Neuroscience

Electroporation द्वारा कृंतक Sciatic तंत्रिका में श्वान कोशिकाओं को विवो जीन स्थानांतरण में

Published: September 8, 2016 doi: 10.3791/54567

¹Department of Pharmacology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, ²Laboratory for Cell Polarity Regulation, Quantitative Biology Center, RIKEN

Protocol

शोध के लिए चूहों के उपयोग के टोक्यो विश्वविद्यालय के पशु कल्याण समिति द्वारा स्थापित दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया था।

प्लास्मिड डीएनए की 1.Preparation

स्तनधारी कोशिकाओं ^{12 के} लिए एक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में सीडीएनए या shRNA अनुक्रम subcloning द्वारा इन विवो electroporation के लिए डीएनए plasmids उत्पन्न करता है। एक cytomegalovirus तत्काल जल्दी बढ़ाने और चिकन β-actin प्रमोटर संलयन (सीएजी) प्रमोटर संचालित प्लाज्मिड ¹³ का प्रयोग करें, क्योंकि यह मजबूत और स्थिर अभिव्यक्ति की अनुमति देता है। सीएजी प्रमोटर के नियंत्रण के तहत shRNAs की अभिव्यक्ति के लिए, shRNA ¹⁴ subcloning के लिए एक mir30 आधारित shRNA कैसेट प्रणाली का उपयोग करें।
निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक मैक्सी प्रस्तुत करने का किट के साथ प्लाज्मिड डीएनए शुद्ध, और HEPES बफर खारा (140 मिमी NaCl, 0.75 मिमी ना ₂ HPO _4, 25 मिमी HEPES, पीएच 7.40) के साथ डीएनए resuspend। माइक्रोग्राम / μl ≥ 4 के लिए डीएनए की एकाग्रता को समायोजित करें।

नोट: प्लाज्मिड DNAs का इष्टतम संरचना प्रत्येक प्लाज्मिड की अभिकर्मक दक्षता के अनुसार निर्धारित किया जाना चाहिए।

2. सर्जिकल उपकरण और खारा का बंध्याकरण

आटोक्लेव शल्य चिकित्सा उपकरण और 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान।

3. कांच micropipette की तैयारी

एक विंदुक खींचने का उपयोग कांच pipettes खींचो। 30-50 माइक्रोन की एक व्यास के लिए पिपेट की नोक कट। निम्नलिखित मानकों का प्रयोग करें: गर्मी, 600; वेग, 50; समय, 75।

4. पशु शल्य चिकित्सा, डीएनए इंजेक्शन और electroporation

नोट: एक के ऊपरइस कदम के मद्देनजर चित्र 1 में वर्णित है। हालांकि चूहे पिल्ले के लिए प्रक्रिया यहाँ वर्णित हैं, विधि भी उसी प्रक्रिया का उपयोग कर अधिक परिपक्व जानवरों के लिए लागू है।

