Adenofection: En metod för att studera rollen av Molecular Följeslagare i Cellular morfodynamiska av Depletion-Räddnings Experiment

Abstract

Cellulära processer såsom mitos och celldifferentiering styrs av förändringar i cellform som till stor del är beroende av korrekt ombyggnad av cell cytoskelettala strukturer. Detta involverar montering-demontering av högre ordningens makromolekylära strukturer vid en given tidpunkt och plats, en process som är särskilt känslig för störningar som orsakas av överexpression av proteiner. Metoder som kan bevara protein homeostas och upprätthåller nära-till-normal cellulär morfologi är mycket önskvärda för att bestämma den funktionella bidraget av ett protein av intresse i en rad olika cellulära processer. Gående utarmning-räddningsförsök baserade på RNA-interferens är kraftfulla metoder för att analysera proteinfunktioner och strukturella krav. Emellertid är återinförande av målproteinet med minimal avvikelse från dess fysiologiska nivå en verklig utmaning. Här beskriver vi en metod som går under benämningen adenofection som utvecklades för att studera betydelsen av molekylära chaperoner end partners i den normala driften av delande celler och relationen med aktin ombyggnad. HeLa-celler utarmat av BAG3 med siRNA duplex inriktning 3'UTR regionen. GFP-märkta BAG3 proteiner återinfördes samtidigt i> 75% av cellerna med hjälp av rekombinanta adenovirus är kopplade till transfektionsreagens. Adenofection aktiverat för att uttrycka BAG3-GFP-proteiner vid nära fysiologiska nivåer i HeLa-celler utarmade på BAG3, i frånvaro av en stressrespons. Ingen effekt observerades på nivåerna av endogena värmechockprotein följeslagare, de viktigaste stressinducerbara regulatorer av protein homeostas. Vidare genom att tillsätta baculovirus som driver uttrycket av fluorescerande markörer vid tidpunkten för cell transduktion-transfektion, kunde vi dissekera mitotiska celldynamik genom tidsförlopp mikroskopiska analyser med minimal störning av normal mitotisk progression. Adenofection är tillämpbar även på svåra att infektera musceller, och lämpar sig för funktionella analyser av myoblast differentiation in myotuber. Således adenofection ger en mångsidig metod för att utföra strukturfunktionsanalyser av proteiner involverade i känsliga biologiska processer som är beroende av högre ordning cytoskelettala dynamik.

Introduction

Funktionell inaktivering av genuttryck i däggdjursceller är den gyllene standarden för att dissekera proteinfunktioner. Nyutvecklade teknologier genomet redigering baserad på användningen av platsspecifika nukleaser såsom zink-finger nukleaser och klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (crispr) / CAS9 nu tillåta generering av cellinjer med riktade gendeletion och mutation ^1,2. Dessa nya metoder ska revolutionera sättet vi studerar proteiners funktion och vår förståelse av genetiken av mänskliga sjukdomar. I vissa fall är dock inte önskvärd på lång sikt eller fullständiga genen knockout och kan framkalla sekundära mekanismer cell ersättning. Generering av genetiskt modifierade cellinjer kan också vara begränsande när det handlar om primära cellkulturer med begränsad proliferationskapacitet eller när screening av ett stort antal mutationer i olika celltyper söks. Detta är ofta ett krav för bestämning av beroendet av en cell biological process på strukturella kraven för ett protein. För detta ändamål är fortfarande reversibel knockdown av RNA-interferens som möjliggör övergående utarmning-räddningsexperiment i olika cellulära bakgrunder en enkel och kraftfull metod för att utföra strukturfunktionsanalyser av ett protein av intresse ^3. Emellertid en stor nackdel med detta tillvägagångssätt är att det är svårt att uppnå en effektiv ljuddämpning och för att återinföra det intressanta proteinet eller dess varianter vid nära fysiologiska nivåer i en majoritet av cellpopulationen. Detta är avgörande för att möjliggöra omfattande studier som försöker korrelera funktionella effekter ses på nivån för enskilda celler (hypomorphic fenotyp) med de som ses i cellpopulationsbaserade analyser, till exempel på protein-proteininteraktioner.

Använda klassiska transfektion metoder, kan man knappast uppnå homogen och låg expression av exogena proteiner i en stor population av celler. Transduktion av celler med rekombinanta virussom adenovirus ofta ger mer normaliserad uttryck av exogena proteiner. Ändå är adenovirus upptag begränsas av CAR-receptorn, vilket är frånvarande i icke-humana celler eller bara svagt uttryckt i vissa humana celltyper. Dessutom aktiverar cellulära inträde av adenovirus signalvägar som reglerar cellens form och vidhäftning ^4-6. Detta är naturligtvis inte önskvärt när man studerar regleringsmekanismer av cell morfodynamiska. Vi stod inför denna problematiska när vi genomförde funktionella analyser av ett förkläde komplex, BAG3-HSPB8 i celldelning och aktin dynamik. Banbrytande arbete hade beskrivit en roll för denna chaperone komplex i protein kvalitetskontroll och autophagy vid stress ^7,8. De flesta av dessa studier har dock åberopat proteinuttryck, förutsatt att kaperoner normalt uppregleras under stress. Detta har lämnat frågan öppen om BAG3, i komplex med HSPB8 kan bidra till den normala driften av delande celler som uttrycker thESE chaperones som många cancercelltyper ^9. I synnerhet om chaperone komplexet bidrar till ombyggnad av aktin baserade strukturer som styr mitotiska progression var av stort intresse, med tanke på de nya förbindelserna mellan hspB chaperoner och cytoskelettala dynamik ^10. För att lösa detta problem, vi försöker utveckla en effektiv metod för utarmning-räddningsförsök som inte skulle störa mitotiska progression eller cellulär morfologi, och som skulle bevara protein homeostas att undvika sekundär störning av dynamiken i makromolekylära komplex som reglerar cellformförändringar . Således helst bör utföras utarmning-add-back av genen av intresse samtidigt.

