Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Adenofection: שיטה בחקר התפקיד של מלוויהם מולקולריים הסלולרית Morphodynamics ידי ניסויי דלדול-הצלה

Published: September 16, 2016 doi: 10.3791/54557
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1,2, 1,2, 1,2
1Département de biologie moléculaire, biochimie médicale et pathologie, Faculté de médecine, Centre de recherche sur le cancer de l'Université Laval, 2Oncology, Centre de recherche du CHU de Québec, Université Laval, 3Laboratoire d'études moléculaires des valvulopathies (LEMV), Groupe de recherche en valvulopathies (GRV), Quebec Heart and Lung Institute/Research Center, 4Department of Surgery, Université Laval

Abstract

תהליכים תאיים כגון מיטוזה התמיינות תאים נשלטים על ידי שינויים בצורת תא נשענים ברובם על שיפוץ התקין של מבני cytoskeletal התא. זה כולל את מכלול הפירוק של מבני macromolecular מסדר גבוה בכל זמן נתון ומיקום, תהליך רגיש במיוחד להפרעות הנגרמת על ידי ביטוי יתר של חלבונים. שיטות שיכולים לשמר הומאוסטזיס חלבון ולשמור ליד אל-נורמלי מורפולוגיה הסלולר הן רצויות מאוד לקבוע את התרומה התפקודית של חלבון של עניין במגוון רחב של תהליכים תאיים. דלדול-הצלת חלוף ניסויים מבוססים על התערבות RNA גישות רבות עצמה כדי לנתח פונקציות חלבון ודרישות מבניות. עם זאת, חידוש של חלבון המטרה עם מינימום סטיות מרמתו הפיזיולוגית הוא אתגר אמיתי. כאן אנו מתארים adenofection שיטת כינה אשר פותח כדי ללמוד את התפקיד של מלווים מולקולרייםשותפי ד ב הפעולה הרגילה של תאי מתחלקים ומערכת היחסים עם שיפוץ יקטין. תאי הלה היו מתרוקנים של BAG3 עם דופלקסים siRNA מיקוד באזור 3'UTR. חלבונים BAG3-tagged GFP היו מחדש סימולטנית לאנגלית> 75% של תאים באמצעות adenoviruses רקומביננטי מצמידים את ריאגנטים transfection. Adenofection לאפשר להביע חלבונים BAG3-GFP ברמות פיזיולוגיות ליד בתאים הלה מדולדל של BAG3, בהעדר תגובת הלחץ. אין השפעה נצפתה על הרמות של מלוות חלבון הלם חום אנדוגני, רגולטורי מתח מושרה הראשיים של הומאוסטזיס חלבון. יתר על כן, על ידי הוספת baculoviruses נהיגת הביטוי של סמני ניאון בזמן-transfection התמר תא, נוכל לנתח דינמיקת תא mitotic ידי מיקרוסקופי זמן לשגות מנתח עם הפרעות מינימום של התקדמות mitotic הנורמלית. Adenofection ישימה גם לתאי עכבר שקשה להדביק, ומתאים עבור ניתוחים תפקודיים של diff myoblasterentiation לתוך myotubes. לפיכך adenofection מספק שיטה צדדית לבצע מבנה-תפקוד המנתח של חלבונים מעורבים בתהליכים ביולוגיים רגישים המסתמכים על דינמיקת cytoskeletal מסדר גבוה.

Introduction

איון פונקציונלי של ביטוי גנים בתאי יונקים הוא תקן הזהב לנתח פונקציות חלבון. חדש הטכנולוגיות שפותחו של עריכת הגנום מבוסס על השימוש nucleases באתר ספציפי כגון nucleases אבץ-אצבע התקבצו בקביעות interspaced חזרות palindromic קצר (CRISPR) / CAS9 כעת לאפשר לדור של שורות תאים עם המחיקה הגן ממוקדות מוטציה 1,2. גישות חדשות אלו צריכות לחולל מהפכה באופן שבו אנו לומדים תפקוד חלבון ואת הבנתנו את הגנטיקה של מחלות אנושיות. בחלק מהמקרים, לעומת זאת, לטווח ארוך או נוקאאוט גנטי שלם אינו רצוי ועלול לעורר מנגנוני פיצוי התא המשני. הדור של שורות תאים מהונדסים גנטית יכול להיות גם להגביל כשדנים בתרביות תאים ראשוניים עם קיבולת התפשטות מוגבלת, או כאשר ההקרנה של רשימה ארוכה של מוטציות תאים מסוגים שונים הוא ביקש. זה נדרש לעתים קרובות לקביעת התלות של b התאתהליך iological על דרישות מבניות של חלבון. לשם כך, מציאה הפיכה על ידי התערבות RNA המאפשרת ניסויים-הצלת דלדול חולפים ברקע הסלולר שונה עדיין גישה פשוטה ורב עצמה כדי לבצע מבנה-תפקוד המנתח של חלבון של עניין 3. עם זאת, חסרון עיקרי של גישה זו הוא הקושי להשיג השתקה יעילה לחדש את החלבון של עניין או גרסותיה ברמות הפיזיולוגיות קרובות מוצג רוב אוכלוסיית התא. זה חיוני כדי לאפשר מחקרים מקיפים המנסים לתאם השפעות פונקציונליות לראות ברמה של תאים בודדים (פנוטיפ hypomorphic) לאלו שנראו מבוססי מבחני אוכלוסיית תאים, למשל על אינטראקציות בין חלבונים.

שימוש בשיטות transfection קלסיים, נדמה שאי אפשר להשיג ביטוי הומוגנית ונמוך של חלבונים אקסוגניים אוכלוסייה גדולה של תאים. התמרה של תאים עם וירוסים רקומביננטיכמו adenoviruses מאפשר לעתים קרובות ביטוי מנורמל יותר של חלבונים אקסוגניים. עם זאת, ספיגת אדנווירוס הוא מוגבל על ידי קולטן CAR, אשר נעדר בתאים שאינם בני אדם או רק הביע חלש בחלק סוגי תאים אנושיים. יתר על כן, כניסת הסלולר של adenoviruses מפעילה מסלולי איתות מווסתים 4-6 צורת הידבקות תא. זה כמובן לא רצוי כאשר לומדים מנגנוני ויסות של morphodynamics התא. אנו עומדים בפני בעייתיים הזה כשאנחנו התחייבנו ניתוחים תפקודיים של קומפלקס מלווה, BAG3-HSPB8, חלוקת תא ואת הדינמיקה תקטין. החלוץ לעבוד תיארה תפקיד מורכב המלווה הזה בקרת איכות חלבון autophagy במהלך מתח 7,8. רוב המחקרים האלה, לעומת זאת, הסתמכו על ביטוי יתר של חלבון, בהנחת המלווים הם שהוגברו כרגיל בזמן המתח. זה השאיר פתוח את השאלה של BAG3 אם, בקומפלקס עם HSPB8, יכול לתרום לפעילות התקינה של תאים המתחלקים להביע המלווה אסה כמו סוגים רבים של תאים סרטניים 9. בפרט, אם מורכבי המלווה תורמים השיפוץ של מבנים מבוססים יקטינו השולטים התקדמות mitotic היה עניין רב, בהתחשב הקשרים המתעוררים בין מלווי HSPB ודינמיקת cytoskeletal 10. כדי לטפל בבעיה זו, אנו מחפשים לפתח שיטה יעילה ניסויי דלדול-הצלה שלא תפריע להתקדמות mitotic או מורפולוגיה הסלולר, ואשר שיישמר הומאוסטזיס חלבון כדי למנוע הפרעה משנית של הדינמיקה של מתחמי macromolecular המסדיר שינויים בצורת התא . כך באופן אידיאלי, דלדול-התוספת האחורי של הגן של עניין צריך להתבצע בו זמנית.

