Abstract
このような有糸分裂および細胞分化などの細胞プロセスは、主に細胞の細胞骨格構造の適切な改造に依存している細胞形状の変化によって支配されています。これは、与えられた時間と場所での高次高分子構造の組立・分解、タンパク質の過剰発現によって引き起こされる摂動に特に敏感であるプロセスを含みます。タンパク質恒常性を維持し、周辺対正常な細胞形態を維持することができる方法は、細胞プロセスの広い範囲で、目的のタンパク質の機能的寄与を決定することが非常に望ましいです。 RNA干渉に基づいて、過渡枯渇-レスキュー実験は、タンパク質の機能と構造要件を分析するための強力なアプローチです。しかし、その生理学的レベルからの最小偏差で標的タンパク質の再導入は、本当の挑戦です。ここでは、分子シャペロンの役割を研究するために開発された方法と呼ばれるadenofectionを説明D分裂細胞の正常な動作のパートナーとアクチンリモデリングとの関係。 HeLa細胞は、3'UTR領域を標的とするsiRNA二重鎖とBAG3を枯渇させました。 GFPタグBAG3タンパク質は、トランスフェクション試薬に結合された組換えアデノウイルスを用いた細胞の> 75％の中に同時に再導入しました。 Adenofectionはストレス応答の不存在下で、BAG3枯渇HeLa細胞における近生理学的レベルでBAG3-GFPタンパク質を発現することが可能。効果は、内因性熱ショックタンパク質シャペロン、タンパク質ホメオスタシスの主なストレス誘導性調節因子のレベルで観察されませんでした。さらに、細胞の形質導入、トランスフェクションの時に蛍光マーカーの発現を駆動するバキュロウイルスを追加することによって、我々は、タイムラプス顕微鏡によって有糸分裂細胞動態を分析できた通常の有糸分裂の進行の最小摂動と分析しています。 Adenofectionは、ハードに感染さマウスの細胞にも適用し、筋芽細胞デフの機能解析に適しています筋管にerentiation。したがってadenofection高次の細胞骨格の動態に依存感受性生物学的プロセスに関与するタンパク質の分析構造機能を実行するための多用途の方法を提供します。
Introduction
哺乳動物細胞における遺伝子発現の機能的不活性化は、タンパク質の機能を分析するためのゴールドスタンダードです。新たにこのようなジンクフィンガーヌクレアーゼなどの部位特異的ヌクレアーゼの使用に基づくゲノム編集の技術を開発し、クラスタ化され、定期的にinterspaced短いパリンドローム反復（CRISPR）は/ CAS9は現在、標的遺伝子の欠失突然変異1,2を有する細胞株の生成を可能にします。これらの新規のアプローチは、我々は、タンパク質の機能およびヒト疾患の遺伝学の我々の理解を勉強している方法に革命を起こす必要があります。いくつかの例では、しかしながら、長期的または完全な遺伝子ノックアウトは望ましくなく、二次電池の補償機構を誘発することができます。遺伝的に改変された細胞株の生成は、限られた増殖能を有する初代細胞培養物を扱う場合にも制限することができ、または様々な細胞型における変異の大規模なセットのスクリーニングが求められている場合。これは、多くの場合、セルbの依存性を決定するために必要とされますタンパク質の構造要件にiologicalプロセス。そのために、様々な細胞背景の一過性の枯渇、レスキュー実験を可能にするRNA干渉による可逆的ノックダウンは、まだ構造機能が関心3のタンパク質の解析を実行するためにシンプルで強力なアプローチのまま。しかし、このアプローチの主な欠点は困難効率的なサイレンシングを達成するために、細胞集団の大部分の近生理的レベルで目的のタンパク質またはその変異体を再導入することです。これは、タンパク質 - タンパク質相互作用上のインスタンスのために、細胞集団ベースのアッセイに見られるもので、単一細胞（低形質の表現型）のレベルで見られる機能的効果を相関しようとする総合的な研究を可能にすることが重要です。
古典的なトランスフェクション法を使用して、1はほとんどの細胞の大集団での外因性タンパク質の均質かつ低発現を達成することはできません。組換えウイルスによる細胞の形質導入アデノウイルスのように、多くの場合、外因性タンパク質のより多くの正規化された発現を可能にします。しかし、アデノウイルスの取り込みは、非ヒト細胞に存在しないか、または弱くしかいくつかのヒト細胞型において発現されるCAR受容体によって制限されます。さらに、アデノウイルスの細胞侵入は、細胞の形状および接着4-6を制御するシグナル伝達経路を活性化させます。セルmorphodynamicsの調節機構を研究するとき、これは明らかに望ましくありません。我々は細胞分裂とアクチンダイナミクスに、シャペロン複合体、BAG3-HSPB8の機能解析を行ったとき、私たちはこの問題に直面していました。先駆的な仕事はストレス7,8間のタンパク質の品質管理とオートファジーで、このシャペロン複合体の役割を説明していました。これらの研究のほとんどは、しかし、シャペロンは、通常、ストレスの間にアップレギュレートされていると仮定すると、タンパク質の過剰発現に依存していました。これはBAG3は、HSPB8との複合体で、目を発現する分裂細胞の正常な動作に寄与することができるかどうかの質問を開いたままにしています多くの癌細胞タイプ9のようなESEシャペロン。具体的には、シャペロン複合体は、HSPBシャペロンおよび細胞骨格のダイナミクス10との間に新興の接続与えられた非常に興味深いした有糸分裂の進行を制御するアクチンベースの構造のリモデリングに寄与するかどうか。この問題に対処するために、我々は、有糸分裂の進行又は細胞形態を妨害しない、および細胞形状変化を調節する高分子複合体の力学の二次摂動を回避するために、タンパク質恒常性を維持することになる空乏レスキュー実験のための効率的な方法を開発しようとしました。 。このように理想的には、目的の遺伝子の枯渇-追加バックが同時に行われるべきです。