Användningen av komplex av adenovirus med en katjonisk polymer eller lipider har beskrivits för att främja genöverföring in vitro och in vivo ^11,12. Exempelvis verkar kalciumfosfat (Capi) för att bilda en fällning medadenovirus som förbättrar virusbindning-post via en CAR-oberoende väg ^13. I själva verket fann vi att kombinera adenovirus-baserade cell transduktion och transfektion med katjoniska föreningar skulle kunna förbättra effektiviteten i utarmning-räddningsförsök. Detta tillät oss att sänka mängderna av virus genom 3- till 20-faldigt, beroende på cellinjen och genen av intresse, och dra nytta av ett bredare fönster i syfte att justera expressionen av exogena proteiner vid nära endogena nivåer i de flesta av en cellpopulation av intresse med minimal påverkan på cellulär morfologi. Under sådana förhållanden kan vi också uppnå hög effektivitet knockdown av endogena proteinuttryck (> 75%). Vi beskriver härmed metoden steg för steg och ger bevis för att protein homeostas inte signifikant störs som bedöms av de oförändrade nivåer av stressframkallade chaperones av Heat Shock Protein familj, vilket gör metoden lämplig för funktionella analyser av fysiologiska role av molekylära chaperoner efter time-lapse video mikroskopi. Protokollet är mottaglig för synkroniseringscell förfaranden och användning av kommersiellt tillgängliga baculovirus för samexpression av låga nivåer av fluorescerande markörer, med minsta möjliga störning med normal aktin baserade och spindeldynamik under mitotisk progression. Vi visar vidare mångsidigheten hos metoden, som är tillämplig på "svårt att omvandla" mus C2C12-celler, utan någon signifikant inverkan på myoblast differentiering till myotuber in vitro.

Protocol

1. Beredning av medium och lösningar (alla sterilfiltrerad)

1. C2C12 mus muskelceller (differentieringsstudier)
   1. Förbereda 500 ml tillväxtmedium för C2C12 cellodlings underhåll: DMEM hög glukoshalt kompletterat med 10% FBS och 2 mM L-glutamin.
   2. Förbereda 100 ml differentieringsmedium (DM) för C2C12 differentiering: DMEM med hög glukoshalt kompletterat med 2% hästserum.
2. HeLa-celler (studier i mitotiska celler)
   1. Förbered 500 ml aMEM för HeLa RFP-H2B cellodlings underhåll och experiment: aMEM kompletterat med 10% FBS och 2 mM L-glutamin (aMEM ^10%).
   2. Förbereda 500 ml aMEM-minus (utan deoxiribonukleosider / ribonukleosider) för HeLa RFP-H2B cellsynkronisering: aMEM-minus kompletterat med 10% FBS och 2 mM L-glutamin (aMEM-minus ^10%).
   3. Förbered 20 ml aMEM utan fenolrött för HeLa-RFP-H2B live cell förvärvet: aMEM utan fenolrött kompletterat med 10% FBS och 2 mM L-glutamin.
   4. Förbereda 100 mM tymidin: lös 24,2 mg i 1 ml _H2O vid 37 ° C genom virvling. Filter sterilisera och förvara vid 4 ° C.
3. vanliga lösningar
   1. Förbered 0,05% Trypsin / EDTA: 0,05% trypsin, 0,625 mM EDTA i 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Filtersterilisera och lagra alikvoter vid -20 ° C. När tinats, hålla portion vid 4 ° C.
   2. Förbereda HBS2x: 280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM Na ₂ HPO _4. Justera pH exakt mellan 7,01-7,05 med 10 N NaOH. Filter steril och hålla vid 4 ° C.

2. Beläggning av cellodlingsplattor med fibronektin och plätering av HeLa-RFP-H2B celler

OBS: Före försöket bör varje manipulator ställa in optimala cell plätering villkoren för att uppnå en riktig täthet av celler eftersom variationer kan OCcur mellan varje manipulatorn och varje annan cellinje.

1. Dagen före försöket, expandera HeLa-RFP-H2B celler för att säkerställa att de är i den exponentiella tillväxtfasen på dagen för plätering. Gör 2 successiva 1/3 utspädningar i 10 cm plattor med början från en 80% sammanflytande 1x10 cm platta.
   OBS: Planera antalet plattor för experimentet. Beräkna varje tillstånd som dubbletter, en för kortfristiga levande cell imaging och en för proteinextrakt för att bestämma effektiviteten av knockdown och exogena proteinuttryck genom Western blot-analys. Planera en extra platta för att bestämma antalet celler före virusöverföring.
2. Före cell plätering, päls glas botten rätter med 10 mikrogram / ml fibronektin. Tillsätt 1 ml av en 1: 100 spädning av 1 mg / ml fibronektin (utspädd i steril 1 x PBS) per 35 mm skål för att väl täcker hela ytan och inkubera i 1 timme vid 37 ° C, 5% _CO2.
3. Under inkubation före varm aMEM kompletterat with 10% FBS (aMEM ^10%) och 0,05% trypsin / EDTA vid 37 ° C.
4. Efter 45 minuters inkubering, börja förbereda cellen lösningen. I den sterila huven, aspirera mediet från en 10 cm platta, skölj försiktigt två gånger med 1,5 ml 0,05% trypsin / EDTA, och lämna 0,5 ml trypsin / EDTA i sista aspiration.
5. Inkubera cellerna i 2-3 min vid 37 ° C, 5% _CO2. Genom att försiktigt knacka på plattan och observation under mikroskop, kontrollera att alla celler har lossnat. Tillsätt 10 ml aMEM ^10% och pipett försiktigt flera gånger för att separera cellerna. Räkna ett prov av cellsuspensionen med användning av en hemocytometer 10 | il.
6. Aspirera fibronektin lösning från glasbotten rätter. Låt inte fibronektin torka ut före cell plätering.
7. Plattan 1,5x10 ⁵ celler per 35 mm skål i 2 ml aMEM ^10% och inkubera vid 37 ° C, 5% _CO2. Verifiera efter 30-45 min under mikroskop att cellerna är väl sepaklassad, eftersom de har en tendens att ackumuleras i mitten av plattan.
8. Om det behövs, agitera plattorna försiktigt korsvis att omfördela cellerna. Platta en 35 mm platta utöver det antal villkor för att räkna antalet celler före virusöverföring.
9. Odla celler fram till nästa dag för att uppnå en celldensitet på åtminstone 50%. En celldensitet lägre än 50% resulterar i en signifikant minskning av virus-transduktion effektivitet, ökad variationer av proteinuttryck per cell, och ökad celltoxicitet.
   OBS: Beläggning av glas rätter med fibronektin förbättrar celltillväxt och morfologi och främjar god progression av celler genom mitos. Det kan i allmänhet ersättas av kommersiellt tillgängligt gelatin som är billigare.