השימוש מכלולי אדנו עם פולימר קטיוני או שומנים תואר לקדם העברת גנים במבחנת in vivo 11,12. למשל, סידן פוספט (קאפי) מופיע לגבש משקע עםאדנו-וירוס המשפרים כניסה מחייבת באמצעות מסלול CAR-עצמאי 13. ואכן, מצאנו כי שילוב התמרה מבוסס תאי אדנו ו transfection עם תרכובות קטיוני יכול לשפר את היעילות של ניסויי דלדול-ההצלה. זה אפשר לנו להוריד את הכמויות של נגיף על ידי 3 עד פי 20, בהתאם לקו התא ואת הגן של עניין, ותועלת מחלון רחב יותר על מנת להתאים את הביטוי של חלבונים אקסוגני ברמות אנדוגני קרובות הרוב אוכלוסייה של עניין תא עם השפעה מינימאלית על מורפולוגיה הסלולר. בתנאים כאלה, אנחנו גם יכולים להשיג מציאה יעילה גבוהה של ביטוי חלבון אנדוגני (> 75%). הנם מתארים את שיטת הצעד אחרת צעד ולספק ראיות לכך הומאוסטזיס חלבון אינו מוטרד באופן משמעותי כפי שהוערך על ידי הרמות ללא שינוי של מלוות בעקבות לחץ של מש' חלבון הלם החום, מה שהופך את השיטה מתאימה עבור ניתוחים תפקודיים של ro הפיזיולוגיle של מלווים מולקולריים ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו. הפרוטוקול ניתן נהלי סנכרון תא לשימוש baculoviruses הזמין מסחרי עבור שיתוף ביטוי של רמות הנמוכות של סמני ניאון, עם התערבות מינימאלית עם מבוססים תקטינו נורמלית ודינמיקת הציר במהלך התקדמות mitotic. בנוסף, אנו מציגים את הרבגוניות של שיטה, אשר חל על "קשה transduce" בתאי עכבר C2C12, ללא השפעה משמעותית על בידול myoblast לתוך myotubes במבחנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת בינוני ופתרונות (כל סטרילי מסונן)

  1. תאי שריר עכבר C2C12 (מחקרי בידול)
    1. כן 500 מיליליטר של צמיחה בינונית עבור תחזוקת תרבית תאי C2C12: גלוקוז גבוה DMEM בתוספת 10% FBS ו 2 המ"מ L- גלוטמין.
    2. כן 100 מיליליטר בידול בינוני (DM) לבידול C2C12: גלוקוז DMEM הגבוה בתוספת 2% סוס סרום.
  2. תאי הלה (מחקרים בתאי mitotic)
    1. הכן 500 מ"ל αMEM לתחזוקה תרבות הלה RFP-H2B התא וניסויים: αMEM בתוספת 10 FBS% ו -2 מ"מ L- גלוטמין (αMEM 10%).
    2. הכן 500 מ"ל αMEM-מינוס (ללא deoxyribonucleosides / ribonucleosides) לסינכרון תא הלה RFP-H2B: αMEM-מינוס בתוספת 10% FBS ו 2 מ"מ L- גלוטמין (αMEM-מינוס 10%).
    3. הכן 20 מ"ל αMEM ללא פנול אדום עבור הלה-RFP-H2B lרכישת תא ive: αMEM ללא פנול אדום בתוספת 10 FBS% ו -2 מ"מ L- גלוטמין.
    4. הכן 100 thymidine מ"מ: להמיס 24.2 מ"ג 1 מ"ל H 2 O ב 37 ° C על ידי vortexing. סנן לעקר ולשמור על 4 מעלות צלזיוס.
  3. פתרונות משותפים
    1. הכן 0.05% טריפסין / EDTA: 0.05% טריפסין, 0.625 מ"מ EDTA ב בופר פוספט 1x (PBS). סנן לעקר aliquots ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. לאחר מופשר, לשמור aliquot על 4 מעלות צלזיוס.
    2. כן HBS2x: 280 mM NaCl, 50 HEPES מ"מ, 1.5 מ"מ Na 2 HPO 4. התאם את ה- pH בדיוק בין 7.01-7.05 עם 10 N NaOH. סינון סטרילי ולשמור ב 4 ° C..

ציפוי 2. של צלחות תרבית תאים עם פיברונקטין ו ציפוי של תאים הלה-RFP-H2B

הערה: לפני הניסוי, כל מניפולטור צריכה להגדיר את תנאי ציפוי תא אופטימליים להשגת צפיפות נכונה של תאים מאז וריאציות עשויות OCנוכ בין כל מניפולטור וכל שורת תאים שונה.

  1. היום לפני הניסוי, להרחיב תאים הלה-RFP-H2B לוודא כי הם במסגרת שלב מעריכי צמיחה ביום ציפוי. הפוך 2 רצופים 1/3 דילולים 10 צלחות ס"מ החל צלחת ס"מ 1x10 80% ומחוברות.
    הערה: תכנן את מספר הצלחות עבור הניסוי. לחשב כל תנאים ככפילויות, אחד עבור הדמיה לטווח קצר לחיות תאים ואחד עבור חלבון מוציאים כדי לקבוע את היעילות של מציאת ביטוי חלבון אקסוגני על ידי ניתוח כתם מערבי. תכנן צלחת אחת נוספת כדי לקבוע את המספר הסלולרי לפני תמרת וירוס.
  2. לפני תא ציפוי, מנות תחתיות זכוכית מעיילת עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר פיברונקטין. הוסף 1 מ"ל של דילול 1: 100 של 1 מ"ג / מ"ל פיברונקטין (מדולל PBS 1x סטרילי) לכל 35 מ"מ צלחת כדי גם לכסות את כל פני השטח דגירה במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  3. במהלך הדגירה, αMEM טרום חם בתוספת wiה 10% FBS (αMEM 10%) ו 0.05% טריפסין / EDTA על 37 מעלות צלזיוס.
  4. לאחר 45 דקות של דגירה, להתחיל להכין את פתרון התא. ב למכסה המנוע סטרילית, לשאוב את המדיום מהצלחת 10 ס"מ, לשטוף פעמיים בעדינות עם 1.5 מ"ל 0.05% טריפסין / EDTA, ולהשאיר 0.5 מ"ל של EDTA טריפסין / על השאיפה האחרונה.
  5. דגירת התאים במשך 2-3 דקות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. על ידי הקשה על הצלחת והתבוננות בעדינות מתחת למיקרוסקופ, לוודא שכל התאים שהופרדו. הוסף 10 מ"ל של αMEM 10% ו פיפטה בעדינות מספר פעמים על מנת להפריד בין תאים. רוזן מדגם 10 μl של השעית התא באמצעות haemocytometer.
  6. פתרון פיברונקטין לשאוב מנות תחתית זכוכית. אל תאפשר פיברונקטין להתייבש לפני ציפוי התא.
  7. פלייט 1.5x10 5 תאים לכל 35 צלחת מ"מ 2 מ"ל αMEM 10% ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. ודא לאחר 30-45 דקות תחת מיקרוסקופ כי התאים הם SEPA היטבמדורג, שכן יש להם נטייה להצטבר במרכז הצלחת.
  8. במידת הצורך, להתסיס את צלחות בעדינות צולבות חכם כדי לפזר מחדש את התאים. צלחת אחת 35 מ"מ צלחת נוספת למספר תנאים, על מנת לספור את מספר הסלולרי לפני התמרה וירוס.
  9. לגדל תאים עד למחרת כדי להשיג צפיפות תאים של 50% לפחות. צפיפות תאים נמוכים מ -50% תוצאות לירידה משמעותית של יעילות התמר וירוס, גדלו וריאציות של ביטוי חלבון לכל תא, וגדילה רעילה לתא.
    הערה: ציפוי של כלים מזכוכית עם פיברונקטין משפר את גדילת תאים ומורפולוגיה ומקדם התקדמות נאותה של תאים דרך מיטוזה. זה יכול להיות מוחלף בדרך כלל על ידי ג'לטין הזמין מסחרי כי הוא זול יותר.