カチオン性ポリマーまたは脂質とアデノウイルスとの複合体の使用は、 インビトロおよびインビボ 11,12 における遺伝子導入を促進するために記載されています。例えば、リン酸カルシウム（CAPI）を、沈殿物を形成するように見えますCAR非依存的経路13を介してウイルス結合エントリを向上させるアデノウイルス。実際、我々は、カチオン性化合物を用いて、アデノウイルスベースの細胞形質導入およびトランスフェクションを組み合わせること枯渇レスキュー実験の効率を高めることができることを見出しました。これは、大部分の近内因性レベルで外因性タンパク質の発現を調節するために細胞株を、目的の遺伝子に応じて、我々は20倍に3によりウイルス量を低下させ、より広い窓から利益細胞形態への影響を最小限に抑えながら、目的の細胞集団の。このような条件下では、我々はまた、内因性タンパク質の発現（> 75％）の高効率ノックダウンを達成することができました。我々はここ生理ROの機能解析のための方法が適して、ステップによって方法ステップを説明し、熱ショックタンパク質ファミリーのストレス誘発シャペロンの不変のレベルによって評価されるようなタンパク質の恒常性が著しく乱されていないという証拠を提供しますタイムラプスビデオ顕微鏡による分子シャペロンのル。プロトコルは、有糸分裂の進行中に、通常のアクチンベースとスピンドルダイナミクスとの干渉が最小で、セル同期手続きへと蛍光マーカーの低レベルの共発現のために市販のバキュロウイルスの使用に適しています。我々はさらに、in vitroで筋管への筋芽細胞分化に有意な影響を与えたマウスC2C12細胞を、「形質導入するためにハード」に適用される方法の汎用性を示しています。
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Protocol
ミディアムと解決策の調製（すべての濾過滅菌）
- C2C12マウス筋細胞（分化の研究）
- C2C12細胞培養の維持のために増殖培地の500ミリリットルを準備し、10％FBSおよび2mM L-グルタミンを補充したDMEM高グルコースを。
- C2C12分化に100ミリリットル分化培地（DM）を準備：2％ウマ血清を添加したDMEM高グルコースを。
- HeLa細胞（有糸分裂細胞での研究）
- 調製500 mlのαMEMヒーラRFP-H2B細胞培養の維持および実験用：10％FBSおよび2mM L-グルタミン（αMEM、10％）を補充したαMEM。
- 10％FBSおよび2mM L-グルタミン（αMEMマイナス10％）を補充したαMEMマイナス：HeLa細胞RFP-H2Bのセル同期のために（デオキシリボ/リボなし）500ミリリットルαMEMマイナスを準備します。
- HeLa細胞-RFP-H2B Lのフェノールレッドなしの20ミリリットルをαMEM準備IVEセル獲得：αMEMフェノールレッドを含まない、10％FBSおよび2mM L-グルタミンを補充しました。
- 100 mMのチミジンを準備し、ボルテックスにより37℃で1ミリリットルのH 2 O中24.2ミリグラムを溶解します。フィルタは、滅菌し、4℃で維持します。
- 一般的なソリューション
- 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の0.05％トリプシン、0.625 mMのEDTA：0.05％トリプシン/ EDTAを準備します。フィルタは、滅菌し、分注して-20°Cで保存。解凍した後、4℃でアリコートを保ちます。
- HBS2xを準備します：280のNaCl、50mMのHEPES、1.5mMののNa 2 HPO 4。正確に10 N NaOHで7.01から7.05の間のpHを調整します。滅菌濾過し、4℃で維持。
HeLa細胞-RFP-H2B細胞のフィブロネクチンやメッキで細胞培養プレートの2コーティング
注：実験の前に、各マニピュレータは変動がOC可能性があるため、細胞の適切な密度を達成するために最適な細胞めっき条件を設定する必要があります各マニピュレータおよびそれぞれの異なる細胞株の間cur変換。
- 実験の前日に、彼らはメッキの日に指数増殖期内にあることを確認するのHeLa-RFP-H2B細胞を展開します。 80％コンフルエント1×10 cmのプレートから始まる10cmプレートに2つの連続1/3希釈液を作ります。
注：この実験のためにプレートの数を計画します。ウェスタンブロット分析によりノックダウンの有効性および外因性タンパク質の発現を決定するために、重複、短期生細胞イメージング用とタンパク質抽出のための1つとして、各条件を算出します。ウイルス形質導入に先立って細胞数を決定するために1つの追加のプレートを計画します。 - 10μg/ mlのフィブロネクチンで、メッキコートガラスボトムディッシュをセルに先立ち。よく全面を覆う、37℃、5％CO 2で1時間インキュベートに1mg / mlのフィブロネクチン（滅菌1×PBSで希釈）35ミリメートルあたりの皿の1：100希釈の1ミリリットルを追加します。
- インキュベーションの間、プリ暖かいαMEMは、Wiを補足しました37℃で10％FBS（αMEM、10％）および0.05％トリプシン/ EDTA目。
- インキュベーションの45分後、細胞溶液を調製し始めます。無菌フードでは、10cmプレートから培地を吸引1.5ミリリットル0.05％トリプシン/ EDTAで軽く二回すすぎ、そして最後の吸引でトリプシン/ EDTAの0.5ミリリットルを残します。
- 37℃、5％CO 2で2〜3分間、細胞をインキュベートします。優しく顕微鏡下板との観測をタップすると、すべてのセルが切り離されていることを確認します。細胞を分離するαMEM10％とピペット静かに数回の10ミリリットルを追加します。血球計数器を用いて、細胞懸濁液の10μlのサンプルをカウントします。
- ガラスボトムディッシュから吸引フィブロネクチンソリューション。フィブロネクチンは細胞播種前に乾燥させないでください。
- 2ミリリットルαMEM10％で35mm皿あたりのプレート1.5×10 5細胞を、37℃、5％CO 2でインキュベートします。細胞が十分にSEPAであることを顕微鏡下で30-45分後に確認してくださいそれらはプレートの中央部に蓄積する傾向があるので、定格。
- 必要に応じて、細胞を再配布する優しくクロスワイズプレートを攪拌します。ウイルス形質導入に先立って細胞数をカウントするために、条件の数に追加のプレート1 35ミリメートルプレート。
- 少なくとも50％の細胞密度を達成するために、次の日まで細胞を増殖させます。細胞密度は、ウイルス形質導入効率の大幅な低下を50％未満の結果は、細胞あたりのタンパク質の発現の変化を増加し、細胞毒性を増加させました。
注：フィブロネクチンでガラス皿のコーティングは、細胞増殖と形態を改善し、有糸分裂を介して細胞の適切な進行を促進します。それは一般的に安価である市販のゼラチンで置き換えることができます。
3.アデノウイルス形質導入およびCAPI析出物を使用したHeLa-RFP-H2B細胞にsiRNAをトランスフェクションすることによりノックダウン内因性タンパク質