3. Adenovirus Transduction och endogent protein knockdown av siRNA Transfektion i HeLa-RFP-H2B celler med användning av CAPI Fällningar

Arbets försiktighet!ing med virus kräver speciella försiktighetsåtgärder och en korrekt hantering av allt material som har varit i kontakt med viruset.

Varning! I våra händer, fälls CAPI ofta har mer biverkningar, till exempel på biologiska processer som involverar vesikler människohandel (t.ex. autophagy). Följaktligen är det rekommenderat att använda en katjonisk lipid transfektion reagens (se nedan) och vänta minst 48 timmar innan analyserna.

ANMÄRKNING: En kontroll adenovirus som bär en orelaterad gen (dvs., LacZ) eller ingen gen används för att nå en minimal MOI i alla Adenofections (10-20 pfu / cell) med användning av den lägsta mängden av rekombinant adenovirus som bär genen av intresse.

OBS: Detta förfarande har visat sig hjälpa normalisera uttryck per cell i en stor cell population.

1. En dag efter cell plätering, räkna antalet celler från ytterligare pläterade skålen. Aspirera mediet ochSkölj en gång med 1 ml 0,05% Trypsin / EDTA. Lägg till igen en ml 0,05% trypsin / EDTA och inkubera vid 37 ° C, 5% CO ₂ tills alla celler har lossnat. Separera cellerna väl med användning av en 1 ml pipett och räkna antalet celler per ml med användning av en hemocytometer.
2. Bestämma mängden virus som behövs för att transducera celler vid en multiplicitet av infektion (MOI) av 2 plackbildande enheter (PFU) av proteinet av intresse (POI) per cell och 18 PFU per cell i en tom vektor (t.ex., LacZ) att ha totalt 20 PFU per cell. Samtidigt transducera 4 PFU av varje baculovirus (Actin och αTubulin, GFP och RFP-taggade respektive). Omvandla cellerna med hjälp av följande adenofection protokollet. Virus användes såsom beskrivits i Fuchs et al. ¹⁴
3. Förbered i en steril huva en 1,5 ml plaströr för varje tillstånd och tillsätt 400 pl varm aMEM-minus ^10%.
4. Tina en alikvot av de virus långsamt på is och, om så är nödvändigt, späd tHan virus lager för att pipettera en volym större än 1 pl för att minimera pipetteringsfel.
5. Tillsätt beräknade virusmängd per villkor för varje 1,5 ml plaströr som innehåller 400 pl aMEM-minus ^10% och blanda försiktigt genom pipettering. Placera virusstam omedelbart tillbaka vid -80 ° C för att hålla dess aktivitet.
6. Aspirera mediet från cellerna och försiktigt pipettera viruset mix droppvis. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO ₂ och skaka plattorna försiktigt under den sterila huven varje 15 min under en timme till väl täcka cellerna med viruset. Med användning av en liten mängd av mediet underlättar kontakt av viruset med cellerna.
7. Efter inkubation försiktigt pipettera 1,6 ml aMEM-minus ^10% till varje platta för att erhålla en total volym av 2 ml, starta cellsynkronisering genom att tillsätta 2 mM tymidin och inkubera cellerna under ytterligare 2 h vid 37 ° C, 5% _CO2 .
8. Samtidigt förbereda siRNA transfektion mix following av Capi transfektion metoden (se fig 1). Om ingen siRNA är nödvändigt, ersätta den mängd av siRNA med sterilt vatten för att utföra en tom transfektion.
9. Beräkna 200 l mix för varje tillstånd, vilket resulterar i 400 pl per duplikat. Följande exempel ges för en slutlig siRNA koncentration av 50 nM och måste anpassas för varje protein av intresse. I en 1,5 ml plaströr, pipett 50 ul 1 M CaCl ₂ och 11 pl 20 pM siRNA i 139 pl sterilt _H2O och blanda genom att vortexa. Efter en snabb centrifuge, tillsätt försiktigt droppvis 200 | il HBS2x (280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, pH 7,01-7,05).
   OBS: Den mindre dropparna den mindre är fällningarna, vilket resulterar i bättre transfektionseffektivitet. Blanda försiktigt tre gånger med flyg injektion med en 200 pl-pipett.
10. Inkubera blandningen under 30 min vid RT. Tillsätt långsamt droppvis 200 pl transfektionsblandning till varje platta ochagitera korsvis. Överföra plattorna vid 37 ° C, 5% _CO2 under 16 timmar.
11. Nästa dag, skölj cellerna två gånger med 2 ml varmt HEPES (6,7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM Hepes, pH 7,3) och tillsätt 2 ml aMEM-minus ^10%. Fortsätt inte med mer än fyra cellplattorna i taget eftersom variationer i temperatur påverkar längden av cellcykeln.
12. Visualisera infektionseffektivitet under ett inverterat fluorescensmikroskop vid en förstoring av 20-40x (luft) och förvärvar tre representativa bilder per betingelse i både fluorescerande och överföringskanaler för dokumentation. Sju timmar senare, tillsätt 2 mM tymidin och inkubera under ytterligare 16 h vid 37 ° C, 5% _CO2.
13. Följande dag, 48 timmar efter siRNA transfektion och virusinfektion, skölj cellerna två gånger med 2 ml varm fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och övergång till 7 timmar i 2 ml aMEM ^10% w / o fenolrött för levande cell imaging eller med fenol rött för proteinextraktion.
14. Harvest celler för varje betingelse 48 h efter transfektion för beredning av proteinextrakt och Western blot-analys för att bestämma effektiviteten av knockdown och uttrycket av det endogena proteinet ^15.
    OBS: Använd antikroppar mot proteinet av intresse, liksom lämpliga antikroppar som tjänstgör som lastkontroller. Effektiviteten för knockdown bör bestämmas genom att ladda minskande mängder av styr cellysat (transfekterade med kontroll siRNA), för att ge en titrering kurva (dvs., en, ½, ¼, ⅛).

