Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

في نقل فيفو جين لخلايا شوان في العصب القوارض وركي من Electroporation لل

Published: September 8, 2016 doi: 10.3791/54567
Automatic Translation
1,2, 1
1Department of Pharmacology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 2Laboratory for Cell Polarity Regulation, Quantitative Biology Center, RIKEN

Protocol

وكان استخدام الفئران للبحث في فقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة رعاية الحيوان في جامعة طوكيو.

1.Preparation DNA البلازميد

  1. توليد البلازميدات الحمض النووي في الجسم الحي Electroporation للعن طريق استنساخ فرعي [كدنا] أو تسلسل shRNA إلى التعبير البلازميد لخلايا الثدييات 12. استخدام الفيروس المضخم للخلايا فوري في وقت مبكر محسن والدجاج β-أكتين المروج الانصهار (CAG) يحركها المروج البلازميد 13 لأنه يسمح تعبير قوي ومستقر. للتعبير عن shRNAs تحت سيطرة أحد المروجين CAG، استخدام نظام الكاسيت shRNA القائم على mir30 لاستنساخ فرعي لshRNA 14.
  2. تنقية DNA البلازميد مع مجموعة ماكسي الإعدادية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، و resuspend الحمض النووي مع مخزنة المالحة HEPES (140 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.75 ملي نا 2 هبو 4، 25 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.40). ضبط تركيز الحمض النووي ل≥4 ميكروغرام / ميكرولتر.
    3. ملاحظة: يجب تحديد تكوين الأمثل من السلطات الوطنية المعينة بلازميد وفقا للكفاءة ترنسفكأيشن من كل البلازميد.

2. تعقيم الأدوات الجراحية والمالحة

  1. الأدوات الجراحية الأوتوكلاف وحل كلوريد الصوديوم 0.9٪.

3. إعداد من micropipette الزجاج

  1. سحب الماصات الزجاج باستخدام مجتذب ماصة. قطع غيض من ماصة ليبلغ قطرها 30-50 ميكرون. استخدام المعلمات التالية: الحرارة، 600؛ سرعة، 50؛ الوقت، 75.

4. جراحة الحيوان، حقن الحمض النووي و Electroporation

ملاحظة: هناك أكثر منيوصف ضوء هذه الخطوة في الشكل 1. وعلى الرغم من وصف إجراءات الفئران الوليدة هنا، الأسلوب ينطبق أيضا على الحيوانات أكثر نضجا باستخدام نفس الإجراء.

  1. تخدير الفئران مع isoflurane في مربع الاستقراء حتى يصبح حيوان متحرك عن طريق ضبط تدفق الأوكسجين إلى 0.4 لتر / دقيقة وتركيز الأيزوفلورين إلى 4٪ (المجلد / المجلد). أداء أخمص القدمين معسر لتأكيد التخدير المناسب.
  2. وضع الفئران على أكثر دفئا مسخن تحت المجهر مجهر، والحفاظ على التخدير عن طريق إعطاء باستمرار الأيزوفلورين من خلال القناع عن وجهه. ضبط تدفق الأوكسجين إلى 0.2 لتر / دقيقة وتركيز الأيزوفلورين إلى 2٪ (المجلد / المجلد). استخدام قطرات العين لمنع جفاف العين إذا أعين الحيوان مفتوحة.
  3. إصلاح الساقين مع الشريط الجراحية.
  4. تنظيف الجلد على الفخذ الخلفي مع بوفيدون اليود، وإجراء شق مع مشرط.
    ملاحظة: حلاقة المناطق الجراحية إذا تم تغطية المناطق الجراحية مع حالهواء.
  5. فضح العصب الوركي عن طريق إنشاء الافتتاحية بين عضلات الفخذ الفخذية والعضلة ذات الرأسين الفخذية مع الإبر الخياطة.
  6. الرطب العصب مع 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم. تمتص الماء الزائد مع ورقة خالية من الوبر.
  7. إدراج قاعدة من micropipette الزجاج على أنابيب مرنة، وملء كمية كافية من محلول الحمض النووي (ميكروليتر واحد على الأقل) في micropipette بواسطة الشفط بلطف.
  8. رفع العصب تتعرض عن طريق سحب بلطف الجانب البعيد من العصب باستخدام إبرة.
    ملاحظة: لا تطبيق التوتر في العصب لتقليل إجهاد ميكانيكي.
  9. إدراج micropipette الزجاج في الموقع البعيد عن العصبية، وحقن محلول الحمض النووي عن طريق ممارسة الضغط (أي عن طريق النفخ في نهاية مفتوحة للأنبوب مرن). حقن محلول الحمض النووي حتى يظهر العصب الخضراء (1 ميكرولتر كحد أقصى). لأن الإدراج المتكرر من micropipette يمكن ان يسبب تلفا في العصب، لا إدراج micropipette أكثر من مرتين.
  10. وضع TWEعازر من نوع البلاتين الكهربائي حوالي 1-2 ملم بعيدا عن العصبية. سد الفجوة بين القطب والعصب مع 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم.
    ملاحظة: لا تضع العصبية مع القطب لتجنب إجهاد على العصب.
  11. تطبيق نبضات كهربائية إلى موقع الحقن باستخدام electroporator مع القطب. بعد مجموعة نبض الأولى، عكس القطب وتطبيق مجموعة نبض آخر. استخدام المعلمات التالية: الجهد، 50 V، مدة النبضة، 5 ميللي ثانية. فترة النبض، 100 مللي ثانية. عدد النبض، 4 مرات.
  12. تنظيف الموقع Electroporation للمع 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم.
  13. كرر الخطوات من 4،4-4،11 على العصب الوركي المقابل.