3. התמרה Adenovirus ו אנדוגני חלבון מציאה ידי siRNA Transfection בתאי הלה-RFP-H2B שימוש קאפי משקעים

זהירות! עבודהing עם וירוסים דורש אמצעי זהירות מיוחדת וכן לסילוק נאות של כל החומר כי כבר במגע עם הנגיף.

זהירות! בידיים שלנו, קאפי משקעים לעתים קרובות יש תופעות יותר רצויה, למשל על תהליכים ביולוגיים מעורבים בסחר שלפוחית ​​(למשל, autophagy). לפיכך מומלץ להשתמש מגיב transfection שומנים קטיוני (ראה להלן) ולהמתין לפחות 48 שעות לפני הניתוחים.

הערה: אדנו מלא נושאת גנים שאינם קשורים (כלומר, LacZ) או לא גן משמשת להגיע פנים מינימאליים בכל Adenofections (10-20 pfu / תא) באמצעות הסכום הנמוך ביותר של אדנו רקומביננטי נושא את הגן של עניין.

הערה: הליך זה הוכח לעזור ביטוי נרמול לכל תא באוכלוסייה תא גדול.

  1. יום אחד לאחר ציפוי תא, לספור את מספר תאי מצלחת המצופית הנוספת. לשאוב בינונילשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל 0.05% טריפסין / EDTA. להוסיף שוב 1 מ"ל של 0.05% טריפסין / EDTA ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד שכל התאים מנותקים. הפרד את התאים היטב בעזרת פיפטה 1ml ולספור את מספר התאים לכל מ"ל באמצעות haemocytometer.
  2. לקבוע את כמות הנגיף צריך transduce תאים על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 2 יחידות להרכיב פלאק (PFU) של החלבון של עניין (POI) לכל תא ו -18 PFU לכל תא של וקטור ריק (למשל, LacZ) צריך בסך הכל 20 PFU לכל תא. במקביל transduce 4 PFU של כל baculovirus (אקטין αTubulin, GFP ו RFP-tagged בהתאמה). Transduce תא באמצעות פרוטוקול adenofection הבא. וירוסים שימשו כמתואר פוקס ואח '. 14
  3. הכן במנדף סטרילי צינור פלסטיק 1.5 מיליליטר עבור כל תנאים ולהוסיף 400 μl של αMEM-מינוס חם 10%.
  4. להפשיר aliquot של וירוסים לאט על קרח, ואם יש צורך, לדלל tהוא מניות וירוס כדי pipet נפח גדול מ -1 μl כדי למזער שגיאות pipetting.
  5. מוסיפים את כמות הנגיף המחושב לכל מצב לכל צינור פלסטיק 1.5 מ"ל המכיל 400 μl αMEM-מינוס 10% ומערבבים בעדינות על ידי pipetting. מניח את מניות הווירוס מייד בחזרה ב -80 ° C כדי לשמור על פעילותה.
  6. לשאוב את המדיום מן התאים פיפטה בעדינות לתערובת וירוס טיפה חכמה. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו להתסיס את הצלחות בקפידה מתחת למכסה המנוע סטרילית כל 15 דקות במשך שעה 1 כדי גם לכסות את התאים עם הנגיף. באמצעות כמות קטנה של המדיום הופך לפשוט יותר את הקשר של הנגיף עם התאים.
  7. לאחר דגירה, פיפטה בעדינות 1.6 מ"ל αMEM-מינוס 10% על כל צלחת להשיג בנפח כולל של 2 מ"ל, להתחיל סינכרון התא על ידי הוספת thymidine 2 מ"מ ו דגירה התאים במשך שעה 2 נוסף על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 .
  8. בינתיים מכינים את followi תערובת transfection siRNAng שיטת transfection קאפי (ראה איור 1). אם לא siRNA יש צורך, להחליף את כמות siRNA ידי מים סטריליים כדי לבצע transfection ריק.
  9. חישוב 200 תערובת μl עבור כל תנאי, וכתוצאה מכך 400 μl לכל כפולים. הדוגמה הבאה ניתנת ריכוז siRNA סופי של 50 ננומטר צריך להיות מותאם עבור כל חלבון של עניין. בתוך צינור פלסטיק 1.5 מ"ל, פיפטה 50 μl 1 M CaCl 2 ו -11 μl 20 מיקרומטר siRNA לתוך 139 μl סטרילי H 2 O ומערבבים ידי vortexing. אחרי סיבוב מהיר, להוסיף בזהירות טיפה חכם 200 μl HBS2x (280 mM NaCl, 50 HEPES מ"מ, 1.5 מ"מ Na 2 4 HPO, pH 7.01-7.05).
    הערה: קטנות הטיפין הקטנות הם משקעים, וכתוצאה מכך יעיל transfection טוב יותר. לערבב בעדינות שלוש פעמים על ידי הזרקת אוויר באמצעות μl-פיפטה 200.
  10. דגירת התמהיל למשך 30 דקות ב RT. הוסף לאט נפתח חכם 200 μl של תערובת transfection לכל צלחתלהתסיס צולבות חכמות. מעבירים את הצלחות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 16 שעות.
  11. למחרת, לשטוף תאים פעמיים עם 2 מ"ל HEPES חם (6.7 KCl מ"מ, 150 מ"מ NaCl, 10 HEPES מ"מ, pH 7.3) ומוסיפים 2 מ"ל αMEM-מינוס 10%. אין להמשיך עם יותר מארבעה צלחות תא בכל פעם מאז וריאציות הטמפרטורה משפיעות על האורך של מחזור התא.
  12. דמיין את יעילות הזיהום תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך בהגדלה של 20-40x (אוויר) ולרכוש שלוש תמונות נציג לכל מצב בשני ערוצים פלורסנט והעבירו לתיעוד. שבע שעות לאחר מכן, להוסיף thymidine 2 מ"מ ו דגירה במשך שעה 16 נוסף על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  13. למחרת, 48 שעות לאחר transfection siRNA ו הידבקות בווירוסים, לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל תמיסת מלח פוספט חיץ חם (PBS) ולשחרר במשך 7 שעות ב 2 מ"ל αMEM 10% w / o פנול אדום עבור הדמיה תא חי או עם פנול אדום עבור מיצוי חלבון.
  14. קציר תאים עבור כל תנאי 48 שעות שלאחר transfection להכנת תמציות חלבון וניתוח כתם המערבי כדי לקבוע את היעילות של מציאה ואת הביטוי של חלבון אנדוגני 15.
    הערה: השתמש נוגדנים נגד החלבון של עניין, כמו גם נוגדנים מתאימים לשמש שולט טעינה. היעילות של מציאה צריכה להיקבע על ידי טעינת כמויות ירידה של lysates תאים בלתי מבוקרים (טרנספקציה עם siRNA שליטה), כדי לספק עקומת טיטרציה (כלומר, 1, ½, ¼, ⅛).