4. Adenovirus Transduction och endogent protein knockdown av siRNA Transfektion i HeLa-celler med en katjonisk lipid transfektionsreagens

OBS: Här presenterar vi ett protokoll som var anpassad för experiment som inte inbegriper cellsynkronisering och / eller när siRNA transfektion inte kan utföras av Capi-metoden, exempelvis för att undvika oönskade toxiska effekter i viss cell lines. Detta protokoll innehåller också en cell omstryka steg efter adenofection för att arbeta på en lämplig celltäthet. Vi har bara testat det katjoniska lipid transfektion reagens.

Varning! Arbeta med virus kräver speciella försiktighetsåtgärder och en korrekt hantering av allt material som har varit i kontakt med viruset.

1. Platta 1,75 x 10 ⁵ celler per 35 mm skål i 2,5 ml aMEM ^10% och inkubera vid 37 ° C, 5% _CO2. Platta en 35 mm platta utöver det antal villkor för att räkna antalet celler före virusöverföring.
2. Odla celler fram till nästa dag för att uppnå en celldensitet på åtminstone 50%. En celldensitet av mindre än 50% resulterar i en signifikant minskning av virus-transduktion effektivitet, ökad variationer av proteinuttryck per cell, och ökad celltoxicitet.
3. En dag efter cell plätering, räkna antalet celler från ytterligare pläterade skålen. Aspireramediet och skölj en gång med 1 ml 0,05% Trypsin / EDTA. Lägg till igen en ml 0,05% trypsin / EDTA och inkubera vid 37 ° C, 5% CO ₂ tills alla celler har lossnat. Separera celler väl med användning av en 1 ml pipett och räkna antalet celler per ml.
4. Bestämma mängden virus som behövs för att transducera en infektionsmultiplicitet (MOI) på 20-40 plackbildande enheter (PFU) av proteinet av intresse (POI) per cell och 0-20 PFU per cell i en tom vektor (t.ex. LacZ) för att ha totalt 40 PFU per cell.
5. Förbered i en steril huva en 1,5 ml plaströr för varje tillstånd och tillsätt 400 pl varm aMEM ^10%.
6. Tina en alikvot av de virus långsamt på is och, om så är nödvändigt, späd viruset lager för att pipettera en volym som är större än 1 | j, l för att minimera pipetteringsfel.
7. Lägg den beräknade virusmängd per villkor för varje 1,5 ml plaströr som innehåller 400 pl aMEM ^10% och blanda försiktigt genom pipettering. place the virusstam omedelbart tillbaka vid -80 ° C för att hålla dess aktivitet.
8. Aspirera mediet från cellerna och försiktigt pipettera viruset mix droppvis. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO ₂ och skaka plattorna försiktigt under den sterila huven varje 15 min under en timme till väl täcka cellerna med virusutspädning. Med användning av en liten mängd av mediet underlättar kontakt av viruset med cellerna.
9. Under tiden, förbereda siRNA transfektion mix efter transfektion metod. Om ingen siRNA är nödvändigt, ersätta den mängd av siRNA med medium utan serum för att utföra en tom transfektion.
   1. Följande exempel ges för en slutlig siRNA koncentration av 50 nM och måste anpassas för varje protein av intresse. För varje adenofection, förbereda en 1,5 ml plaströr innehållande 416 nM siRNA i 150 pl medium utan serum (t.ex. 6,25 l 20 pm siRNA + 144 pl medium utan serum) och en 1,5 ml plaströr containing 6,25 l katjonisk lipid transfektion reagens + 144 pl medium utan serum.
   2. Blanda innehållet i varje plaströr genom att pipettera upp och ned flera gånger med en 200 | j, l pipett. Kombinera innehållet i båda rören och blanda genom att pipettera upp och ned flera gånger med en 200 | j, l pipett. Inkubera under 5 min vid RT.
10. Efter inkubation med viruset, försiktigt pipettera 1,8 ml aMEM ^10% till varje platta för att erhålla en total volym av 2,2 ml och omedelbart tillsätt långsamt droppvis siRNA transfektionsblandning till varje platta och skaka korsvis. Överföra plattorna vid 37 ° C, 5% _CO2 under 24 timmar.
11. Nästa dag, re-platta cellerna från varje 35 mm platta i fyra nya 35mm plattor i 2,5 ml aMEM ^10% vardera och Inkubera i ytterligare 24 timmar vid 37 ° C, 5% _CO2.
12. Nästa dag, 48 timmar efter siRNA transfektion och virusinfektion, skörd celler från en platta för varje tillstånd för beredning avproteinextrakt och Western blot-analys för att bestämma effektiviteten av knockdown och uttrycket av det endogena proteinet ^15.
    OBS: Med de återstående plattorna, fortsätt med cell fixering, med hjälp av protokollet val och underkasta proverna till immunofluorescensanalys med antikropparna av intresse ^14.