प्रेरण बॉक्स में isoflurane के साथ चूहे anesthetize जब तक पशु 4% (/ खंड खंड) के लिए 0.4 एल / मिनट के लिए ऑक्सीजन का प्रवाह और isoflurane एकाग्रता का समायोजन करके स्थिर हो जाता है। उचित anesthetization पुष्टि करने के लिए बन्द रखो पैर की अंगुली प्रदर्शन करना।
एक दूरबीन खुर्दबीन के नीचे preheated गर्म पर चूहे रखो, और लगातार चेहरे नकाब के माध्यम से isoflurane प्रशासन द्वारा संज्ञाहरण बनाए रखें। 2% (/ खंड खंड) के लिए 0.2 एल / मिनट के लिए ऑक्सीजन का प्रवाह और isoflurane एकाग्रता को समायोजित करें। आंख का उपयोग आँखों का सूखापन को रोकने के लिए अगर पशु की आँखें खुली हैं चला जाता है।
सर्जिकल टेप के साथ पैरों को ठीक करें।
povidone आयोडीन के साथ पीछे जांघ पर त्वचा साफ है, और एक छुरी के साथ एक चीरा बनाते हैं।
नोट: सर्जिकल क्षेत्रों दाढ़ी यदि शल्य क्षेत्रों ज के साथ कवर कर रहे हैंवायु।
बनाने quadriceps के बीच एक खोलने पेशी ग्रीवा और मछलियां सिलाई सुई के साथ मांसपेशियों ग्रीवा द्वारा sciatic तंत्रिका बेनकाब।
0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान के साथ तंत्रिका गीले। एक प्रकार का वृक्ष मुक्त कागज के साथ अतिरिक्त पानी को अवशोषित।
लचीला ट्यूबिंग पर एक गिलास micropipette के आधार डालें, और धीरे श्वास द्वारा micropipette में डीएनए समाधान (कम से कम एक microliter) की पर्याप्त मात्रा में भरें।
धीरे तंत्रिका एक सुई का उपयोग कर के बाहर की ओर खींच कर सामने आ तंत्रिका लिफ्ट।
नोट: तंत्रिका तनाव लागू नहीं यांत्रिक तनाव कम करने के लिए।
तंत्रिका पर बाहर का साइट में कांच micropipette डालें, और लागू करने का दबाव द्वारा डीएनए समाधान इंजेक्षन (लचीला ट्यूब के खुले अंत में उड़ाने से अर्थात्)। जब तक तंत्रिका हरे (1 μl अधिकतम) प्रतीत होता है डीएनए समाधान इंजेक्षन। क्योंकि micropipette के लगातार प्रविष्टि तंत्रिका नुकसान पहुंचा सकता है, दो बार से अधिक micropipette न डालें।
एक TWE रखेंएसेर प्रकार प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के बारे में 1-2 मिमी तंत्रिका से अलग। इलेक्ट्रोड और 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान के साथ तंत्रिका के बीच की खाई को भरने।
नोट: इलेक्ट्रोड के साथ तंत्रिका पकड़ तंत्रिका पर यांत्रिक तनाव से बचने के लिए नहीं है।
इलेक्ट्रोड के साथ एक electroporator का उपयोग कर इंजेक्शन साइट के लिए बिजली दालों को लागू करें। पहले नब्ज सेट करने के बाद, इलेक्ट्रोड पलटना और एक अन्य पल्स सेट लागू होते हैं। निम्नलिखित मानकों का उपयोग करें: वोल्टेज, 50 वी; पल्स अवधि, 5 मिसे; पल्स अंतराल, 100 मिसे; पल्स संख्या, 4 बार।
0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान के साथ electroporation साइट को साफ करें।
दोहराएँ 4.4-4.11 contralateral sciatic तंत्रिका पर कदम।

5. बाद electroporation

cyanoacrylate गोंद के साथ चीरों बंद करें।
गोंद सूखने के बाद, povidone आयोडीन के साथ घाव को साफ।
चेहरे नकाब से पिल्ला रिलीज। आदेश में एक घंटे के लिए कम से कम एक गर्म पर पिल्ला गर्म यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से उबरने के लिए अनुमति देने के लिए। डीओ पिल्ला छोड़ पहुंच से बाहर नहीं है जब तक यह पर्याप्त होश आ गया है।
संज्ञाहरण से वसूली के बाद, मां चूहे को पिल्ला वापसी। पिल्ला वापस जब तक पूरी तरह से ठीक नहीं है।

6. पोस्ट सर्जरी

(चित्रा 3 में उदाहरण देखें) प्रयोगों ¹¹ का आयोजन जब तक पिंजरे में सदन चूहे पिल्ले। प्रशासन Carprofen (5 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी), एक गैर स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ दवा, या buprenorphine (0.1 मिलीग्राम / किग्रा, अनुसूचित जाति), एक opioid एनाल्जेसिक, अगर जरूरी है।
नोट: चूहा पिल्ला अच्छी तरह से विकसित नहीं है या सूजन सर्जरी साइट के आसपास मनाया जाता है, प्रयोगों से जानवर बाहर।

Representative Results

लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट एक sciatic तंत्रिका प्लाज्मिड -expressing का एक उदाहरण चित्रा 2A में दिखाया गया है। द्विध्रुवी आकृति विज्ञान दिखा कोशिकाओं, अनुसूचित जाति की एक विशेषता है, कम आरएफपी के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। कोई आरएफपी प्रतिदीप्ति एक्सोन में पाया गया था। हम आम तौर पर हर नस में 100 ट्रांसफ़ेक्ट अनुसूचित जाति लगाने ~। यह अभिकर्मक दक्षता lentiviral वैक्टर ⁴ का उपयोग कर इन विवो अनुसूचित जाति संक्रमण दक्षता के समान लगता है।

Immunostaining प्रयोगों से पता चला है कि ज्यादातर (~ 96%) S100, एक अनुसूचित जाति मार्कर (चित्रा 2 बी) के लिए P7 सह लेबल, और P14 पर आरएफपी पॉजिटिव कोशिकाओं के 91% MBP के लिए सह लेबल, एक myelinating अनुसूचित जाति मार्कर पर आरएफपी पॉजिटिव कोशिकाओं (चित्रा -2), सुझाव है कि electroporation द्वारा जीन स्थानांतरण अनुसूचित जाति myelinating के लिए अत्यधिक चयनात्मक है।