注意！ワークウイルスにると、特別な予防措置やウイルスと接触していたすべての材料の適切な処分を必要とします。
注意！私たちの手で、CAPIは、多くの場合（ 例えば 、オートファジー）小胞輸送に関与する生物学的プロセス上のインスタンスのために、より多くの望ましくない効果を持って沈殿します。したがって、（下記参照）と分析前に少なくとも48時間を待つためにカチオン性脂質トランスフェクション試薬を使用することをお勧めします。
注：無関係の遺伝子（ すなわち、のLacZ）または無遺伝子を有する対照アデノウイルスは、目的の遺伝子を保有する組換えアデノウイルスの最小量を使用して、すべてのAdenofectionsにおける最小のMOI（10-20 PFU /細胞）に到達するために使用されます。
注：この手順は、大きな細胞集団における細胞当たりの正規化発現を助けるために示されています。
- 細胞プレーティングの翌日、追加のメッキ皿から細胞の数を数えます。培地を吸引し、1ミリリットル0.05％トリプシン/ EDTAで一回すすいでください。 0.05％トリプシン/ EDTAの再度1ミリリットルを追加し、すべてのセルが切り離されるまで、37℃、5％CO 2でインキュベートします。ウェル1ミリリットルピペットを用いて細胞を分離し、血球計数器を用いて、1ml当たりの細胞数を数えます。
- 感染多重セルあたりの金利（POI）のタンパク質の2プラーク形成単位（PFU）および空のベクターの細胞あたり18 PFUの（MOI）で細胞を形質導入するために必要なウイルスの量を決定する（ 例えば、LacZ）細胞当たり20 PFUの合計を持っています。同時に、各バキュロウイルス（アクチンとαTubulin、GFPおよびRFPタグ付きそれぞれ）の4 PFUを伝達します。以下adenofectionプロトコールを用いて細胞を形質導入します。フックスらに記載のようにウイルスを使用した。14
- 各条件について無菌フードで1.5ミリリットルのプラスチックチューブを準備し、暖かいαMEMマイナス10％の400μlを添加します。
- 氷の上でゆっくりとウイルスのアリコートを解凍し、必要に応じて、トンを希釈ピペッティングの誤差を最小限に抑えるために1μlのより大きなボリュームをピペットするために、彼ウイルスストック。
- 400μlのαMEMマイナス10％を含む各1.5ミリリットルのプラスチックチューブに条件ごとに計算されたウイルスの量を追加し、ピペッティングにより穏やかに混合します。その活性を維持するためにすぐに戻って-80℃でのウイルスストックを置きます。
- 細胞から培地を吸引し、静かに滴下ウイルスミックスをピペット。よくウイルスで細胞をカバーするために1時間各15分を37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートし、無菌フードの下で慎重にプレートを攪拌します。培地の少量を使用することにより、細胞とウイルスの接触を容易にします。
- インキュベーション後、穏やかに2mlの総容量を得るために、各プレート1.6 mlのαMEMマイナス10％をピペット2mMのチミジンを添加することにより、セル同期を開始し、37℃、5％CO 2でさらに2時間細胞をインキュベート。
- 一方、siRNAトランスフェクションミックスfollowiを準備CAPIのトランスフェクション法をngの（ 図1参照 ）。何のsiRNAが必要でない場合は、 空のトランスフェクションを行うために滅菌水によりsiRNAの量を交換してください。
- 重複あたり400μlの結果として、条件ごとに200μlのミックスを計算します。以下の例は、50 nMの最終siRNA濃度のために与えられ、関心対象の各タンパク質のために適合されなければなりません。 1.5ミリリットルプラスチックチューブでは、ピペット50μlの1 MのCaCl 2および11μlの20μMのsiRNA 139μlの滅菌Hへ2 O、ボルテックスで混和します。クイックスピンした後、慎重に滴下200μlのHBS2x（280 mMの塩化ナトリウム、50mMのHEPES、1.5mMののNa 2 HPO 4、pHは7.01から7.05）を追加します。
注：より小さな液滴より小さな、より良いトランスフェクション効率が得られ、沈殿物です。静かに200μlのピペットを用いて空気注入により3回混ぜます。 - RTで30分間混合しインキュベートします。ゆっくりと滴下トランスフェクション混合物の200μLを各プレートに加え、クロスワイズ攪拌します。 16時間37℃で、5％CO 2でプレートを転送します。
- 次の日は、2ミリリットル暖かいHEPES（6.7のKCl、150mMのNaCl、10mMのHEPES、pHは7.3）で細胞を2回洗浄し、10 2ミリリットルαMEMマイナス％を追加します。温度の変化は、細胞周期の長さに影響を与えるので、一度に複数の4つの細胞プレートに進まないでください。
- 20-40x（空気）の倍率で倒立蛍光顕微鏡下での感染効率を可視化し、文書化のための両方の蛍光及び伝送路状態ごとに3つの代表的な画像を取得します。 7時間後、2mMのチミジンを追加し、37°C、5％CO 2でさらに16時間インキュベートします。
- 次の日、siRNAトランスフェクションおよびウイルス感染の48時間後には、2ミリリットル温かいリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を2回洗浄し、生細胞イメージングのために、またはフェノールとフェノール/ Oレッドwは2ミリリットルαMEM10％で7時間離しタンパク質抽出のための赤。
- タンパク質抽出物の調製およびウエスタンブロット分析のために、各条件48時間後、トランスフェクションのために収穫細胞は、ノックダウンの効率性及び内因性タンパク質15の発現を決定します。
注：目的のタンパク質と同様に、ローディングコントロールとして適切な抗体に対する抗体を使用してください。ノックダウンの効率は、滴定曲線を提供するために、（対照siRNAをトランスフェクト）対照細胞溶解液の減少量をロードすることによって決定されるべきである（ すなわち、1 1/2 1/4、⅛）。
4.アデノウイルス形質導入およびカチオン性脂質トランスフェクション試薬を使用したHeLa細胞におけるsiRNAトランスフェクションによってノックダウン内因性タンパク質