5. بعد Electroporation لل

  1. إغلاق الشقوق مع الغراء cyanoacrylate.
  2. بعد تجفيف الغراء، وتنظيف الجرح مع بوفيدون اليود.
  3. الافراج عن الجرو من قناع الوجه. تدفئة الجرو على دفئا على الأقل لمدة ساعة من أجل السماح لها أن يتعافى تماما من التخدير. دo لن يترك الجرو غير المراقب حتى استعاد وعيه كافية.
  4. بعد الشفاء من التخدير، والعودة الجرو على الفئران الأم. لا عودة الجرو حتى تعافى تماما.

6. ما بعد الجراحة

  1. بيت الفئران الوليدة في القفص حتى إجراء التجارب 11 (انظر الأمثلة في الشكل 3). إدارة كاربروفين (5 ملغ / كغ، والملكية الفكرية)، والأدوية غير الستيرويدية المضادة للالتهابات، أو البوبرينورفين (0.1 ملغم / كغم، SC)، وهو مسكن أفيوني، إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: إذا لم الجرو الفئران تنمو بشكل جيد أو لوحظ التهاب حول موقع الجراحة، واستبعاد الحيوان من التجارب.

Representative Results

ويرد مثال على العصب الوركي transfected مع أحمر ببروتين (RFP) -expressing البلازميد في الشكل 2A. خلايا تظهر التشكل الثنائي القطب، وسمة من سمات المنبوذة، و transfected قليلة مع طلب تقديم العروض. تم الكشف عن أي مضان RFP في محاور عصبية. نجد عادة ~ 100 المنبوذة transfected في كل عصب. هذه الكفاءة ترنسفكأيشن يبدو مشابهة لفي الجسم الحي SC كفاءة العدوى باستخدام ناقلات lentiviral 4.

وأظهرت التجارب المناعية أن معظم (~ 96٪) خلايا طلب تقديم العروض الايجابية في P7 المشترك المسمى لS100، علامة SC (الشكل 2B)، و 91٪ من الخلايا طلب تقديم العروض الايجابية في P14 شارك المسمى لم ب ب، علامة myelinating SC (الشكل 2C)، مما يشير إلى أن نقل الجينات من Electroporation للانتقائية للغاية لmyelinating المنبوذة.

إدخال جينات متعددة في المنبوذة لفي الجسم الحي طريقة Electroporation للالموصوفة هنا هي القدرة على نقل جينات متعددة مع إجراء بسيط. ويبين الشكل 2D صورة تمثل العصب الوركي transfected مع خليط من GFP والبلازميدات، معربا عن طلب تقديم العروض باستخدام electroporation في الجسم الحي. وكانت حوالي 97٪ من الطوائف المنبوذة GFP وطلب تقديم العروض الايجابية مزدوجة، مما يشير إلى أن تسليم كفاءة عالية من جينات متعددة يمكن أن يتحقق ببساطة عن طريق electroporating خليط من البلازميدات متعددة.

في القوارض، تكون الميالين يبادر حول الولادة، وزيادة بشكل كبير خلال الأسبوعين الأولين بعد الولادة، ومن ثم يقلل تدريجيا. وهكذا، عن طريق التلاعب وراثيا المنبوذة خلال هذه النوافذ وقت التنموية، والآليات الكامنة وراء هذه المراحل المختلفة لتكون الميالين يمكن توضيحها. ناقلات lentiviral هي أداة جيدة لnalyzing تكون الميالين، وبخاصة لديهم الحد الأدنى من سمية، ولكن lentiviruses فقط تصيب الأطفال حديثي الولادة الأعصاب الوركي 5،6. في المقابل، نقل الجينات بوساطة Electroporation لليعمل بشكل جيد عندما يتم إجراء ترنسفكأيشن على P3 (الشكل 2E، أعلى) أو على P14 (الشكل 2E، أسفل).