4. התמרה Adenovirus וחלבון אנדוגני מציאה ידי siRNA Transfection בתאי הלה שימוש מגיב transfection ליפידים קטיוני

הערה: כאן אנו מציגים פרוטוקול הותאם ניסויים שאינם כרוכים סנכרון תא ו / או כאשר transfection siRNA לא יכול להתבצע על ידי שיטת קאפי, למשל, כדי למנוע השפעות רעילות רצויות באיזה תא ליןes. פרוטוקול זה כולל גם צעד replating תא לאחר adenofection כדי לעבוד על צפיפות תאים מתאימה. בדקנו רק את מגיב transfection שומנים קטיוני.

זהירות! עבודה עם וירוסים דורשת אמצעי זהירות מיוחדת וכן לסילוק נאות של כל החומר כי כבר במגע עם הנגיף.

  1. פלייט 1.75 x 10 5 תאים לכל צלחת 35 מ"מ 2.5 מ"ל αMEM 10% ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. צלחת אחת 35 מ"מ צלחת נוספת למספר תנאים, על מנת לספור את מספר הסלולרי לפני התמרה וירוס.
  2. לגדל תאים עד למחרת כדי להשיג צפיפות תאים של 50% לפחות. צפיפות תאים של פחות מ -50% תוצאות לירידה משמעותית של יעילות התמר וירוס, גדלה וריאציות של ביטוי חלבון לכל תא, וגדילה רעילה לתא.
  3. יום אחד לאחר ציפוי תא, לספור את מספר תאי מצלחת המצופית הנוספת. לשאובהמדיום ולשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל 0.05% טריפסין / EDTA. להוסיף שוב 1 מ"ל של 0.05% טריפסין / EDTA ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד שכל התאים מנותקים. תאים נפרדים גם בעזרת פיפטה 1 מ"ל ולספור את מספר התאים לכל מ"ל.
  4. לקבוע את כמות הנגיף צריך transduce ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 20-40 יחידות פלאק יוצרי (PFU) של החלבון של עניין (POI) לכל תא ו 0-20 PFU לכל תא של וקטור ריק (למשל, LacZ) כדי לקבל סכום כולל של 40 PFU לכל תא.
  5. הכן במנדף סטרילי צינור פלסטיק 1.5 מיליליטר עבור כל תנאים ולהוסיף 400 μl של αMEM החם 10%.
  6. להפשיר aliquot של וירוסים לאט על קרח, ואם יש צורך, לדלל את המניות וירוס כדי pipet נפח גדול מ -1 μl כדי למזער שגיאות pipetting.
  7. מוסיפים את כמות הנגיף מחושב לכל מצב לכל צינור פלסטיק 1.5 מ"ל המכיל 400 μl αMEM 10% ומערבבים בעדינות על ידי pipetting. ה מקוםדואר מניות וירוס מיד בחזרה ב -80 ° C כדי לשמור על פעילותה.
  8. לשאוב את המדיום מן התאים פיפטה בעדינות לתערובת וירוס טיפה חכמה. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו להתסיס את הצלחות בקפידה מתחת למכסה המנוע סטרילית כל 15 דקות במשך שעה 1 כדי גם לכסות את התאים עם דילול וירוס. באמצעות כמות קטנה של המדיום הופך לפשוט יותר את הקשר של הנגיף עם התאים.
  9. בינתיים מכינים את תערובת transfection siRNA בעקבות שיטת transfection. אם לא siRNA יש צורך, להחליף את כמות siRNA ידי בינוני ללא בסרום לבצע transfection ריק.
    1. הדוגמה הבאה ניתנת ריכוז siRNA סופי של 50 ננומטר צריך להיות מותאם עבור כל חלבון של עניין. עבור כל adenofection, להכין צינור פלסטיק אחד 1.5 מ"ל המכיל 416 ננומטר siRNA ב 150 בינוני μl ללא בסרום (למשל, 6.25 μl 20 מיקרומטר siRNA + 144 בינוני μl ללא נסיוב) ו containi צינור פלסטיק אחד 1.5 מ"לng 6.25 μl transfection השומנים קטיוני מגיב + 144 בינוני μl ללא בסרום.
    2. מערבבים את התוכן של כל צינור פלסטיק ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים עם טפטפת 200 μl. מערבבים את התוכן של שני צינורות ומערבבים ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים עם טפטפת 200 μl. דגירה במשך 5 דקות ב RT.
  10. לאחר דגירה בווירוס, פיפטה בעדינות 1.8 מ"ל αMEM 10% על כל צלחת להשיג בנפח כולל של 2.2 מ"ל ומיד להוסיף לאט נפתח חכם לערבב transfection siRNA על כל צלחת להתסיס צולבות חכם. מעבירים את הצלחות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות.
  11. למחרת, מחדש הצלחת על התאים מפני כל צלחת 35 מ"מ לארבע צלחות 35mm חדשות 2.5 מיליליטר αMEM 10% כל דגירה במשך 24 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  12. למחרת, 48 שעות לאחר transfection siRNA ו הידבקות בוירוסים, תאי קציר מצלחת אחד עבור כל תנאי להכנהתמציות חלבון וניתוח כתם המערבי כדי לקבוע את היעילות של מציאה ואת הביטוי של חלבון אנדוגני 15.
    הערה: עם הצלחות הנותרות, להמשיך עם קיבוע תא, באמצעות פרוטוקול הבחירה להכפיף את דגימות ניתוח immunofluorescence עם נוגדני עניין 14.

5. הדמיה של תא חי תאים mitotic וניתוח נתונים

  1. בצע ניסויים הדמיה תא לטווח קצר לחיות על התאים mitotic עם מיקרוסקופ הפוכה מצויד בתא humidified / 5% CO 2 / התרמו-מוסדר.
    הערה: במחקר זה, מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב (40X, 0.75 NA) שימש, המצויד EMCCD מקורר המצלמה תשלום מצמידים ב -50 ° C.
  2. לפני הרכישה, לוודא כי הקאמרי הגיעה לטמפרטורה המתאימה של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: פעולה זו עשויה להימשך מספר שעות בהתאם למערכת המיקרוסקופית.
  3. מניח את כלי התרבות ב micrתא oscope 1 hr לפני הרכישה כדי לאפשר שיווי משקל נאות של המדיום ולהימנע מוקד נסחף בשל שינויי טמפרטורה. לפקח על מצב mitotic של התאים. בנקודה זו, 10-15% של התאים צריכים להיות בשלבים המוקדמים של מיטוזה (prophase-prometaphase).
  4. במהלך זמן האיזון, להגדיר את פרמטרי הרכישה כפי שנקבעו בניסויים קודמים. בדרך כלל, זמן החשיפה בשני הערוצים (488 ו 594) של 0.2-3 שניות עם עוצמת הלייזר של 100% ורגישות של 121-130 הם פרמטרים מתאימים בידינו.
    הערה: בדיקות ראשית צריך להיעשות כדי לקבוע את עוצמת הלייזר מינימום ורכישת זמן / מרווח שתוצאתן רזולוציה מתאימה עם photobleaching מינימום הגורמת נזקים התא מדאיג התקדמות mitotic.
  5. בחר מספר שדות לכל תנאי על מנת לקבל מספר משמעותי של תאים לנתח מבלי לחרוג את מרווח הרכישה. באמצעות מערכת confocal דיסק מסתובבת, התקנה טיפוסית תהיה בclude ארבעה תנאים שונים, 7 תחומים לכל צלחת ו -2 ערוצי צבע (488 ו 594) עם מרווח 1.5-2 דקות על פני תקופה דקה 75.
  6. בחר תאים הנמצאים בכניסה mitotic, להגדיר מחדש את הפוקוס פעם בכל התחומים נבחרו ולהתחיל רכישת מהר ככל האפשר.
  7. לפקח על יציבות המערכת עבור נקודות זמן לפחות שלושה מחדש להגדיר את המיקוד במידת הצורך.
  8. לאחר הדמית תא חי לטווח הקצר הראשונה של 75 דקות, תחומים חדשים של תאי mitotic עשויים להיבחר לרכוש סט שני של סרטים כדי להגדיל את מספר תאים להיות מנותחים.
  9. לקבוע קריטריונים מוגדרים היטב לנתח את פנוטיפים mitotic של תאים, אשר יהיה תלוי סמנים ניאון בשימוש. פגמים מיטוזה עשויים לכלול ממושך הזמן המושקע מיטוזה (מ התמוטטות גרעינית עד anaphase), חוסר כרומוזום, נדנדת ציר, ואת קליפת blebbing 14.