注記：ここでは、セル同期を伴わない、および/またはsiRNAトランスフェクションは、CAPIの方法により行うことができない場合の実験のために適合させたプロトコルを提示し、例えば、いくつかの細胞LINにおける望ましくない毒性作用を回避するためにエス。このプロトコルはまた、適切な細胞密度で動作させるためにadenofection後の細胞再プレーティング工程を含みます。私たちは、カチオン性脂質トランスフェクション試薬をテストしています。
注意！ウイルスを操作する特別な予防措置やウイルスと接触していたすべての材料の適切な処分を必要とします。
- プレート1.75×10 5 2.5 mlのαMEM、10％で35mm皿当たり細胞と37℃でインキュベートし、5％のCO 2。ウイルス形質導入に先立って細胞数をカウントするために、条件の数に追加のプレート1 35ミリメートルプレート。
- 少なくとも50％の細胞密度を達成するために、次の日まで細胞を増殖させます。ウイルス形質導入効率の有意な減少が50％未満の結果の細胞密度は、細胞あたりのタンパク質の発現の変化を増加し、細胞毒性を増加させました。
- 細胞プレーティングの翌日、追加のメッキ皿から細胞の数を数えます。吸引物培地と1ミリリットル0.05％トリプシン/ EDTAで一回すすいでください。 0.05％トリプシン/ EDTAの再度1ミリリットルを追加し、すべてのセルが切り離されるまで、37℃、5％CO 2でインキュベートします。別個の細胞を、ウェル1 mlピペットを用いて1ml当たりの細胞数を数えます。
- 、細胞および空ベクター（ 例えばのセル当たり0-20 PFUあたり20-40プラーク形成単位目的のタンパク質の（PFU）（POI）の感染多重度（MOI）を形質導入するために必要なウイルスの量を決定LacZ）は細胞当たり40 PFUの合計を持っています。
- 各条件について無菌フードで1.5ミリリットルのプラスチックチューブを準備し、暖かいαMEM10％の400μlを添加します。
- 氷の上でゆっくりとウイルスのアリコートを解凍し、必要に応じて、ピペッティングエラーを最小限に抑えるために1μlのより大きなボリュームをピペットするために、ウイルスストックを希釈します。
- 400μlのαMEM10％を含む各1.5ミリリットルプラスチックチューブに条件ごとに計算されたウイルスの量を追加し、ピペッティングにより穏やかに混合します。目を配置しますすぐに戻って-80℃での電子のウイルスストックは、その活性を維持します。
- 細胞から培地を吸引し、静かに滴下ウイルスミックスをピペット。よくウイルス希釈で細胞をカバーするために1時間各15分を37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートし、無菌フードの下で慎重にプレートを攪拌します。培地の少量を使用することにより、細胞とウイルスの接触を容易にします。
- 一方、トランスフェクション法以下のsiRNAトランスフェクションミックスを準備します。何のsiRNAが必要でない場合は、 空のトランスフェクションを実行するために血清を含まない培地によってsiRNAの量を交換してください。
- 以下の例は、50 nMの最終siRNA濃度のために与えられ、関心対象の各タンパク質のために適合されなければなりません。各adenofectionについて、血清を含まない150μlの培地（ 例えば 、6.25μlの20μMのsiRNA +血清を含まない144μlの培地）と1つの1.5ミリリットルのプラスチックチューブcontainiを416 nMのsiRNAをを含む1 1.5ミリリットルプラスチックチューブを準備血清を含まない+ 144μlの培地6.25μlのカチオン性脂質トランスフェクション試薬をngの。
- 200μlのピペットで数回上下にピペッティングすることで、各プラスチックチューブの内容を混ぜます。両チューブのコンテンツを組み合わせて、200μlのピペットで数回ピペッティングにより混合します。 RTで5分間インキュベートします。
- ウイルスとのインキュベーション後、穏やかに2.2 mlで全容積を得るために、各プレート1.8 mlのαMEM、10％をピペット直ちに滴下siRNAトランスフェクション混合物を各プレートにゆっくりと加えるとクロスワイズを攪拌。 24時間、37℃で、5％CO 2でプレートを転送します。
- 翌日、再プレート各35ミリメートルプレートから細胞を2.5ミリリットルαMEM10％、それぞれに4つの新しい35ミリメートルのプレートに、37℃、5％CO 2でさらに24時間インキュベートします。
- 翌日、siRNAトランスフェクションおよびウイルス感染の48時間後、を製造するための各条件について1つのプレートから収穫細胞ノックダウンの効率性及び内因性タンパク質15の発現を決定するために、タンパク質抽出およびウェスタンブロット分析。
注：残りのプレートでは、細胞固定を進める選択肢のプロトコルを使用していて、興味14の抗体を用いた免疫蛍光分析にサンプルを供します。
5.ライブ有糸分裂細胞の細胞イメージングとデータ解析
- 加湿/ 5％CO 2 /サーモ規制室を備えた倒立顕微鏡を用いて有糸分裂細胞上の短期生細胞イメージング実験を行います。
注：この研究では、スピニングディスク共焦点顕微鏡（40X、NA 0.75）を用いた、EMCCD装備は、-50℃で、電荷結合カメラ冷却しました。 - 買収に先立ち、チャンバは37℃の適切な温度に達したことを確認してください。
注：これは、顕微鏡システムに応じて数時間かかる場合があります。 - MICRで培養皿を置きます媒体の適切な均衡を可能にし、温度変化による漂流フォーカスを避けるために取得する前にOSCOPE室1時間。細胞の分裂状態を監視します。この時点で、細胞を10〜15％が有糸分裂（前期-前中期）の初期段階にあるべきです。
- 前の実験で決定されるような平衡時間の間に、取得パラメータを設定します。一般的に、100％のレーザー強度および121-130の感度で0.2から3秒の両方のチャネル（488及び594）の露光時間は、私たちの手で適切なパラメータです。
注：最初のテストは、最小レーザ強度と細胞の損傷を引き起こし、有糸分裂の進行を乱す最小光退色と適切な解決につながる取得時間/間隔を決定するためになされるべきです。 - 取得間隔を超えることなく分析するために、細胞のかなりの数を取得するための条件ごとにいくつかのフィールドを選択してください。スピニングディスク共焦点システムにおける典型的なセットアップの意志を使用して、75分-かけて1.5〜2分間隔で4異なる条件、プレート当たり7フィールドと2色チャネル（488及び594）をclude。