अनुसूचित जाति में कई जीनों का परिचय इन विवो electroporation यहाँ वर्णित विधि का एक प्रमुख लाभ क्षमता एक सरल प्रक्रिया के साथ कई जीन स्थानांतरण करने के लिए है। चित्रा 2 डी विवो electroporation में उपयोग करते हुए GFP और आरएफपी व्यक्त plasmids के एक मिश्रण के साथ ट्रांसफ़ेक्ट एक sciatic तंत्रिका के एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है। अनुसूचित जाति के बारे में 97% GFP और आरएफपी डबल सकारात्मक थे, सुझाव है कि कई जीनों की अत्यधिक कुशल वितरण बस कई plasmids के मिश्रण electroporating द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।

मूषक में, myelination जन्म के आसपास शुरू की, नाटकीय रूप से postnatally पहले दो हफ्तों के दौरान बढ़ रही है, और फिर धीरे-धीरे कम हो। इस प्रकार, आनुवंशिक रूप से इन विकास समय खिड़कियों के दौरान अनुसूचित जाति से छेड़छाड़, myelination के इन विभिन्न चरणों अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट किया जा सकता है। Lentiviral वैक्टर एक के लिए एक अच्छा उपकरण हैंmyelination nalyzing, वे कम से कम विषाक्तता है खासकर के रूप में है, लेकिन lentiviruses ही नवजात sciatic नसों ^5,6 संक्रमित। इसकी तुलना में, electroporation की मध्यस्थता जीन स्थानांतरण अच्छी तरह से काम करता है जब अभिकर्मक पी 3 (चित्रा 2 ई, ऊपर) पर या P14 पर (चित्रा 2 ई, नीचे) आयोजित किया जाता है।

विवो electroporation विधि में उपन्यास के आवेदन यहाँ वर्णित हैं। चित्रा 3 ए GFP व्यक्त विभिन्न विकास के चरणों (P7, P14, P21 और P31) पर myelinating अनुसूचित जाति के प्रकाश सूक्ष्म छवियों से पता चलता है। प्रकाश सूक्ष्म विश्लेषण करके, इस तरह की लंबाई और व्यास के रूप में रूपात्मक मापदंडों में परिवर्तन, मूल्यांकन किया जा सकता है। ध्यान दें कि इन मानकों को बरकरार चूहे परिधीय नसों ^15,16 की तुलना में समान मूल्यों है, सुझाव है कि electroporated नसों महत्वपूर्ण हानिकारक प्रभाव के बिना विकसित करना। चित्रा 3 बी lacZ-Expre के एक इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म छवि को दर्शाता हैssing अनुसूचित जाति myelinating। इस मामले में, lacZ एक अभिव्यक्ति मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था। β-galactosidase bluo-लड़की, एक इथेनॉल अघुलनशील सब्सट्रेट, का उपयोग कर धुंधला इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ^11,17 द्वारा ट्रांसफ़ेक्ट अनुसूचित जाति के माइलिन संरचना के विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है। इन प्रयोगों में, संकेतन अणुओं की भूमिका मुंह बंद करने या उनकी अभिव्यक्ति को बढ़ाने, जिससे नुकसान के समारोह या लाभ के समारोह के प्रभाव के विश्लेषण की अनुमति देकर जांच की जा सकती है। तय ऊतक के विश्लेषण के अलावा, इन विवो electroporation की मध्यस्थता जीन स्थानांतरण भी इमेजिंग प्रयोगों से जीने के लिए लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चित्रा -3 सी एक myelinating अनुसूचित जाति सह व्यक्त जी GECO1.1 ^18, एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट साइटोसोलिक सीए ^{2 +} सूचक, और आर GECO1mt ^19, एक लाल फ्लोरोसेंट mitochondrial सीए ^{2 +} सूचक पता चलता है। इन संकेतकों व्यक्त करके, हम एक संकेत मार्ग है कि अनुसूचित जाति myelinating में साइटोसोलिक और mitochondrial सीए ² सांद्रता को नियंत्रित करता है पहचान । इस प्रकार, वर्तमान विधि संकेत तंत्र की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, खासकर जब आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट जांच के हित के संकेतों का पता लगाने के लिए उपलब्ध हैं।