5. Levande cell imaging av mitotiska celler och dataanalys

1. Utföra kortsiktiga levande cell imaging experiment på mitotiska celler med ett inverterat mikroskop utrustat med en fukt / 5% _CO2 / termo-reglerade kammaren.
   OBS: I denna studie användes en snurrande skiva konfokalmikroskop (40X, 0,75 NA) användes, utrustad med en EMCCD kyld laddningskopplad kamera vid -50 ° C.
2. Före förvärvet kontrollera att kammaren har nått en lämplig temperatur på 37 ° C.
   OBS: Det kan ta flera timmar beroende på den mikroskopiska systemet.
3. Placera odlingsskålarna i microscope kammaren 1 timme före förvärvet för att möjliggöra en korrekt jämvikt av mediet och undvika fokus driver på grund av temperaturförändringar. Övervaka den mitotiska status av cellerna. Vid det här laget bör 10-15% av cellerna i de tidiga stadierna av mitos (profas-prometafas).
4. Under jämviktstiden, ställa in insamlingsparametrar som fastställts i tidigare experiment. Typiskt, en exponeringstid för båda kanalerna (488 och 594) av 0,2-3 sek med en laserintensitet på 100% och en känslighet på 121 till 130 är lämpliga parametrar i våra händer.
   OBS: Första test bör göras för att fastställa den minsta laserintensitet och förvärv tid / intervall som resulterar i en lämplig upplösning med minimal fotoblekning som orsakar cellskador och stör mitotisk progression.
5. Välja flera fält per betingelse för att erhålla ett signifikant antal celler för att analysera utan att överskrida förvärvet intervallet. Med hjälp av en snurrande skiva konfokala systemet, en typisk installation kommer iclude fyra olika förhållanden, 7 fält per platta och 2 färgkanaler (488 och 594) med en 1,5-2 minuters intervall under en 75 min-period.
6. Välj celler som är på mitotisk posten, åter ställa in fokus när alla fält har valts och börja förvärvet så snabbt som möjligt.
7. Övervaka stabiliteten i systemet i minst tre tidpunkter och på nytt ställa in fokus om det behövs.
8. Efter den första korttids levande cell imaging av 75 min, kan nya fält av mitotiska celler väljas för att förvärva en andra uppsättning av filmer för att öka antalet celler som analyseras.
9. Bestäm väldefinierade kriterier för att analysera de mitotiska fenotyper av celler, som kommer att bero på de fluorescerande markörer som används. Defekter i mitos kan inkludera förlängd tid i mitos (från kärn nedbrytning tills anafas), kromosom förskjutning, spindel gunga, och cortex blåsbildning ^14.

6. LifeAct-TagGFP2 Adenovirus Transduktion i Differentiating C2C12 Mus myoblaster

OBS: adenofection-protokollet är också tillämpbar på svåra att infektera mus C2C12 myoblaster som genomgår differentiering.

1. Plattan 2 x 10 ⁵ C2C12-celler i 35 mm odlingsskålar i tillväxtmedium på plast eller på ett substrat av val.
   OBS: Celldifferentiering förbättras på gelatine- eller Matrigel-belagda rätter. Planera en extra platta för att bestämma antalet celler före virusöverföring.
2. Följande dag, bör cellerna har nått 80% av sammanväxning. Inducera myoblast differentiering genom att tvätta cellerna två gånger med varm PBS och tillsätta 2 ml differentieringsmedium (DM).
3. Nästa dag, märkt som dag 1 (D1) av differentiering, transducera myocyter med adenovirus LifeAct-TagGFP2 att visualisera aktin cytoskelettet i levande celler. Räkna antalet celler från den extra plattan enligt beskrivningen i 3.2. Beräkna 5 PFU / cell av LifeAct-TagGFP2 adenovirus och 45 PFU / cell AdLacZ efter examenpel beskrivs i tabell 1. Den totala virusmängden är 50 PFU / cell. Virus användes som beskrivits ¹⁴
4. Förbereda i en steril huva ett 1,5 ml plaströr för varje tillstånd och tillsätt 400 pl av varm DM.
5. Tina en alikvot av de virus långsamt på is och, om så är nödvändigt, späd viruset lager för att pipettera en volym som är större än 1 | j, l för att minimera pipetteringsfel.
6. Tillsätt en lämplig mängd av viruspartiklar per betingelse till varje 1,5 ml plaströr innehållande 400 | j, l DM och blanda försiktigt genom pipettering. Placera virusstam omedelbart tillbaka vid -80 ° C för att hålla dess aktivitet.
7. Aspirera mediet från skålarna och försiktigt pipettera viruset mix droppvis. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO ₂ och skaka plattorna försiktigt under den sterila huven varje 15 min under totalt en timme till väl täcka cellerna med viruset.
8. Efter inkubation, försiktigt pipettera 1,6 ml DM på varje platta och fortsätta incubation under ytterligare 2 h vid 37 ° C, 5% _CO2.
9. Samtidigt förbereder en tom transfektion mix efter Capi transfektion metoden. Beräkna 200 l mix för varje tillstånd. Använda följande exempel för en total volym av 400 | j, l mix.
   1. I en 1,5 ml plaströr, pipett 50 ul 1 M _CaCl2 i 150 pl sterilt _H2O och blanda genom att vortexa. Efter en snabb centrifuge, tillsätt försiktigt droppvis 200 | il HBS2x (280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, pH 7,01-7,05). Blanda försiktigt genom luftinsprutning tre gånger med en 200 l pipett.
10. Inkubera blandningen under 30 min vid RT. Tillsätt långsamt droppvis 200 | il av transfektionsblandning till varje platta och skaka korsvis. Överföra plattorna vid 37 ° C, 5% _CO2 under 16 timmar.
11. Nästa dag, skölj cellerna två gånger med 2 ml varmt HEPES (6,7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM Hepes, pH 7,3) och tillsätt 2 ml DM. Visualisera infeInsatser effektivitet under ett inverterat fluorescensmikroskop vid en förstoring av 20-40X (luft) och förvärvar tre representativa bilder per betingelse i både fluorescerande och överföringskanaler för dokumentation.
12. Beroende på den önskade experimentet, följa differentiering till myotuber i flera dagar. Celler kan fixeras och utsattes därefter för immunofluorescensanalys och levande cell imaging studier kan utföras.

Representative Results

Transfektion av BAG3-GFP-plasmid-DNA med användning av katjoniska lipider var associerat med heterogent uttryck i HeLa-celler, vissa celler som visar knappt detekterbara nivåer av det protein och andra som bär mycket höga BAG3 nivåer (Figur 2A). I dessa celler var förlust av protein homeostas bevisas av ackumulering av BAG3-GFP in i perinukleära aggregat (Figur 2A, pilar). Däremot cell transduktion med adenovirus som bär BAG3-GFP uppvisade mer homogen låg uttryck och korrekt lokalisering av BAG3-GFP (Figur 2B, ensam infektion). Anmärkningsvärt, tillsats av katjoniska lipider under adenovirus transduktion (dvs transfektion av adenoviruspartiklar) signifikant ökad BAG3-GFP-expression per cell vid liknande MOI, medan det tillät hålla homogen expression i huvuddelen av cellerna (Figur 2B, Adenofection).

fällningar eller liposom-baserade föreningar för att öka transduktion-transfektionseffektivitet i HeLa-celler. Figur 3 visar ett typiskt experiment med vildtyp BAG3 (WT) -GFP eller ett BAG3 (IPV) -GFP variantbärande mutationer som avskaffa bindning till en av dess eskortepartners HSPB8 (Figur 3A, 3B). I överensstämmelse med en roll för BAG3 i stabilisering av HSPB8 ^7, tystande av BAG3 ledde till en ~ 50% minskning i nivåerna av HSPB8, som återställdes till normala nivåer efter återinsättande av BAG3 WT, men inte genom uttryck av liknande nivåer av den mutanta av BAG3 (IPV) -GFP eller enbart av GFP. Under dessa betingelser var BAG3-GFP-proteiner på lämpligt lokaliserade inom ~ 75-90% av cellerna, varvid anrikat på perinukleära-centrosomal regioner (figur 3C, 3D). denna suggserad att adenofection bevarat dynamiken i BAG3 och i BAG3-HSPB8 komplex i celler.

HSPB8 och BAG3 uppregleras genom olika proteotoxic påfrestningar som också stör cytoskelettala proteostas ^10. Därför överuttryck av chaperoner kan eventuellt störa montering-demontering av makromolekylära strukturer som styr cell morfodynamiska. För att kunna bedöma den roll BAG3-HSPB8 under icke-betonade förhållanden, var det viktigt att kontrollera att protein homeostas var minimalt störd av adenofection förfarande. För detta ändamål, övervakning variationer i nivåerna av chaperones av värmechockproteinfamiljen är en bra indikation på status av protein homeostas. Såsom visas i fig 4, adenofection av Capi eller liposom baserade metoder inte signifikant öka nivåerna av endogent HSPB8 och BAG3, eller den hos den större HSP70 / HSPA1 chaperone system. I kontrast, typisktproteotoxic behandlingar som värmechock eller MG132, en proteasomhämmaren ökade nivåerna av chaperon-cochaperone proteiner i HeLa-celler.

Vi sökte sedan för att bestämma om förfarandet adenofection kombination med baculovirus som driver uttryck av aktin och tubulin fluorescerande prober (BacMam-RFP-aktin och GFP-αtubulin) var lämplig för att spåra mitotiska celldynamik. Såsom visas i fig 5, har adenofection av HeLa-celler med en kontroll siRNA (siCTL) inte störa mitotiska spindeldynamik (grön) eller den genomsnittliga tid som tillbringas i mitos (figur 5A, representativt konfokala tidsförlopp sekvenser). Andelen av dessa celler visar onormala mitotiska händelser var i linje med nivåerna av mitotiska defekter i allmänhet observerats i cancercellinjer (~ 30% -40%, Figur 5B). Däremot celler adenofected med enbart BAG3 specifika siRNA (siBAG3) uppvisade en ~ 2-faldig ökning av level mitotiska fenotypiska defekter, som återställdes till nära nivån i kontrollceller genom BAG3-GFP (WT), men inte av GFP ensam. Detta validerade lämplighet adenofection för funktionell analys av effekterna av BAG3 och dess tillhörande chaperones på cytoskelettala dynamik som reglerar korrekt progression av celler i och ut ur mitosen, vilket framgår av Fuchs et al ^14.

För att verifiera mångsidigheten hos adenofection metoden, då anpassade vi protokollet för att möjliggöra visualisering av F-aktin under differentiering av mus C2C12 myocyter, med hjälp av kommersiellt tillgängliga adenovirus-LifeAct-GFP att märka F-aktin ^16. C2C12-celler induceras att differentiera till en dag innan Adenofection. Med hjälp av Capi baserade adenofection protokoll, anmärkningsvärt låga mängder av adenovirus-LifeAct-GFP var tillräckligt för att uttrycka proben vid en nivå som lätt detekterades med fluorescensmikroskopi i en betydande andel av differe ntiating myocyter (~ 3-5 pfu / cell, fig 6). Detta stod i skarp kontrast till den extremt höga infektionsmultiplicitet rapporterats i litteraturen att transducera mus C2C12-celler (i storleksordningen 250 till 400 MOI) ^17-19. Vidare genom att övervaka differentieringsprocessen i 7 dagar, vi etablerat att myotube bildningen inte påtagligt försämrades genom förfarandet. Detta tyder på att myocyt fusion, en process som bygger på finstämda aktin dynamik ^20, inte störs av uttryck av låga nivåer av LifeAct-GFP (Figur 6, Dag 6 och dag 7). Eftersom den fluorescerande markören fortfarande kan detekteras många dagar efter adenofection av C2C12-celler, tror vi att denna metod kommer att vara lämpliga för funktionella analyser av effekterna av följeslagare på aktin dynamik i olika skeden av C2C12 myogenes.

jove_content "fo: keep-together.within-page =". 1 "> Tabell 1. Beräkning av adenovirus MOI Visas är ett exempel på hur man kan beräkna antalet adenovirus plackbildande enheter (PFU) som krävs för infektion av ett bestämt antal av celler överväger olika virustitrar.