- 有糸分裂のエントリにある細胞、一度すべてのフィールドが選択されているフォーカスを再設定し、できるだけ速く取得を開始]を選択します。
- 少なくとも3つの時点のためのシステムの安定性を監視し、必要に応じてフォーカスを再設定。
- 75分間の最初の短期生細胞イメージング後、有糸分裂細胞の新たな分野は、分析される細胞の数を増加させるために、映画の第2のセットを取得するように選択することができます。
- 蛍光マーカーに依存した細胞の有糸分裂の表現型は、使用されている分析するために、明確に定義された基準を決定します。有糸分裂の欠陥は14をブレブ形成延長（核破壊から後期まで）有糸分裂で費やされた時間、染色体のミスアライメント、スピンドルロッキング、および皮質を含むことができます。
Differentiatin 6. LifeAct-TagGFP2アデノウイルス形質導入グラムC2C12マウス筋芽細胞
注：adenofectionプロトコルも差別を受けにくい感染さマウスC2C12筋芽細胞にも適用可能です。
- プレートプラスチック上または任意の基板上に成長培地中で35mm培養皿で2×10 5 C2C12細胞。
注：細胞の分化は、gelatine-またはマトリゲルでコーティングされた皿上に改善されています。ウイルス形質導入に先立って細胞数を決定するために1つの追加のプレートを計画します。 - 翌日、細胞が密集度の80％に達している必要があります。温かいPBSで2回細胞を洗浄し、分化培地（DM）を2mlを添加することにより、筋芽細胞の分化を誘導します。
- 次の日は、分化の1日目（D1）と名付け、生細胞におけるアクチン細胞骨格を可視化するために、アデノウイルスLifeAct-TagGFP2と筋細胞を形質導入します。 3.2で説明したように、追加のプレートから細胞数をカウントします。試験以下の5 LifeAct-TagGFP2アデノウイルスのPFU /細胞および45 PFU /細胞のAdLacZを計算しますPLEは、 表1に記載の合計ウイルス量は50 PFU /細胞です。 14に記載されるようにウイルスを使用しました
- 各条件について無菌フードで1.5ミリリットルのプラスチックチューブを準備し、暖かいDMの400μlを添加します。
- 氷の上でゆっくりとウイルスのアリコートを解凍し、必要に応じて、ピペッティングエラーを最小限に抑えるために1μlのより大きなボリュームをピペットするために、ウイルスストックを希釈します。
- 400μlのDMを含む各1.5ミリリットルのプラスチックチューブに条件ごとのウイルス粒子の適切な量を追加し、ピペッティングにより穏やかに混合します。その活性を維持するためにすぐに戻って-80℃でのウイルスストックを置きます。
- 皿から培地を吸引し、静かに滴下ウイルスミックスをピペット。 37°C、5％CO 2で細胞をインキュベートし、十分にウイルスで細胞をカバーするために1時間の合計無菌フードの下に慎重に各15分のプレートを攪拌します。
- インキュベーションの後、静かにそれぞれのプレートに1.6ミリリットルDMをピペットと私を続けます37℃、5％CO 2でさらに2時間ncubation。
- 一方、CAPIトランスフェクション法、次の空のトランスフェクションミックスを準備します。各条件について200μlのミックスを計算します。 400μlのミックスの総容量は、以下の例を使用してください。
- 1.5ミリリットルプラスチックチューブでは、ピペット50μlの1 MのCaCl 2を150μlに滅菌H 2 O、ボルテックスで混和します。クイックスピンした後、慎重に滴下200μlのHBS2x（280 mMの塩化ナトリウム、50mMのHEPES、1.5mMののNa 2 HPO 4、pHは7.01から7.05）を追加します。静かに200μlのピペットを用いて空気注入によって3回混ぜます。
- RTで30分間混合しインキュベートします。滴下トランスフェクション混合物の200μLを各プレートにゆっくりと加えるとクロスワイズを攪拌します。 16時間37℃で、5％CO 2でプレートを転送します。
- 次の日は、2ミリリットル暖かいHEPES（6.7のKCl、150mMのNaCl、10mMのHEPES、pHは7.3）で細胞を2回洗浄し、2ミリリットルのDMを追加します。 infeを視覚化ctionの20-40X（空気）の倍率で倒立蛍光顕微鏡下での効率化と文書化のための両方の蛍光及び伝送路状態ごとに3つの代表的な画像を取得します。
- 目的の実験のセットアップに応じて、数日間筋管への分化に従ってください。細胞を固定し、続いて行うことができる免疫蛍光分析または生細胞イメージング研究に供することができます。
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Representative Results
カチオン性脂質を用いて、BAG3-GFPプラスミドDNAのトランスフェクションは、いくつかの細胞が非常に高いBAG3レベル（ 図2A）を有するタンパク質及びその他のかろうじて検出可能なレベルを示す、HeLa細胞における異種の発現と関連していました。これらの細胞において、タンパク質ホメオスタシスの喪失は核周囲凝集体（ 図2A、矢印）にBAG3-GFPの蓄積により証明されました。これとは対照的に、BAG3-GFPを運ぶアデノウイルスと細胞形質導入は、より均質な低発現とBAG3-GFP（ 図2B、単独の感染症）の正確な局在を示しました。それが細胞（ 図2B、Adenofection）の大部分で均質な表現を維持許さながら驚くべきことに、アデノウイルス形質導入（ すなわち 、アデノウイルス粒子のトランスフェクション）中のカチオン性脂質の添加は著しく、同様のMOIで細胞あたりのBAG3-GFPの発現を増加させました。
沈殿又はHeLa細胞における形質導入、トランスフェクション効率を高めるために、リポソームをベースとする化合物。 図3野生型BAG3のの一つに結合廃止変異を有する（WT）-GFPまたはBAG3（IPV）-GFP変異体を有する典型的な実験を示しますシャペロンパートナーHSPB8（ 図3A、3B）。 HSPB8 7の安定化におけるBAG3の役割と一致して、BAG3のサイレンシングは、BAG3 WTの再導入時に正常レベルに回復したHSPB8、のレベルの約50％の減少につながったが、ない変異体の同様なレベルの発現によってBAG3（IPV）-GFPの単独GFPの。これらの条件下では、BAG3-GFPタンパク質は、適切に核周辺、中心体領域（ 図3C、3D）で富化された細胞の75％〜90％〜内に局在しました。このsuggadenofectionはBAG3の細胞におけるBAG3-HSPB8複合体のダイナミクスを保存することをested。
HSPB8とBAG3はまた、細胞骨格タンパク質恒常10を乱す様々なタンパク質毒性（proteotoxic）ストレスによってアップレギュレートされます。したがって、シャペロンの過剰発現は、潜在的な細胞morphodynamicsを制御する高分子構造の組立・分解を妨害する可能性があります。非ストレス条件下BAG3-HSPB8の役割を評価するためには、タンパク質ホメオスタシスを最小限adenofection手順によって乱されたことを確認することが重要でした。そのため、熱ショックタンパク質ファミリーのシャペロンのレベルの変化を監視することは、タンパク質ホメオスタシスの状態の良好な指標です。 図4に示すように、CAPIまたはリポソームベースの方法によってadenofectionが大幅に内因性HSPB8とBAG3のレベルを増加させる、またはメジャーHSP70 / HSPA1シャペロンシステムとしませんでした。対照的に、典型的な熱ショックまたはMG132、プロテアソーム阻害剤のようなタンパク質毒性（proteotoxic）の治療は、HeLa細胞におけるシャペロン - コシャペロンタンパク質のレベルを増加させました。
アクチンとチューブリンの蛍光プローブ（BacMamによって-RFPアクチンとGFP-αtubulin）の発現を駆動するバキュロウイルスと組み合わせadenofection手順は、有糸分裂細胞動態を追跡するのに適していた場合、私たちはその後、決定しようとしました。 図5に示すように、コントロールsiRNA（siCTL）とHeLa細胞のadenofectionは、有糸分裂紡錘体のダイナミクス（緑）または有糸分裂（ 図5A、代表的な共焦点タイムラプス系列）で費やされた平均時間を邪魔しませんでした。異常な有糸分裂イベントを示し、これらの細胞の割合は、一般に、癌細胞株において観察された有糸分裂の欠陥（~30％-40％、 図5B）のレベルと一致していました。これとは対照的に、単独でBAG3特異的siRNA（siBAG3）でadenofected細胞はLEVEで〜2倍の増加を示しましたBAG3-GFP（WT）により、対照細胞に近いレベルまで回復した有糸分裂の表現型の欠陥、lのではなく、GFPにより、単独で。これは、 フックスら 14によって示されるように、有糸分裂の中と外の細胞の適切な進行を調節する細胞骨格ダイナミクスのBAG3とその関連シャペロンの影響の機能解析のためのadenofectionの適合性を検証しました。
adenofection法の汎用性を確認するために、我々はその後、16 F-アクチンを標識するために、市販のアデノウイルスLifeAct-GFPを用いて、マウスC2C12筋細胞の分化中にF-アクチンの可視化を可能にするプロトコルを適応しました。 C2C12細胞はAdenofection前に一日のために分化するように誘導しました。 CAPIベースadenofectionプロトコルを使用して、アデノウイルスLifeAct-GFPの著しく低い量は、容易にdiffereのかなりの割合で蛍光顕微鏡によって検出されたレベルで、プローブを発現させるために十分で ntiating筋細胞（〜3-5 PFU /細胞; 図6）。これは、17-19（250-400 MOIのために）マウスC2C12細胞を形質導入するために、文献で 報告された感染の極めて高い多重度は著しく対照的でした。さらに、7日間の分化プロセスを監視することによって、我々は、筋管形成は有意手順によって損なわれなかったことを確立しました。これは筋細胞融合、きめ細かアクチンダイナミクス20に依存しているプロセスは、LifeAct-GFP（ 図6、6日と7日目）の低レベルの発現によって乱さないことが示唆されました。蛍光マーカーは、まだ何日C2C12細胞のadenofection後に検出することができるので、私たちは、このメソッドはC2C12の筋形成の異なる段階でのアクチンダイナミクスのシャペロンの影響の機能解析に適していると考えています。
典型的なadenofectionプロトコルの 図1. 計画。典型的な実験の一連の工程は、細胞プレーティングの導入を含む（黄色で強調表示）、カチオン性脂質トランスフェクション試薬を使用して、（グレーの下線）CAPIの沈殿物を使用してプロトコルまたはプロトコルのために示されていますアデノおよびバキュロウイルス、siRNA二本鎖のトランスフェクション、および二重チミジンブロックとセル同期。両方のプロトコルのための時間でタイムラインは、図の右側に示されています。fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Adenofectionを使用してBAG3-GFPの 図2. 均質かつ効率的な発現。（A）HeLa細胞の代表的なエピ蛍光画像 それは、（矢印で示す）の高発現レベルでのタンパク質の核周囲凝集体および細胞集団内の不均質な発現を示す、BAG3-GFPプラスミドDNAでトランスフェクトしました。ウェスタンブロットは、タンパク質の大部分はいくつかの細胞において過剰発現されることを示し、全体の細胞集団における内因性BAG3レベルにBAG3-GFPの相対的な高い発現を示します。 （B）のみの形質導入またはAd-BAG3-GFPウイルス粒子の増加量を用いてadenofectedされたHeLa細胞の代表的なエピ蛍光画像。画像同一のパラメータを使用して取得したと同様にバックグラウンド減算及び強度のために処理しました。バー：50μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. 効率的なBAG3のノックダウンと近く内因性レベルでのBAG3-GFPタンパク質の再導入。RFP-H2B（A）または親HeLa細胞（B）を発現する （AB）HeLa細胞を示したsiRNAおよびCAPIを使用して、組換えアデノウイルスでadenofectedました方法（A）又はトランスフェクション試薬（B）のようなリポソーム系化合物。細胞を、二重チミジンブロック法によって同調させた、全細胞抽出物は、放出の第二段階の間に調製しました。 Weste rnをブロットはBAG3枯渇レベル（BAG3の内因性）、adenofected BAG3-GFPタンパク質のレベル、およびHSPB8の内因性レベルを示します。 GAPDHレベル：ローディングコントロール。