6. LifeAct-TagGFP2 Adenovirus התמרה ב Differentiating C2C12 עכבר myoblasts

הערה: פרוטוקול adenofection תופס גם לגבי myoblasts שקשה להדביק עכבר C2C12 שעבר התמיינות.

  1. פלייט 2 x 10 5 C2C12 תאים בצלחות 35 מ"מ תרבות במדיום הגידול על פלסטיק או על מצע של בחירה.
    הערה: התמיינות תאים משופרת על מנות gelatine- או מצופה matrigel. תכנן צלחת אחת נוספת כדי לקבוע את המספר הסלולרי לפני תמרת וירוס.
  2. למחרת, תאים צריכים יגיעו ל -80% של confluency. להשרות התמיינות myoblast ידי שטיפת התאים פעמיים עם PBS חם והוספת 2 מ"ל של מדיום בידול (DM).
  3. למחרת, שכותרתו כשמש 1 (D1) של בידול, transduce מיוציטים עם אדנו LifeAct-TagGFP2 לדמיין את cytoskeleton אקטין בתאים חיים. ספירת התאים מהצלחת הנוספת כמתואר תחת 3.2. חישוב 5 PFU / תא של אדנו-LifeAct-TagGFP2 ו -45 PFU / תא AdLacZ בעקבות הבחינהple המתואר בטבלה 1. כמות וירוס הכולל הוא 50 PFU / תא. וירוסים שימשו כמתואר 14
  4. הכן במנדף סטרילי צינור פלסטיק 1.5 מיליליטר עבור כל תנאים ולהוסיף 400 μl של DM החם.
  5. להפשיר aliquot של וירוסים לאט על קרח, ואם יש צורך, לדלל את המניות וירוס כדי pipet נפח גדול מ -1 μl כדי למזער שגיאות pipetting.
  6. מוסיפים את הכמות המתאימה של חלקיקי הנגיף לכל מצב לכל צינור פלסטיק 1.5 מ"ל המכיל 400 μl DM ומערבבים בעדינות על ידי pipetting. מניח את מניות הווירוס מייד בחזרה ב -80 ° C כדי לשמור על פעילותה.
  7. לשאוב את המדיום מן כלי פיפטה בעדינות לתערובת וירוס טיפה חכמה. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו להתסיס את הצלחות בקפידה מתחת למכסה המנוע סטרילית כל 15 דקות עבור סכום כולל של 1 שעה כדי גם לכסות את התאים עם הנגיף.
  8. לאחר דגירה, פיפטה בעדינות 1.6 מ"ל DM על כל צלחת ולהמשיך את incubation עבור שעה 2 נוספת ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  9. בינתיים מכינים תערובת transfection ריק בעקבות שיטת transfection קאפי. חישוב 200 תערובת μl עבור כל תנאי. השתמש בדוגמה הבאה בנפח כולל של 400 תערובת μl.
    1. בתוך צינור פלסטיק 1.5 מ"ל, פיפטה 50 μl 1 M CaCl 2 אל 150 μl סטרילי H 2 O ומערבבים ידי vortexing. אחרי סיבוב מהיר, להוסיף בזהירות טיפה חכם 200 μl HBS2x (280 mM NaCl, 50 HEPES מ"מ, 1.5 מ"מ Na 2 4 HPO, pH 7.01-7.05). לערבב בעדינות על ידי הזרקת אוויר שלוש פעמים בעזרת פיפטה 200 μl.
  10. דגירת התמהיל למשך 30 דקות ב RT. להוסיף לאט נפתח חכם 200 μl של תמהיל transfection לכל צלחת להתסיס צולבות חכמות. מעבירים את הצלחות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 16 שעות.
  11. למחרת, לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל HEPES חם (6.7 KCl מ"מ, 150 מ"מ NaCl, 10 HEPES מ"מ, pH 7.3) ומוסיפים 2 מ"ל DM. דמיינו את infeיעילות ction תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך בהגדלה של 20-40X (אוויר) ולרכוש שלוש תמונות נציג לכל מצב בשני ערוצים פלורסנט והעבירו לתיעוד.
  12. בהתאם להגדרת הניסוי הרצוי, בצע בידול לתוך myotubes במשך כמה ימים. תאים יכולים להיות קבוע ובהמשך נתון ניתוח immunofluorescence או בדיקות הדמיה תא חי יכול להתבצע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Transfection של פלסמיד דנ"א BAG3-GFP באמצעות שומני קטיוני היה קשור ביטוי הטרוגנית בתאים הלה, כמה תאים מראים רמות לגילוי בקושי של החלבון ואחרים הנושאים רמות BAG3 גבוהות מאוד (איור 2 א). בתאים אלה, אובדן הומאוסטזיס חלבון שמעיד הצטברות של BAG3-GFP לתוך אגרגטים perinuclear (איור 2A, חיצים). לעומת זאת, התמר תא עם adenoviruses נושאת BAG3-GFP הציג ביטוי נמוך הומוגנית יותר ולוקליזציה מדויקת של BAG3-GFP (איור 2 ב, זיהום לבד). למרבה הפלא, תוספת של שומנים קטיוני במהלך התמרה אדנו (כלומר, transfection של חלקיקים אדנו) גדל באופן משמעותי BAG3-GFP ביטוי לכל תא בבית דומה משרד הפנים, בזמן שהוא מותר שמירה הביטוי הומוגנית ברוב המכריע של תאים (תרשים 2B, Adenofection).

ether.within-page = "1"> Adenofection מותר דלדול יעיל של BAG3 אנדוגני חידוש של חלבונים BAG3-GFP ברמות ליד אנדוגני, אם באמצעות קאפי משקעים או ותרכובות המבוססות liposome כדי להגביר את היעילות transfection-התמרה בתאים הלה. איור 3 מציג ניסוי טיפוסי עם BAG3 סוג בר (WT) -GFP או BAG3 (IPV) -GFP מוטציות נושאת גרסה כי לבטל מחייב לאחד ממרכיביו מלווה השותפים HSPB8 (איור 3 א, 3 ב). עולה בקנה אחד עם תפקיד BAG3 בייצוב HSPB8 7, השתקת BAG3 הביאו לירידה ~ 50% ברמות HSPB8, אשר שוחזר לרמות נורמליות על חידוש של BAG3 WT, אבל לא על ידי ביטוי של רמות דומות של מוטציה של BAG3 (IPV) -GFP או של GFP לבד. בתנאים אלה, חלבונים-GFP BAG3 היו נקודות כראוי בתוך ~ 75-90% של התאים, להיות מועשר על אזורי perinuclear-centrosomal (איור 3 ג, 3D). sugg זהadenofection ested ששמר את הדינמיקה של BAG3 ושל מתחם BAG3-HSPB8 בתאים.

HSPB8 ו BAG3 הם שהוגברו בעקבות לחץ proteotoxic שונים כי גם לטרוד 10 cytoskeletal פרוטוסטאזיס. לפיכך ביטוי יתר של המלוות פוטנציאלי עלול להפריע את מכלול פירוק של מבנים macromolecular שליטה morphodynamics הסלולר. על מנת להעריך את התפקיד של BAG3-HSPB8 בתנאים שאינם הדגיש, זה היה חשוב לוודא כי הומאוסטזיס החלבון היה מוטרד מינימאלי ידי הליך adenofection. לשם כך, ניטור וריאציות ברמות המלוות של משפחת חלבון הלם החום הוא אינדיקציה טובה של מצב של הומאוסטזיס חלבון. כפי שניתן לראות בתרשים 4, adenofection ידי קאפי או ליפוזום מבוסס שיטות לא להגדיל באופן משמעותי את רמות HSPB8 אנדוגני BAG3, או לזה של מערכת מלווה HSP70 / HSPA1 הגדולה. לעומת זאת, טיפוסיטיפולים proteotoxic כמו הלם חום או MG132, מעכב הפרוטאזום, הגדילו את רמות של חלבונים המלווה-cochaperone בתאים הלה.

לאחר מכן, אנו בקשנו לקבוע אם הליך adenofection בשילוב עם baculoviruses נהיגת ביטוי של בדיקות ניאון תקטין טובולין (BacMam-RFP יקטין GFP-αtubulin) היה מתאים מעקב דינמיקת תא mitotic. כפי שניתן לראות בתרשים 5, adenofection של תאים הלה עם שלט siRNA (siCTL) לא הפריעה הדינמיקה ציר mitotic (ירוק) או משך הזמן הממוצע ב מיטוזה (איור 5 א, confocal נציג רצפי זמן לשגות). חלקם של התאים האלה מוקרנים אירועי mitotic נורמלים היה עולה בקנה אחד עם הרמות של פגמי mitotic נצפו כלל בשורות תאי סרטן (~ 30% -40%, איור 5). לעומת זאת, תאים adenofected עם siRNA BAG3 ספציפיים בלבד (siBAG3) הציג עלייה ~ 2 של פי level פגמי פנוטיפי mitotic, אשר הוחזרו ליד הרמה בתאי שליטת BAG3-GFP (WT), אבל לא על ידי ה- GFP לבד. זה תוקף את התאמתו של adenofection עבור אנליזה פונקציונלית של ההשפעה BAG3 ואת המלוות שלה הכלולות על דינמיקת cytoskeletal המווסתים התקדמות תקינה של תאים פנימה וחוצה של מיטוזה, כפי שמוצג על ידי פוקס ואח '14.

כדי לאמת את הרבגוניות של שיטת adenofection, אז התאמנו הפרוטוקול לאפשר הדמיה של ה- F- יקטין במהלך ההתמיינות של מיוציטים העכבר C2C12, באמצעות אדנו-LifeAct-GFP הזמין המסחרי לתייג F- תקטין 16. תאי C2C12 היו מושרים להבדיל ליום אחד לפני Adenofection. באמצעות פרוטוקול adenofection מבוסס קאפי, סכומים נמוכים להפליא של Adenovirus-LifeAct-GFP הספיקו להביע את החללית ברמה שזוהתה בקלות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב חלק ניכר של differe מיוציטים ntiating (~ 3-5 PFU / התא; איור 6). זה היה בניגוד בולט הריבוי הגבוה מאוד של זיהום מהמדווח בספרות כדי transduce תאי העכבר C2C12 (לפי סדר 250-400 משרד פנים) 17-19. יתר על כן, על ידי ניטור תהליך ההתמיינות למשך 7 ימים, הקמנו כי myotube היווצרות לא נפגעה באופן משמעותי על ידי ההליך. זה הציע היתוך myocyte, תהליך הנשען על הדינמיקה אקטין מכוון היטב 20, לא מוטרד על ידי ביטוי של רמות נמוכות של LifeAct-GFP (איור 6, יום 6 ו יום 7). מאז בסמן פלורסנטי עדיין ניתן לאתר ימים רבים לאחר adenofection של תאי C2C12, אנו מאמינים כי שיטה זו תהיה מתאימה עבור ניתוחים תפקודיים של ההשפעה מלווה על דינמיקה יקטין בשלבים שונים של myogenesis C2C12.

שולחן 1

jove_content "FO: keep-together.within-page =". 1 "> בטבלה 1. חישוב אדנו משרד הפנים המוצג הוא דוגמה כיצד לחשב את מספר יחידות להרכיב פלאק אדנו (PFU) הדרושים זיהום של מספר מוגדר של תאים בהתחשב titers וירוס שונה.

איור 1
איור 1. תכנון של פרוטוקול adenofection טיפוסי. צעדים רצופים של ניסוי טיפוסי מוצגים עבור הפרוטוקול באמצעות משקעי קאפי (קו התחתון באפור) או בפרוטוקול באמצעות מגיב transfection שומנים קטיוני (מודגש בצהוב), כולל ציפוי תא, תמרה של adeno- ו baculoviruses, transfection של דופלקסים siRNA, וסנכרון תא עם בלוק thymidine כפול. קווי זמן בשעות לשני הפרוטוקולים מוצגים בצד ימין של הדמות.fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. הביטוי הומוגנית ויעיל של-GFP BAG3 באמצעות Adenofection. (א) נציג תמונות epifluorescence של תאים הלה שהיו טרנספקציה עם פלסמיד דנ"א-GFP BAG3, מראה אגרגטים perinuclear של החלבון ברמות ביטוי גבוה (המיועד על ידי חצים) וביטוי הטרוגניות בתוך אוכלוסיית תאים. כתמים מערביים להראות ביטוי גבוה יחסית BAG3-GFP לרמות BAG3 האנדוגניים אוכלוסיית התאים הכוללת, כלומר החלבון מבוטא ביתר בעיקר בתאים מסוימים. (ב) תמונות epifluorescence נציג של תאים הלה שהיו transduced בלבד או adenofected באמצעות כמויות גדלות והולכות של חלקיקי נגיף אד-BAG3-GFP. תמונותרכש היו באמצעות פרמטרים זהים עובדו באופן שווה עבור חיסור עוצם רקע; בר:. 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
מציאת איור 3. יעיל של BAG3 ואת החידוש של חלבוני BAG3-GFP ברמות אנדוגני הקרובים. (AB) תאי הלה מבטאי RFP-H2B (א) או תאי הלה הוריים (B) היו adenofected עם siRNAs הצביע adenoviruses רקומביננטי באמצעות קאפי שיטה (א) או ותרכובות המבוססות ליפוזום כמו מגיב transfection (B). תאים סונכרנו בשיטת בלוק thymidine הכפולה ותמציות תא כוללות הוכנו במהלך השלב השני של שחרור. Weste כתמים rn מראים רמות דלדול BAG3 (אנדוגני BAG3), רמות של חלבונים BAG3-GFP adenofected, ורמות אנדוגני של HSPB8; רמות GAPDH: טעינה מלאה. דלדול נאמד ב> 75% על ידי טעינת כמויות ירידה של תמציות מלאה (adenofected עם שליטה siRNA-siCtl ו BAG3-GFP WT, כלומר, ½, ¼). שים לב חלבונים BAG3-GFP הפרט הוכנסו בבית ליד רמת אנדוגני של BAG3 וכי BAG3-GFP סוג בר, אבל לא BAG3 (IPV) -GFP או GFP לבד, שוחזר רמות HSPB8 בתאים מדולדל BAG3. (CD) תמונות epifluorescence נציג של תאים הלה שהיו adenofected עם-GFP אד-BAG3 רקומביננטי הצביעו באמצעות קאפי או מגיב transfection השומנים קטיוני. ברים: 20 מיקרומטר. תוצאות נציג שמוצגות (א) ו- (ג) שונות מן פוקס et al., PLoS ז'נה. 2015 23 Oct; 11 (10): e1005582, doi: 10.1371 / journal.pgen.1005582 14.Iles / ftp_upload / 54,557 / 54557fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. Adenofection לא לגרום תגובת לחץ בתאים הלה כתמים מערביים של תמציות תא הכולל מוכנות מתאים הלה שליטה. (NT: הלא מטופלים) או תאי הלה transfected עם siRNA שליטה לבד (siCtl, לא אדנו), או adenofected עם siCtl ו Ad-GFP או באמצעות קאפי או מגיב transfection השומנים קטיוני, או מתאי הלה הגיש לטיפולים proteotoxic טיפוסי (HS: הלם החום ב -44 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות ואחריו 16 התאוששות שעות ב 37 מעלות צלזיוס; מעכבי פרוטאזום, 5 מיקרומטר במשך 16 שעות), מראה את רמות BAG3, HSPB8 ושל המלוות מתח מושרה אחרים, כלומר HSP70 / HSPA / ו HSP27 / HSPB1;: MG132 GAPDH: טעינה מלאה. שימו לב ואילו הרמות של כל פרוחלבונים למעט GAPDH הוגדלו על טיפולי לחץ proteotoxic, הם נותרו ללא שינוי על ידי adenofection. רמת וריאציות חלבון הוערכו על ידי טעינת כמויות משתנות של תמציות תאי HS נושאות עליות טיפוסיות HSPs. (HS: 1, ½, ¼, ⅛; למשל, HSP70 הושר על ידי יותר מ -8 פי בתגובת proteotoxic מתח) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. התקדמות של הלה התאים דרך מיטוזה אינו מוטרד באופן משמעותי על ידי Adenofection. (א) רצפים זמן לשגות confocal נציג מתאי הלה שהיו adenofected עם שלט siRNA (siCtl) יחד עם BacMam- GFP-α-טובולין ו BacMam -RFP אקטין הדמיה ידי ספינינג microsco דיסק confocal פירו 60 עד 90 דקות במרווחים ~ 1.5 דק '. לבן כוכביות צהובות לייעד את המיקום של קטבים ציר כי נרשמו יציבות יחסית. בר: 10 מיקרומטר. כימות (B) של תאים adenofected עם siCtl או BAG3 ספציפי siRNA, עם או בלי חלבונים GFP המצוין (GFP לבד או BAG3-GFP סוג בר: WT). הגרף מצביע על אחוזי התאים עם מיטוזה נורמלי מוגדר נדנדה ציר התקועה מיטוזה +/- או חוסר כרומוזום. מוצגים הם אמצעי +/- SE. תוצאות נציג שמוצג (B) נלקחו פוקס et al., PLoS ז'נה. 2015 23 Oct; 11 (10): e1005582, doi: 10.1371 / journal.pgen.1005582 14. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. אנא לחץ כאן כדי להציג את הסרט הקשורים לוח (א).

class = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> איור 6
איור 6. Adenofection של מיוציטים C2C12 עם Ad-LifeAct-GFP והיווצרות myotube. תמונות epifluorescence נציג של תאים C2C12 שהיו המושרה להבדיל ומעובד adenofection 1 יום באמצעות מאוחר 5 PFU / תא של LifeAct-GFP ו -45 PFU / תא של LacZ. תמונות מראות ביטוי של סמן GFP במהלך תהליך ההתמיינות (יום 2, יום 6 ו יום 7). ברים:. 20 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן תארנו שיטה המאפשרת ניסויי דלדול-הצל להתבצע, אשר חלו על ניתוחים תפקודיים של תהליכים ביולוגיים סלולריים, כי הם רגישים במיוחד ביטוי יתר של חלבונים המשפיעים על והרכב ודינמיקה של קומפלקסי חלבונים ומבני macromolecular. חלוקת תא mitotic היא דוגמא קיצונית של morphodynamics תא מכוון היטב המערב את השינויים הדרמטיים ביותר ומרהיבים במבנה הכוללת של תא. שימוש adenofection בשילוב עם ריאגנטים BacMam זמינים מסחרית להציג סכומים נמוכים אך לגילוי של סמנים אקטין טובולין הדמיה תא, התרומה של BAG3-HSPB8 מורכב המלווה שיפוץ תא mitotic נכונה ניתן להראות בעליל. במחקר שנערך לאחרונה על ידי פוקס et al., הראינו דלדול של BAG3 גורם למומים באורינטצית ציר שקשור לחוסר יכולת להקים קליפה יקטין mitotic נוקשה ולהרכיב תקטין עשירסיבי הכחשה 14. דינמיקת ציר פרופר ניתן לשחזר על ידי חידוש של סוג בר BAG3-GFP, אשר גם תקן את הירידה לראות רמות HSPB8 על השתקת BAG3. משמעות הדבר היא כי adenofection מאפשרת שחזור של מתחם המלווה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית כי בקורלציה עם התאוששות תפקודית של הדינמיקה כישור.

שימוש adenofection לניסויים-הצלת דלדול מספק יתרון על פני transfection פלסמיד דנ"א או nucleofection, אשר עלול לגרום אינדוקציה חזקה של תגובת לחץ בסוגי תאים מסוימים (כלומר, autophagy) 21, מה שהופך אותו כמעט בלתי אפשרי לנתח את ההשפעה של מלווה נתון התפקיד הפיזיולוגי שלה. ואכן, ביד שלנו, transfection של DNA פלסמיד BAG3 קשורה ביטוי גבוה לכל תא, היווצרות המצרפי, ואת ההשפעות על התא אפופטוזיס / הישרדות סוגי תאים שונים (איור 2). BAG3 הוא cochaperone מודולרי עם פעילות פיגום, אשר מ 'איים לשחק תפקידים מרובים תלוי חלבוני שותפתה 9. לפיכך, הפרעות של stoichiometry מורכב על ביטוי יתר של BAG3 עשויות להיות השפעות שליליות דומיננטיות רצויות לגרום לרעילות. אדנו רקומביננטי קיבולת גבוהה הוא רכב אידיאלי עבור משלוח החולף ובטיחות של גנים גדולים בשני חלוקה ולא חלוקת תאים בתרבית כפי שהוא אינו להשתלב בגנום מארח תאים, בניגוד וקטורים מבוסס lentivirus עבורו כמה בטיחות חששות עדיין נשארים. חסרון פוטנציאלי של שימוש adenoviruses לניסויי דלדול-הצלה הוא שהם דורשים הכנה חוזרת ונשנים, אשר עשוי להימשך זמן רב. הם מסתמכים גם על טיטרציה זהירה של חלקיקים זיהומיות עבור יעילות התמרה לשחזור.

שימוש adenofection להקרין את התרומה של תחומים פונקציונליים הידוע BAG3, השגנו את העדות הראשונה, למיטב ידיעתנו, על קיום פונקצית BAG3 HSPB8 תלוי הפעולה הרגילהשל חלוקת תאים שאינו דורשים אינטראקציה עם מערכת מלווה HSP70 / HSPA1. Adenofection צריך להיות רלוונטי כדי לעקוב F- אקטין במהלך תהליך של התמיינות myocyte לתוך myotubes, כפי שהוצע על ידי בנתונים המוצגים כאן. לכן השיטה שלנו מספקת פרוטוקול צדדי ויעיל עבור ניסויי הצלה-דלדול מבוסס siRNA עם השפעה מינימאלית על morphodynamics התא צריך להיות שימושי במגוון רחב של פרויקטים בם ניתוח מבנה-תפקוד של גן של עניין הוא להיות נרדף.

ניצול תרכובות שומנים קטיוני על מנת להשיג-התמר transfection יעילה של תאים עם הסכום הנמוך ביותר של חלקיקי נגיף הוא המפתח לשיטה הזאת. למרות שזה מספק חלון גדול יותר לשליטת הרמות של חלבונים אקסוגני לכל תא, אנו מאמינים כי זה עוד יותר מאפשר מזעור תופעות לוואי אפשריות על מסלולי העברת אותות שנובעות תא אדנו מחייב כניסה, שאמור להקטין את ההשפעה של aprotein ריבית על מסלולים המוךפו"גנטי שהולכים.

יצוין כי חומרים כימיים שונים כדי להגביר את היעילות התמרו אדנו זמינים מסחרי, כגון מאיץ קולטן CAR. ריאגנטים כאלה הם יקרים, עם זאת, וצפויים לקדם וירוס כניסה מחייבת לתאים באופן מחייב הקולטן CAR, שכאמור הוכח להפעיל מסלולי איתות הקשורים צורת תא הידבקות. בעוד קאפי הוא זול יותר מאשר ליפוזומים קטיוני כאמצעי להגביר כניסת אדנו באמצעות מסלול CAR-עצמאי, היא גם יותר רעילה שורות תאים מסוימות. אנו ממליצים בדיקות מראש של adenofection ריק כדי לכוון את הבחירה בין קאפי vs מגיב שומנים קטיוני, בהתאם לקו התא משומש את ההודעה הביולוגית של עניין.

יחד עם כלים ביוטכנולוגיים חדשים של עריכת הגנום, RNA התערבות מבוססת גישות מציאה-הצלה, כגון זה המתואר כאן מציעות array של כלים מולקולריים חזקים לחשוף פונקצית גנים בתאים, אשר כעת ניתן לבחור באופן אופטימלי על ידי חוקרים בהתאם יישומים ספציפיים 3. אנו מאמינים כי adenofection מספק מערכת מהירה יחסית ופשוטה ליצור knockdowns hypomorphic עבור מבנה-תפקוד המנתח של התרומה של חלבון של עניין רקע תאי רב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C2C12 Mouse Myoblasts ATCC CRL-1772
Adenovirus custom design Welgen Custom design
Calcium Chloride Fisher Scientific C79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0 Thermo Fisher C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0 Thermo Fisher C10614
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose Thermo Fisher 11965-092
EDTA Sigma E5134
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher 12483-020
Fibronectin Sigma F1141
Glass bottom dishes, 35 mm MatTek Corperation P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada Klebig C et al. 2009
HEPES Fisher Scientific BP310-1
Horse Serum, New Zealand Thermo Fisher 16050-122
KCl Fisher Scientific BP366-500
L-Glutamine Thermo Fisher 25030081
Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent Thermo Fisher 13778-150
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha Wisent 310-101-CL
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides Thermo Fisher 12000-022
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red Thermo Fisher 41061-029
Na2HPO4 Biobasic S0404
NaCl Fisher Scientific BP358-10
OptiMEM Thermo Fisher 11058-021
rAVCMV-LifeAct-TagGFP2 IBIDI 60121
siRNA duplexes Dharmacon Custom design
Thymidine Sigma T9250
Trypsine 2.5% Thermo Fisher 15090-046

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
  2. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  3. Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).
  4. Natarajan, K., Rajala, M. S., Chodosh, J. Corneal IL-8 expression following adenovirus infection is mediated by c-Src activation in human corneal fibroblasts. J Immunol. 170 (12), 6234-6243 (2003).
  5. Yousuf, M. A., et al. Caveolin-1 associated adenovirus entry into human corneal cells. PLoS One. 8 (10), e77462 (2013).
  6. Morton, P. E., Hicks, A., Nastos, T., Santis, G., Parsons, M. CAR regulates epithelial cell junction stability through control of E-cadherin trafficking. Sci Rep. 3, 2889 (2013).
  7. Carra, S., Seguin, S. J., Lambert, H., Landry, J. HspB8 chaperone activity toward poly(Q)-containing proteins depends on its association with Bag3, a stimulator of macroautophagy. J Biol Chem. 283 (3), 1437-1444 (2008).
  8. Fuchs, M., et al. Identification of the key structural motifs involved in HspB8/HspB6-Bag3 interaction. Biochem J. 425 (1), 245-255 (2010).
  9. Rosati, A., Graziano, V., De Laurenzi, V., Pascale, M., Turco, M. C. BAG3: a multifaceted protein that regulates major cell pathways. Cell Death Dis. 2, e141 (2011).
  10. Guilbert, S. M., et al. The Big Book of Small Heat Shock Proteins. Tanguay, R. M., Hightower, L. E. , Springer International Publishing AG. 435-456 (2015).
  11. Fasbender, A., et al. Complexes of adenovirus with polycationic polymers and cationic lipids increase the efficiency of gene transfer in vitro and in vivo. J Biol Chem. 272 (10), 6479-6489 (1997).
  12. Toyoda, K., et al. Cationic polymer and lipids enhance adenovirus-mediated gene transfer to rabbit carotid artery. Stroke. 29 (10), 2181-2188 (1998).
  13. Fasbender, A., et al. Incorporation of adenovirus in calcium phosphate precipitates enhances gene transfer to airway epithelia in vitro and in vivo. J Clin Invest. 102 (1), 184-193 (1998).
  14. Fuchs, M., et al. A Role for the Chaperone Complex BAG3-HSPB8 in Actin Dynamics, Spindle Orientation and Proper Chromosome Segregation during Mitosis. PLoS Genetics. 11 (10), e1005582 (2015).
  15. Champagne, C., Landry, M. C., Gingras, M. C., Lavoie, J. N. Activation of adenovirus type 2 early region 4 ORF4 cytoplasmic death function by direct binding to Src kinase domain. J Biol Chem. 279 (24), 25905-25915 (2004).
  16. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  17. Takahashi, A., et al. Myogenic Akt signaling regulates blood vessel recruitment during myofiber growth. Mol Cell Biol. 22 (13), 4803-4814 (2002).
  18. Murray, T. V., et al. A non-apoptotic role for caspase-9 in muscle differentiation. J Cell Sci. 121 (Pt 22), 3786-3793 (2008).
  19. Terada, K., Misao, S., Katase, N., Nishimatsu, S., Nohno, T. Interaction of Wnt Signaling with BMP/Smad Signaling during the Transition from Cell Proliferation to Myogenic Differentiation in Mouse Myoblast-Derived Cells). Int J Cell Biol. 2013, 616294 (2013).
  20. Hindi, S. M., Tajrishi, M. M., Kumar, A. Signaling mechanisms in mammalian myoblast fusion. Sci Signal. 6 (272), re2 (2013).
  21. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 115 Adenovirus התמרו תא התערבות RNA transfection תא הדמיה לחיות תאים דינמיקת cytoskeletal LifeAct-GFP טובולין-RFP מיטוזה התמיינות תאי שריר תאי הלה תאי C2C12
Adenofection: שיטה בחקר התפקיד של מלוויהם מולקולריים הסלולרית Morphodynamics ידי ניסויי דלדול-הצלה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fuchs, M., Boulanger, M. C.,… More

Fuchs, M., Boulanger, M. C., Lambert, H., Landry, J., Lavoie, J. N. Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments. J. Vis. Exp. (115), e54557, doi:10.3791/54557 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter