af interesse i flere cellulære baggrunde.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C2C12 Mouse Myoblasts	ATCC	CRL-1772
Adenovirus custom design	Welgen	Custom design
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose	Thermo Fisher	11965-092
EDTA	Sigma	E5134
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
Fibronectin	Sigma	F1141
Glass bottom dishes, 35 mm	MatTek Corperation	P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B	Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada		Klebig C et al. 2009
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
Horse Serum, New Zealand	Thermo Fisher	16050-122
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher	13778-150
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha	Wisent	310-101-CL
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides	Thermo Fisher	12000-022
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red	Thermo Fisher	41061-029
Na2HPO4	Biobasic	S0404
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
OptiMEM	Thermo Fisher	11058-021
rAVCMV-LifeAct-TagGFP2	IBIDI	60121
siRNA duplexes	Dharmacon	Custom design
Thymidine	Sigma	T9250
Trypsine 2.5%	Thermo Fisher	15090-046