枯渇は（対照siRNA-siCtlとBAG3-GFP WT、 すなわち1/2 1/4でadenofected）コントロール抽出物の減少量をロードすることによって、> 75％と推定されました。 BAG3（IPV）-GFPまたはGFP単独個々BAG3-GFPタンパク質がBAG3の内因性のレベルに近く、野生型BAG3-GFPことで導入したことに注意してくださいではなく、BAG3枯渇細胞にHSPB8レベルを回復しました。 （CD）CAPIまたはカチオン性脂質トランスフェクション試薬を使用して示された組換えのAd-BAG3-GFPでadenofectedされたHeLa細胞の代表的なエピ蛍光画像。バー：20μmです。 （A）及び（C）に示した代表的な結果をフックスら、PLoSのジュネから変更されています。 2015年10月23日; 11（10）：e1005582、DOI：10.1371 / journal.pgen.1005582 14。ジル/ ftp_upload / 54557 / 54557fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
。 図4 Adenofection、全細胞抽出物のウェスタンブロットは、コントロールHeLa細胞（NT：未処理）から調製したHeLa細胞におけるストレス応答を誘導しない 、またはHeLa細胞を単独対照siRNA（siCtlなしアデノウイルス）でトランスフェクトし、またはsiCtlとadenofected 44での熱ショック：およびAd-GFPがCAPIまたはカチオン性脂質トランスフェクション試薬のいずれかを使用して、または典型的なタンパク質毒性（proteotoxic）処置（HSに提出したHeLa細胞から 37℃で16時間の回復に続いて60分間°C。 MG132：BAG3、HSPB8のおよび他のストレス誘導性シャペロン、すなわちHSP70 / HSPA /およびHSP27 / HSPB1のレベルを示すプロテアソーム阻害剤、16時間5μM）; GAPDH：コントロールをロードします。なお、一方で、すべてのプロのレベルGAPDHを除いteinsは、タンパク質毒性（proteotoxic）ストレス処理時に増加した、彼らはadenofectionによって変化しませんでした。タンパク質レベルの変動がHSPはでの一般的な増加負担HS細胞抽出物の荷重変化する量によって評価した（HS：1を1/2、1/4⅛;例えば、HSP70はタンパク質毒性（proteotoxic）ストレスに応答して8倍以上によって誘導された）。 してくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.有糸分裂を介してHeLa細胞の進行を著しくAdenofectionによって乱されていません。一緒にBacMam- GFP-αチューブリンとBacMamによってでコントロールsiRNA（siCtl）でadenofectedしたHeLa細胞からの（A）代表共焦点タイムラプスシーケンス-RFPアクチンおよびディスク共焦点microscoを回転させることにより撮像されました〜1.5分間隔で60〜90分間PY。白と黄色のアスタリスクは比較的安定して紡錘体極の位置を指定します。バー：10μmです。 （B）siCtlまたはBAG3特異的siRNAでadenofected細胞の定量、とまたは示さGFPタンパク質（GFP単独または野生型BAG3-GFP：WT）なし。グラフは、異常な有糸分裂紡錘体の揺動と定義され、有糸分裂+/-または染色体のミスアライメントに失速して細胞の割合を示しています。平均+/- SEが示されています。 （B）に示した代表的な結果は、 フックスら、PLoSのジュネから採取しました。 2015年10月23日; 11（10）：e1005582、DOI：10.1371 / journal.pgen.1005582 14。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 パネル（A）に関連した動画を見るにはこちらをクリックしてください。
図6 のAd-LifeAct-GFPおよび筋管形成とC2C12筋細胞のAdenofection。後でLifeAct-GFPの5 PFU /細胞および45 PFU /セルを用いadenofection 1日のために分化するように誘導され、処理されたC2C12細胞の代表的なエピ蛍光画像LacZをします。画像は分化過程（2日目、6日目と7日目）の間にGFPマーカーの発現を示します。バー：20μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、化学量論およびタンパク質複合体と高分子構造の動力学に影響を与えるタンパク質の過剰発現に特に感受性である細胞生物学的過程の機能的分析にも適用可能であるデプレッションレスキュー実験を行うことができる方法を記載しました。有糸分裂細胞分裂は、細胞の全体的な構造の中で最も劇的な壮大な変化を伴う細かく調整された細胞morphodynamicsの極端な例です。細胞イメージングのためのアクチンとチューブリンマーカーの低いが検出可能な量を導入するために、市販のBacMamによって試薬と組み合わせadenofectionを使用して、適切な有糸分裂細胞のリモデリングへのシャペロン複雑BAG3-HSPB8の寄与を明確に示すことができました。フックスらによる最近の研究では、BAG3の枯渇ができないことに関連している主軸方位の欠陥は、剛性有糸分裂アクチン皮質を確立し、アクチン豊富な組み立てになり示されています後退繊維14。適切なスピンドルダイナミクスもBAG3サイレンシング時のHSPB8レベルで見られる減少を補正し、野生型BAG3-GFPの再導入によって回復することができました。これはadenofectionは、スピンドルダイナミクスの機能回復と相関する生理学的に関連するシャペロン複合体の回復を可能にすることを意味します。
デプレッションレスキュー実験のためadenofectionの使用は、それが実質的に不可能の影響を分析すること、いくつかの細胞型（ すなわち、オートファジー）21におけるストレス応答の強力な誘導をもたらすことができる、プラスミドDNAトランスフェクションまたはヌクレオ上の利点を提供しますシャペロンとその生理的役割を与えられました。確かに、私たちの手で、BAG3プラスミドDNAのトランスフェクションは、細胞当たりのより高い発現、凝集体形成、およびいくつかの細胞型における細胞のアポトーシス/生存への影響（ 図2）と関連しています。 BAG3は、足場の活性を有するモジュラーコシャペロンである、どのメートルAYそのパートナータンパク質9に応じて複数の役割を果たしています。したがって、BAG3の過剰発現の際に複雑な化学量論の摂動は望ましくないドミナントネガティブな効果を有し、毒性を誘導することができます。それはのためにいくつかの安全性レンチウイルスベースのベクターとは対照的に、宿主細胞ゲノムに組み込まれないように、高容量組換えアデノウイルスは、培養中の両方の分割および非分裂細胞の大きな遺伝子の一過性および安全性の配信のための理想的な車両です懸念が依然として残っています。デプレッションレスキュー実験のためのアデノウイルスの使用の潜在的な欠点は、時間がかかることができる繰り返す準備を必要とすることです。彼らはまた、再現性の形質導入の有効性のための感染性粒子の注意深い滴定に依存しています。
知らBAG3機能ドメインの寄与をスクリーニングするadenofectionを使用して、我々は、通常動作時にHSPB8依存BAG3機能の存在を、我々の知る限り、最初の証拠を得ましたHSP70 / HSPA1シャペロンシステムとの相互作用を必要としないセルを分割します。 Adenofectionは、ここに提示したデータにより示唆されるように、筋管への筋細胞分化のプロセスの間にF-アクチンを追跡するために適用可能であるべきです。したがって、我々の方法は、目的の遺伝子の構造と機能の解析が進められているプロジェクトの広い範囲で有用である細胞morphodynamicsへの影響を最小限に抑え有するsiRNAベースのデプレッションレスキュー実験のための汎用性と効率的なプロトコルを提供します。
ウイルス粒子の最低量と細胞の効率的なトランスフェクション、形質導入を達成するために、カチオン性化合物、脂質を利用することは、この方法の鍵となります。それは、細胞当たりの外因性タンパク質のレベルを制御するためのより大きな窓を提供するが、我々はそれがさらに、APの影響を軽減する必要があり、アデノウイルス細胞結合エントリから生じるシグナル伝達経路の潜在的な副作用を最小限に抑えることが可能と考えています形態形成経路上の関心rotein。
アデノウイルスの形質導入効率を増加させるために異なる試薬は、CAR受容体ブースターとして、市販されていることに留意すべきです。このような試薬は、しかし、高価であり、上述した細胞の形状および接着に関連したシグナル伝達経路を活性化することが示されているようにCAR受容体を、必要とするように、細胞へのウイルス結合侵入を促進することが期待されます。 CAPIはCAR非依存性経路を介してアデノウイルスの侵入を増強する手段として、カチオン性リポソームよりも安価であるが、それはまた、いくつかの細胞株に対してより毒性です。我々は、使用する細胞株および目的の生物学的読み出しに応じて、カチオン性脂質試薬対CAPIの間の選択を方向付けるために、空のadenofectionの前にテストすることをお勧めします。
このような、ここで説明したものと一緒にゲノム編集の新たな生物工学ツールと、RNA干渉ベースのノックダウンレスキューアプローチは、ARを提供しています強力な分子ツールの線は現在、最適な特定のアプリケーション3によって研究者が選択することができる細胞で遺伝子機能を解明します。私たちは、adenofectionは、構造 - 機能は、複数の細胞の背景にある目的のタンパク質の寄与の解析のための低形質ノックダウンを作成するために、比較的迅速かつ簡単なシステムを提供すると信じています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 Mouse Myoblasts | ATCC | CRL-1772 | |
| Adenovirus custom design | Welgen | Custom design | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10582 | |
| CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10614 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher | 12483-020 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glass bottom dishes, 35 mm | MatTek Corperation | P35G-1.5-20-C Case | |
| HeLa-RFP-H2B | Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada | Klebig C et al. 2009 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| Horse Serum, New Zealand | Thermo Fisher | 16050-122 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher | 13778-150 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha | Wisent | 310-101-CL | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides | Thermo Fisher | 12000-022 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red | Thermo Fisher | 41061-029 | |
| Na2HPO4 | Biobasic | S0404 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher | 11058-021 | |
| rAVCMV-LifeAct-TagGFP2 | IBIDI | 60121 | |
| siRNA duplexes | Dharmacon | Custom design | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Trypsine 2.5% | Thermo Fisher | 15090-046 |
References
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