आकृति 1
चित्रा 1:। मैं n vivo electroporation विधि पहले, anesthetized चूहे के sciatic तंत्रिका के योजनाबद्ध अवगत कराया है। दूसरा, प्लास्मिड डीएनए sciatic तंत्रिका में इंजेक्ट किया जाता है। तीसरा, बिजली दालों संदंश के आकार इलेक्ट्रोड के माध्यम से इंजेक्शन साइट के लिए दिया जाता है। अंत में, घाव गोंद के साथ बंद कर दिया है। यह प्रक्रिया contralateral तंत्रिका पर दोहराया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2: ट्रांसफ़ेक्ट Sciatic तंत्रिकाओं पर प्रतिनिधि परिणाम (ए) एक ट्रांसफ़ेक्ट sciatic तंत्रिका के एक प्रतिनिधि छवि।। तंत्रिका पी 3 में आरएफपी व्यक्त प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट, और P7 पर तय की गई थी। (बी) P7 पर एक आरएफपी ट्रांसफ़ेक्ट सेल S100, एक अनुसूचित जाति के मार्कर के साथ colocalization दिखाने का एक प्रतिनिधि छवि। (सी) एक P14 पर एक आरएफपी ट्रांसफ़ेक्ट sciatic तंत्रिका MBP, एक myelinating अनुसूचित जाति मार्कर के साथ colocalization दिखाने का प्रतिनिधि छवि। (डी) GFP और आरएफपी व्यक्त plasmids के साथ cotransfected एक sciatic तंत्रिका के एक प्रतिनिधि छवि। ट्रांसफ़ेक्ट अनुसूचित जाति के लिए एक साथ GFP और आरएफपी व्यक्त किया। (ई) पी 3, जब myelination शुरू होता है (ऊपर) पर ट्रांसफ़ेक्ट P31 पर अनुसूचित जाति myelinating की एक छवि है, और P14, जब सबसे बड़ी एक्सोन myelinated (नीचे) बनने पर ट्रांसफ़ेक्ट P31 पर myelinating अनुसूचित जाति की एक छवि है, उस स्ि्न्ंतरर सुझावmyelinating अनुसूचित जाति के ection न केवल नवजात नसों में, लेकिन यह भी अधिक परिपक्व नसों में प्राप्त किया जा सकता है। स्केल सलाखों = 200 माइक्रोन (ए); 50 माइक्रोन (इ)। यह आंकड़ा हमारे पिछले प्रकाशन ¹¹ से संशोधित किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। विवो electroporation (ए) के अनुसूचित जाति myelinating के विकास का एक प्रकाश सूक्ष्म विश्लेषण के आवेदन। Sciatic नसों पी 3 में GFP व्यक्त प्लाज्मिड के साथ electroporated थे, और विभिन्न विकास के चरणों (P7, P14, P21 और P31) पर तय किया गया। GFP पॉजिटिव अनुसूचित जाति की छवियों प्रतिनिधि छोड़ दिया पर दिखाए जाते हैं। औसत लंबाई और व्यास ± SEM के मतलब के रूप में संक्षेप हैं (एन = 30 - सही पर 3 नसों) से 47। लंबाई और विकास के रूप में आय अनुसूचित जाति बढ़ जाती है myelinating के व्यास। (बी) के एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग lacZ साथ ट्रांसफ़ेक्ट एक sciatic तंत्रिका की एक इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म छवि। एक ट्रांसफ़ेक्ट अनुसूचित जाति (सफेद तारांकन, बाएं) पतले β-galactosidase प्रतिक्रिया उत्पाद का अवक्षेप के साथ चिह्नित किया गया। (सी) एक अनुसूचित जाति जी GECO1.1, एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट साइटोसोलिक सीए ^{2 +} सूचक, और आर GECO1mt, एक लाल फ्लोरोसेंट mitochondrial सीए ² सूचक के साथ cotransfected की एक छवि। सफेद बिंदीदार आयतों के भीतर क्षेत्रों सही पर पैनल में बढ़े हुए दिखाया गया है। स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन (ए और सी); 1 माइक्रोन (बी)। यह आंकड़ा हमारे पिछले प्रकाशन ¹¹ से संशोधित किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Genopure Plasmid Maxi Kit	Roche	03 143 422 001	Plasmid DNA purification kit
Fast Green CFC	WAKO	069-00032	Dye for DNA injection
GC 150T-10	HARVARD APPARATUS	30-0062	Glass capillary
Suction tubing	Drummond	05-2000-00	Suction tubing for micro injection
MODEL P-97	SUTTER INSTRUMENT CO.	Micropipette puller
CUY21 Single Cell	BEX	Electroporator CUY21 Single Cell	Pulse generator
Electric warmer	KODEN	CAH-6A	Warmer during the surgery
Isofluolane	Mylan	1119701G1076	Anesthetic