Figur 1. Planering av en typisk adenofection protokoll. Successiva steg i ett typiskt experiment visas för protokoll med Capi fällningar (understruken i grått) eller protokoll med hjälp av en katjonisk lipid transfektion reagens (gulmarkerat), inklusive cell plätering, transduktion av adeno- och baculovirus, transfektion av siRNA duplex, och cellsynkronisering med en dubbel tymidin block. Tidslinjer i timmar för båda protokollen visas på den högra sidan av figuren.fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Homogen och effektiv expression av BAG3-GFP med hjälp Adenofection. (A) Representativa epifluorescence bilder av HeLa-celler som hade transfekterats med BAG3-GFP-plasmid-DNA, som visar perinukleära aggregat av proteinet vid höga expressionsnivåer (betecknade med pilar) och heterogena uttryck inom cellpopulationen. Western blöts visar högre uttryck av BAG3-GFP i förhållande till endogena BAG3 nivåer i den totala cellpopulationen, vilket indikerar att proteinet är i hög grad överuttrycks i vissa celler. (B) Representativa epifluorescence bilder av HeLa-celler som hade transducerats enbart eller adenofected användning av ökande mängder av Ad-BAG3-GFP-viruspartiklar. Bilderförvärvades med användning av identiska parametrar och var lika behandlas för bakgrund subtraktion och intensitet; Bar. 50 pm klicka god här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Effektiv knockdown av BAG3 och återinförande av BAG3-GFP-proteiner vid nära endogena nivåer. (AB) HeLa-celler som uttrycker RFP-H2B (A) eller föräldra HeLa-celler (B) till adenofected med de angivna siRNA och rekombinanta adenovirus med hjälp av Capi metod (A) eller liposom-baserade föreningar som transfektionsreagens (B). Cellerna synkroniseras med den dubbla tymidin blocket metod och den totala cellextrakt framställdes under den andra fasen av release. Weste rn blöts visar BAG3 utarmningsnivåer (BAG3 endogena), nivåerna av adenofected BAG3-GFP-proteiner och endogena nivåer av HSPB8; GAPDH nivåer: lastkontroll. Utarmning uppskattades till> 75% genom att ladda minskande mängder av extrakt kontroll (adenofected med kontroll siRNA-siCtl och BAG3-GFP WT, dvs ½, ¼). Observera att enskilda BAG3-GFP-proteinerna infördes vid nära den endogena nivån av BAG3 och att vildtyp BAG3-GFP, men inte BAG3 (IPV) -GFP eller GFP ensam, restaurerade HSPB8 nivåer i BAG3 utarmade celler. (CD) Representativa epifluorescence bilder av HeLa-celler som hade adenofected med det angivna rekombinanta Ad-BAG3-GFP med användning av Capi eller katjonisk lipid transfektionsreagens. Barer: 20 | j, m. Representativa resultat som visas i (A) och (C) är modifierade från Fuchs et al., PLoS Genet. 2015 23 oktober, 11 (10): e1005582, doi: 10.1371 / journal.pgen.1005582 ^14.iles / ftp_upload / 54557 / 54557fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Adenofection inte inducerar en stressreaktion i HeLa-celler Western blöt av totala cellextrakt framställda från kontroll HeLa-celler. (NT: icke behandlade) eller HeLa-celler transfekterade med kontroll siRNA ensam (siCtl, ingen adenovirus), eller adenofected med siCtl och Ad-GFP med antingen CAPI eller katjonisk lipid transfektion reagens, eller från HeLa-celler som lämnats till typiska proteotoxic behandlingar (HS: värmechock vid 44 ° C under 60 min följt av 16 h återhämtning vid 37 ° C; MG132: proteasomhämmaren, 5 iM under 16 timmar), som visar nivåerna av BAG3, HSPB8 och andra stress inducerbara chaperoner, nämligen HSP70 / HSPA / och Hsp27 / HSPB1; GAPDH: lastning kontroll. Observera att medan halterna av alla proproteiner utom GAPDH ökades på proteotoxic spännings behandlingar var de oförändrade genom adenofection. Proteinnivå variationer bedömdes genom att ladda olika mängder HS cellextrakt som bär typiska ökningar i HSP. (HS: en, ½, ¼, ⅛, till exempel, var HSP70 inducerad av mer än åtta gånger som svar på proteotoxic stress) Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Progression av HeLa-celler genom mitos inte signifikant störs av Adenofection. (A) Representativa konfokala tidsförlopp sekvenser från HeLa-celler som hade adenofected med en styr siRNA (siCtl) tillsammans med BacMam- GFP-α-tubulin och BacMam -RFP-aktin och avbildas genom spinning disk konfokala microscopy för 60 till 90 min vid ~ 1,5 min intervaller. Vita och gula asterisker betecknar läget för spindel stolpar som förblev relativt stabil. Bar: 10 | j, m. (B) Kvantifiering av celler adenofected med siCtl eller BAG3 specifika siRNA, med eller utan de angivna GFP proteiner (GFP ensamt eller vildtyp BAG3-GFP: WT). Diagrammet visar procentandelen celler med onormal mitos definieras som spindel gungning och stannade i mitos +/- eller kromosom förskjutning. Här visas de medel +/- SE. Representativa resultat som visas i (B) togs från Fuchs et al., PLoS Genet. 2015 23 oktober, 11 (10): e1005582, doi: 10.1371 / journal.pgen.1005582 ^14. Klicka god här för att se en större version av denna siffra. Klicka här för att se filmen i samband med panel (A).

Figur 6. Adenofection av C2C12 myocyter med Ad-LifeAct-GFP och myotube bildning. Representativa epifluorescence bilder av C2C12-celler som hade inducerats att differentiera och bearbetas för adenofection en dag senare med 5 PFU / cell av LifeAct-GFP och 45 PFU / cell av LacZ. Bilder visar uttryck av GFP markör under differentieringsprocessen (Dag 2, Dag 6 och dag 7). Bars:. 20 um klicka god här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Här beskrev vi en metod som gör det möjligt utarmning-räddningsförsök som skall utföras, som är tillämplig på funktionella analyser av cellbiologiska processer som är särskilt känsliga för överuttryck av proteiner som påverkar stökiometrin och dynamik proteinkomplex och makromolekylära strukturer. Mitotisk celldelning är ett extremt exempel på finstämda morfodynamiska cell som innebär de mest dramatiska och spektakulära förändringar i den övergripande strukturen i en cell. Använda adenofection kombination med kommersiellt tillgängliga BacMam reagens för att införa låga men detekterbara mängder av aktin och tubulin markörer för cell imaging, kan bidraget från chaperon komplexa BAG3-HSPB8 till riktig mitotiska cell ombyggnad vara tydligt. I en nyligen genomförd studie av Fuchs et al., Har vi visat att utarmning av BAG3 orsakar defekter i spindelorientering som är relaterade till en oförmåga att etablera en styv mitotisk aktin cortex och montera aktin-rikaindragnings fibrerna ^14. Korrekt spindeldynamik kunde återställas genom återinförande av vildtyp BAG3-GFP, som också korrigeras minskningen ses i HSPB8 nivåer vid BAG3 ljuddämpning. Detta innebär att adenofection möjliggör återvinning av en fysiologiskt relevant förkläde komplex som korrelerar med funktionell återhämtning av spindeldynamik.

Användning av adenofection för utarmning-räddningsförsök ger en fördel jämfört med plasmid DNA-transfektion eller nucleofection, vilket kan resultera i en kraftig induktion av en stressreaktion i vissa celltyper (dvs Autophagy) ^21, vilket gör det praktiskt taget omöjligt att analysera effekterna av en given chaperone och dess fysiologiska roll. I själva verket, i vår hand, är transfektion av BAG3 plasmid DNA associerat med högre uttryck per cell, aggregatbildning och effekter på cell apoptos / överlevnad i flera celltyper (Figur 2). BAG3 är ett modulärt cochaperone med ställnings aktivitet, som may spela flera roller beroende på dess partnerproteiner ^9. Därför kan störningar av komplexa stökiometri på överuttryck av BAG3 ha oönskade dominanta negativa effekter och inducerar toxicitet. Hög kapacitet rekombinant adenovirus är ett idealiskt verktyg för den transienta och säkerhet leverans av stora gener i både uppdelning och icke delande celler i odling, eftersom det inte integreras i värdcellsgenomet, i motsats till lentivirus-baserade vektorer för vilka viss säkerhet farhågor kvarstår fortfarande. Potentiell nackdel med användningen av adenovirus för utarmning-räddnings experiment är att de kräver upprepad beredning, som kan vara tidskrävande. De förlitar sig också på noggrann titrering av infektiösa partiklar för reproducerbar transduktion effektivitet.

Använda adenofection att screena bidrag kända BAG3 funktionella domäner, fick vi det första beviset, så vitt vi vet, för existensen av en HSPB8 beroende BAG3 funktion i normal driftav delande celler som inte kräver sin interaktion med HSP70 / HSPA1 förkläde systemet. Adenofection bör tillämpas för att spåra F-aktin under processen av myocyt differentiering till myotuber, som föreslagits av de data som presenteras här. Således vår metod ger en mångsidig och effektiv protokoll för siRNA-baserade utarmning-räddnings experiment med minimal påverkan på cell morfodynamiska som bör vara användbara i ett brett spektrum av projekt där strukturfunktionsanalys av en gen av intresse förs vidare.

Utnyttja katjoniska föreningar-lipider i syfte att uppnå en effektiv transfektion-transduktion av celler med det lägsta beloppet av viruspartiklar är nyckeln till denna metod. Samtidigt som det ger ett större fönster för att styra nivåerna av exogena proteiner per cell, tror vi att det medger vidare att minimera potentiella biverkningar på signaltransduktionsvägar som leder från adenovirus cellbindning-posten, som ska mildra effekterna av aprotein av ränta på morfogenetiska banor.

Det bör noteras att olika reagens för att öka adenovirus transduktion effektivitet är kommersiellt tillgängliga, såsom CAR receptor booster. Sådana reagens är dyra, dock, och förväntas främja virusbindning-inträde i celler på ett sätt som kräver att CAR-receptorn, vilken såsom angivits ovan har visats aktivera signalvägar associerade med cellform och vidhäftning. Medan CAPI är billigare än katjoniska liposomer som ett sätt att förstärka adenovirus inträde via en CAR-oberoende väg, är det också mer giftigt för vissa cellinjer. Vi rekommenderar föregående provning av en tom adenofection att orientera valet mellan Capi vs katjonisk lipid-reagens, beroende på cellinjen som används och den biologiska utläsning av intresse.

Tillsammans med nya biotekniska verktyg genom redigering, RNA-interferens-baserade knockdown-räddnings metoder såsom den som beskrivs här erbjuder ett array kraftfulla molekylära verktyg för att avslöja geners funktion i celler, som nu kan optimalt valt utredare beroende på specifika tillämpningar ^3. Vi tror att adenofection ger en relativt snabb och enkelt system för att skapa hypomorphic knockdowns för strukturfunktionsanalyser av bidraget av ett protein av intresse i flera cellulära bakgrunder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C2C12 Mouse Myoblasts	ATCC	CRL-1772
Adenovirus custom design	Welgen	Custom design
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose	Thermo Fisher	11965-092
EDTA	Sigma	E5134
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
Fibronectin	Sigma	F1141
Glass bottom dishes, 35 mm	MatTek Corperation	P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B	Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada		Klebig C et al. 2009
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
Horse Serum, New Zealand	Thermo Fisher	16050-122
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher	13778-150
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha	Wisent	310-101-CL
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides	Thermo Fisher	12000-022
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red	Thermo Fisher	41061-029
Na2HPO4	Biobasic	S0404
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
OptiMEM	Thermo Fisher	11058-021
rAVCMV-LifeAct-TagGFP2	IBIDI	60121
siRNA duplexes	Dharmacon	Custom design
Thymidine	Sigma	T9250
Trypsine 2.5%	Thermo Fisher	15090-046