وتوصف التطبيقات من الرواية في طريقة Electroporation للفيفو هنا. ويبين الشكل 3A الصور المجهرية الخفيفة من GFP، معربا عن المنبوذة myelinating في مراحل النمو المختلفة (P7، P14، P21 و P31). عن طريق التحليل المجهري للضوء، والتغيرات في المعايير الشكلية، مثل الطول والقطر، ويمكن تقييم. لاحظ أن هذه الثوابت والقيم مماثلة مقارنة الأعصاب الطرفية الفئران سليمة 15،16، مما يشير إلى أن الأعصاب electroporated تتطور دون آثار ضارة كبيرة. ويبين الشكل 3B الإلكترون صورة مجهرية من LacZ-expressing myelinating المنبوذة. في هذه الحالة، كان يستخدم LacZ باعتباره علامة التعبير. β غالاكتوزيداز تلطيخ باستخدام bluo غال، وهو الركيزة الإيثانول غير قابلة للذوبان، يمكن تحليل تكوين المايلين من المنبوذة transfected بواسطة المجهر الإلكتروني 11،17. في هذه التجارب، ودور الجزيئات يشير يمكن فحص من قبل إسكات أو زيادة التعبير عنها، مما يسمح للتحليل الخسارة من وظيفة أو آثار كسب من وظيفة. بالإضافة إلى تحليل الأنسجة الثابتة، ويمكن تطبيقها في الجسم الحي نقل الجينات بوساطة Electroporation للأيضا أن يعيش تجارب التصوير. على سبيل المثال، الشكل 3C يظهر SC myelinating المشترك، معربا عن G-GECO1.1 18، أخضر فلوري عصاري خلوي كا 2+ المؤشر، وR-GECO1mt 19، أحمر فلوري الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ المؤشر. بالإعراب عن هذه المؤشرات، حددنا مسار الإشارات التي تسيطر عصاري خلوي والميتوكوندريا الكالسيوم 2+ التركيزات في myelinating المنبوذة . وبالتالي، يمكن استخدام الأسلوب الحالي لدراسة مجموعة متنوعة من آليات يشير، لا سيما عندما تكون تحقيقات الفلورسنت المشفرة وراثيا المتاحة للكشف عن الإشارات المثيرة للاهتمام.

شكل 1
يتعرض التخطيطي للالجسم الحي Electroporation للطريقة الأولى، العصب الوركي من الفئران تخدير ط ن: الشكل 1. ثانيا، يتم حقن الحمض النووي البلازميد في العصب الوركي. يتم تسليم الثالثة، نبضات كهربائية إلى موقع الحقن من خلال القطب على شكل ملقط. وأخيرا، يتم إغلاق الجرح مع الغراء. ويمكن تكرار هذا الإجراء على العصب المقابل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

"> الشكل 2
الشكل 2: ممثل النتائج على الأعصاب الوركي Transfected (A) صورة تمثيلية من العصب الوركي transfected. وقد transfected العصب مع البلازميد، معربا عن طلب تقديم العروض في P3، وثابتة في P7. (ب) صورة تمثيلية من خلية transfected طلب تقديم العروض في P7 تظهر colocalization مع S100، علامة SC. (C) صورة تمثيلية من العصب الوركي-transfected طلب تقديم العروض في P14 تظهر colocalization مع م ب ب، علامة myelinating SC. (D) صورة تمثيلية من العصب الوركي cotransfected مع GFP والبلازميدات، معربا عن طلب تقديم العروض. أعرب المنبوذة Transfected في وقت واحد GFP وطلب تقديم العروض. (E) صورة من myelinating المنبوذة في P31 transfected في P3، عندما يبدأ تكون الميالين (أعلى)، وصورة من المنبوذة myelinating في P31 P14 transfected في، عندما تصبح محاور معظم كبيرة العصبي (القاع)، مما يوحي بأن transfection من المنبوذة myelinating يمكن أن يتحقق ليس فقط في أعصاب الأطفال حديثي الولادة، ولكن أيضا في الأعصاب أكثر نضجا. الحانات النطاق = 200 ميكرون (A)؛ 50 ميكرون (BE). تم تعديل هذا الرقم من نشر رسائلنا السابقة (11). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): تطبيق في الجسم الحي Electroporation لل(A) والتحليل المجهري ضوء تطور myelinating المنبوذة. تم electroporated الأعصاب الوركي مع البلازميد، معربا عن GFP في P3، وكانت ثابتة في مراحل النمو المختلفة (P7، P14، P21 و P31). وتظهر الصور التمثيلية للالمنبوذة GFP إيجابية على اليسار. وتتلخص متوسط ​​الطول والقطر كما يعني ± SEM (ن = 30-47 من 3 الأعصاب) على اليمين. طول وقطر myelinating زيادات المنبوذة مع استمرار التطور. (ب) الإلكترون صورة مجهرية من العصب الوركي transfected مع LacZ ترميز البلازميد. وtransfected SC (النجمة البيضاء، اليسرى) وصفت بدقة مع رواسب من ناتج التفاعل β غالاكتوزيداز. (ج) صورة من SC cotransfected مع G-GECO1.1، أخضر فلوري عصاري خلوي كا 2+ المؤشر، وR-GECO1mt، أحمر فلوري الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ المؤشر. وتظهر المناطق داخل المستطيلات منقط أبيض الموسع في لوحات على اليمين. الحانات النطاق = 50 ميكرون (A و C)؛ 1 ميكرون (B). تم تعديل هذا الرقم من نشر رسائلنا السابقة (11). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Genopure Plasmid Maxi Kit Roche 03 143 422 001 Plasmid DNA purification kit
Fast Green CFC WAKO 069-00032 Dye for DNA injection
GC 150T-10 HARVARD APPARATUS 30-0062 Glass capillary
Suction tubing Drummond 05-2000-00 Suction tubing for micro injection
MODEL P-97 SUTTER INSTRUMENT CO. Micropipette puller
CUY21 Single Cell BEX Electroporator CUY21 Single Cell Pulse generator
Electric warmer KODEN CAH-6A Warmer during the surgery
Isofluolane Mylan 1119701G1076 Anesthetic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nave, K. A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 503-533 (2014).
  2. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
  3. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9, 1956-1968 (2014).
  4. Cotter, L., et al. Dlg1-PTEN interaction regulates myelin thickness to prevent damaging peripheral nerve overmyelination. Science. 328, 1415-1418 (2010).
  5. Gonzalez, S., Fernando, R. N., Perrin-Tricaud, C., Tricaud, N. In vivo introduction of transgenes into mouse sciatic nerve cells in situ using viral vectors. Nat Protoc. 9, 1160-1169 (2014).
  6. Ozcelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30, 4120-4131 (2010).
  7. Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
  8. Glatzel, M., et al. Adenoviral and adeno-associated viral transfer of genes to the peripheral nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 442-447 (2000).
  9. Homs, J., et al. Schwann cell targeting via intrasciatic injection of AAV8 as gene therapy strategy for peripheral nerve regeneration. Gene Ther. 18, 622-630 (2011).
  10. Aspalter, M., et al. Modification of Schwann cell gene expression by electroporation in vivo. J Neurosci Methods. 176, 96-103 (2009).
  11. Ino, D., et al. Neuronal Regulation of Schwann Cell Mitochondrial Ca(2+) Signaling during Myelination. Cell Rep. 12, 1951-1959 (2015).
  12. Struhl, K. Chapter 3; Subcloning of DNA fragments. Curr Protoc Mol Biol. , Unit3 16 (2001).
  13. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  14. Chang, K., Elledge, S. J., Hannon, G. J. Lessons from Nature: microRNA-based shRNA libraries. Nat Methods. 3, 707-714 (2006).
  15. Schlaepfer, W. W., Myers, F. K. Relationship of myelin internode elongation and growth in the rat sural nerve. J Comp Neurol. 147, 255-266 (1973).
  16. Webster, H. D. The geometry of peripheral myelin sheaths during their formation and growth in rat sciatic nerves. J Cell Biol. 48, 348-367 (1971).
  17. Weis, J., Fine, S. M., David, C., Savarirayan, S., Sanes, J. R. Integration site-dependent expression of a transgene reveals specialized features of cells associated with neuromuscular junctions. J Cell Biol. 113, 1385-1397 (1991).
  18. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators. Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).
  19. Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
  20. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50, 507-511 (2008).
  21. Taveggia, C., Feltri, M. L., Wrabetz, L. Signals to promote myelin formation and repair. Nat Rev Neurol. 6, 276-287 (2010).
  22. Saijilafu,, Hur, E. M., Zhou, F. Q. Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat Commun. 2, 543 (2011).
  23. Tanaka, Y., Hirokawa, N. Mouse models of Charcot-Marie-Tooth disease. Trends Genet. 18, S39-S44 (2002).

Tags

علم الأعصاب، العدد 115، خلايا شوان، العصب الوركي، المايلين، والتنمية،
<em>في</em> نقل <em>فيفو</em> جين لخلايا شوان في العصب القوارض وركي من Electroporation لل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ino, D., Iino, M. In Vivo… More

Ino, D., Iino, M. In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation. J. Vis. Exp. (115), e54567, doi:10.3791/54567 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter