Protocol
Brugen af rotter til forskning var i overensstemmelse med retningslinjer fastsat af Animal Welfare Udvalg University of Tokyo.
1.Preparation af plasmid-DNA
- Generere DNA-plasmider til in vivo elektroporation ved subkloning af cDNA eller shRNA sekvens i et ekspressionsplasmid for mammale celler 12. Brug en cytomegalovirus immediate early enhancer og kylling β-actin-promotor-fusion (CAG) promotor-drevet plasmid 13, fordi det giver en stærk og stabil ekspression. Til ekspression af shRNAs under kontrol af en CAG promotor, brug en mir30-baserede shRNA kassettesystem til subkloning af shRNA 14.
- Oprense plasmid-DNA med en maxi-prep kit ifølge producentens instruktioner, og resuspender DNA'et med HEPES-bufret saltvand (140 mM NaCl, 0,75 mM Na 2 HPO 4, 25 mM HEPES, pH 7,40). Indstille koncentrationen af DNA til ≥4 pg / pl.
2. Sterilisering af kirurgiske instrumenter og Saline
- Autoklave kirurgiske instrumenter og 0,9% NaCl-opløsning.
3. Forberedelse af Glass Mikropipette
- Træk glas pipetter ved hjælp af en pipette aftrækker. Skær spidsen af pipetten til en diameter på 30-50 um. Brug følgende parametre: Varme, 600; Velocity, 50; Time, 75.
4. Animal Surgery, DNA Injection og Elektroporation
Bemærk: En overbetragtning af dette trin er beskrevet i figur 1. Selv om proceduren for rotteunger er beskrevet her, er fremgangsmåden også anvendelig til mere modne dyr ved anvendelse af samme fremgangsmåde.
- Anesthetize rotte med isofluran i induktionen kassen, indtil dyret bliver ubevægelig ved at justere ilt flow til 0,4 l / min og isofluran koncentration til 4% (vol / vol). Udfør tå klemme for at bekræfte korrekt bedøvelse.
- Sæt rotten på den forvarmede varmere under et binokulært mikroskop, og opretholde anæstesi ved løbende administration isofluran gennem ansigtsmaske. Juster ilt flow til 0,2 l / min og isofluran koncentration til 2% (vol / vol). Brug øjendråber at forhindre tørhed i øjne, hvis øjne dyret er åbne.
- Fastgør benene med kirurgisk tape.
- Rens huden på den bageste låret med povidon-iod og lave et snit med en skalpel.
Bemærk: Shave kirurgiske områder, hvis de kirurgiske områder er dækket med hluft. - Eksponere iskiasnerven ved at skabe en åbning mellem quadriceps femoris-musklen og biceps femoris-musklen med synåle.
- Fugt nerven med 0,9% NaCl-opløsning. Absorbere overskydende vand med fnugfri papir.
- Sæt bunden af et glas mikropipette på fleksible rør, og fylde passende mængde DNA-opløsning (mindst en mikroliter) i mikropipetten ved forsigtigt at aspirere.
- Løft den udsatte nerve ved forsigtigt at trække den distale side af nerven ved anvendelse af en nål.
Bemærk: Må ikke anvendes spænding til den frækhed at minimere mekanisk belastning. - Sæt glasmikropipette ind i den distale site på nerven, og injicere DNA-opløsningen ved at påføre tryk (dvs. ved at blæse i den åbne ende af det fleksible rør). Injicere DNA-opløsning, indtil nerven vises grøn (1 pi maksimum). Fordi hyppig indsættelse af mikropipetten kan beskadige nerven, ikke indsætte mikropipette mere end to gange.
- Placer en TWEEzer-typen platinelektrode ca. 1-2 mm fra nerven. Udfylde hullet mellem elektroden og nerven med 0,9% NaCl-opløsning.
Bemærk: Hold ikke nerve med elektroden for at undgå mekanisk belastning på nerven. - Påfør elektriske impulser til injektionsstedet under anvendelse af en elektroporator med elektroden. Efter den første impuls sæt vendes elektroden og anvende en anden puls sæt. Brug følgende parametre: spænding, 50 V; puls varighed, 5 ms; impulsinterval, 100 msek; puls nummer, 4 gange.
- Rengør elektroporering site med 0,9% NaCl-opløsning.
- Gentag trin 4,4-4,11 på den kontralaterale iskiasnerven.
5. Post-elektroporation
- Luk indsnit med cyanoacrylat lim.
- Efter tørring af limen, rense såret med povidon-jod.
- Slip hvalp fra ansigtsmaske. Varm hvalpen på en varmere mindst en time for at tillade den at komme sig helt fra bedøvelsen. Do ikke lade hvalpen uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed.
- Efter inddrivelsen fra anæstesi, returnere hvalpen til moderen rotte. Må ikke returnere hvalpen indtil fuldt tilbagebetalt.
6. Post-kirurgi
- House de rotteunger i buret indtil udførelse af forsøgene 11 (se eksempler i figur 3). Administrere carprofen (5 mg / kg, ip), et ikke-steroidt anti-inflammatorisk lægemiddel, eller buprenorphin (0,1 mg / kg, sc), et opioidanalgetikum, hvis det kræves.
Bemærk: Hvis rotten pup ikke vokser godt eller inflammation observeres omkring operationsstedet, udelukker dyret fra forsøgene.
Representative Results
Et eksempel på en iskiasnerven transficeret med rødt fluorescerende protein (RFP) udtrykkende plasmid er vist i figur 2A. Celler viser bipolar morfologi, en egenskab ved SC'er, blev sparsomt transficeret med RFP. Nr RFP fluorescens blev påvist i axoner. Vi plejer at finde ~ 100 transfekterede SCs i hver nerve. Denne transfektionseffektiviteten synes ligner in vivo SC infektionseffektivitet hjælp lentivirusvektorer 4.
Immunofarvning eksperimenter viste, at de fleste (~ 96%) RFP-positive celler på P7 co-mærket til S100, en SC markør (figur 2B), og 91% af RFP-positive celler ved P14 co-mærket til MBP, en myelinerende SC markør (Figur 2C), hvilket antyder, at genoverførsel ved elektroporering er stærkt selektiv for myelinerende SC'er.
Indførelsen af adskillige gener i SC'er
Hos gnavere myelinering indleder omkring fødslen, dramatisk stigende i løbet af de første to uger efter fødslen, og derefter gradvist aftager. Således ved genetisk manipulation af SCs i disse udviklingsmæssige tidsvinduer, mekanismerne bag disse forskellige stadier af myelinering kan afklares. Lentivirale vektorer er et godt redskab til ennalyzing myelinering, især da de har minimal toksicitet, men lentivira kun inficere neonatal ischiadicus nerver 5,6. Til sammenligning elektroporation genoverførsel fungerer godt, når transfektion udføres på P3 (figur 2E, top) eller på P14 (figur 2E, bottom).
De anvendelser af romanen in vivo elektroporation metode er beskrevet her. Figur 3A viser lys mikroskopiske billeder af GFP-udtrykkende myelinerende SCs på forskellige udviklingsstadier (P7, P14, P21 og P31). Ved lysmikroskopisk analyse, ændringer i morfologiske parametre såsom længde og diameter, kan vurderes. Bemærk, at disse parametre har lignende værdier i forhold til intakt rotte perifere nerver 15,16, hvilket tyder på, at de elektroporerede nerverne udvikler uden væsentlige skadevirkninger. Figur 3B viser et elektronmikroskopisk billede af LacZ-EXPREssing myelinerende SC'er. I dette tilfælde blev LacZ anvendt som udtryk markør. β-galactosidase-farvning under anvendelse af Bluo-gal, en ethanol-uopløselige substrat, muliggør analysen af myelin struktur af transficerede SC'er ved elektronmikroskopi 11,17. I disse eksperimenter kan rolle signalmolekyler undersøges af tavshed eller forstærke deres udtryk, hvorved analysen af tab af funktion eller få af funktion effekter. Ud over analysen af fikseret væv, kan in vivo elektroporation genoverførsel også anvendes til at leve billeddannelse eksperimenter. For eksempel figur 3C viser en myelinerende SC co-udtrykkende G-GECO1.1 18, et grønt fluorescerende cytosolisk Ca2 + indikator, og R-GECO1mt 19, et rødt fluorescerende mitochondrial Ca2 + indikator. Ved at udtrykke disse indikatorer, vi identificeret en signalvejen, der styrer cytosol og mitokondrie Ca 2+ koncentrationen i myelinerende SCs . Således kan den foreliggende fremgangsmåde anvendes til at studere en række signaling mekanismer, især når genetisk indkodede fluorescerende prober er tilgængelige til at detektere signalerne af interesse.
Figur 1:. Skematisk af I N vivo Elektroporation Metode Først iskiasnerven af den bedøvede rotte udsættes. Sekund, plasmid-DNA injiceret i iskiasnerven. Tredje, elektriske impulser leveres til injektionsstedet gennem tang-formede elektrode. Endelig er såret lukkes med lim. Denne procedure kan gentages på den kontralaterale nerve. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative resultater på Transficerede iskiasnerver (A) Et repræsentativt billede af en transficeret iskiasnerven.. Nerven blev transficeret med RFP-udtrykkende plasmid på P3, og fastsat til P7. (B) Et repræsentativt billede af en RFP-transficerede celle ved P7 viser colokalisering med S100, en SC markør. (C) Et repræsentativt billede af en RFP-transficerede iskiasnerven på P14 viser colokalisering med MBP, en myelinerende SC markør. (D) Et repræsentativt billede af en iskiasnerven cotransficeret med GFP og RFP-udtrykkende plasmider. Transfekterede SCs samtidigt udtrykte GFP og RFP. (E) Et billede af myelinerende SC'er på P31 transficerede på P3, når myelinering begynder (top), og et billede af myelinerende SC'er på P31 transficeret ved P14, når de fleste store axoner bliver myelinerede (nederst), hvilket antyder, at transffdeling af myelinerende SC'er kan opnås ikke kun i neonatale nerver, men også i mere modne nerver. Scale barer = 200 um (A); 50 um (BE). Dette tal blev ændret fra vores tidligere publikation 11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Anvendelse af in vivo Elektroporation (A) En let mikroskopisk analyse af udviklingen af myelinerende SCs.. Ischiadicus nerver blev elektroporeret med GFP-udtrykkende plasmid på P3, og blev fastsat på forskellige udviklingsstadier (P7, P14, P21 og P31). Repræsentative billeder af GFP-positive SCs er vist til venstre. Den gennemsnitlige længde og diameter er opsummeret som gennemsnit ± SEM (n = 30-47 fra 3 nerver) til højre. Længde og diameter af myelinerende SCS stiger som udviklings- skrider frem. (B) Et elektronmikroskopisk billede af en iskiasnerven transficeret med et plasmid kodende for LacZ. En transficeret SC (hvid asterisk, venstre) blev fint mærket med præcipitater af den β-galactosidase reaktionsprodukt. (C) Et billede af et SC cotransficeret med G-GECO1.1, et grønt fluorescerende cytosolisk Ca2 + indikator, og R-GECO1mt, et rødt fluorescerende mitochondrial Ca2 + indikator. Regionerne i de hvide stiplede rektangler vises forstørret i panelerne til højre. Scale barer = 50 um (A og C); 1 um (B). Dette tal blev ændret fra vores tidligere publikation 11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 03 143 422 001 | Plasmid DNA purification kit |
| Fast Green CFC | WAKO | 069-00032 | Dye for DNA injection |
| GC 150T-10 | HARVARD APPARATUS | 30-0062 | Glass capillary |
| Suction tubing | Drummond | 05-2000-00 | Suction tubing for micro injection |
| MODEL P-97 | SUTTER INSTRUMENT CO. | Micropipette puller | |
| CUY21 Single Cell | BEX | Electroporator CUY21 Single Cell | Pulse generator |
| Electric warmer | KODEN | CAH-6A | Warmer during the surgery |
| Isofluolane | Mylan | 1119701G1076 | Anesthetic |
References
- Nave, K. A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 503-533 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9, 1956-1968 (2014).
- Cotter, L., et al. Dlg1-PTEN interaction regulates myelin thickness to prevent damaging peripheral nerve overmyelination. Science. 328, 1415-1418 (2010).
- Gonzalez, S., Fernando, R. N., Perrin-Tricaud, C., Tricaud, N. In vivo introduction of transgenes into mouse sciatic nerve cells in situ using viral vectors. Nat Protoc. 9, 1160-1169 (2014).
- Ozcelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30, 4120-4131 (2010).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Glatzel, M., et al. Adenoviral and adeno-associated viral transfer of genes to the peripheral nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 442-447 (2000).
- Homs, J., et al. Schwann cell targeting via intrasciatic injection of AAV8 as gene therapy strategy for peripheral nerve regeneration. Gene Ther. 18, 622-630 (2011).
- Aspalter, M., et al. Modification of Schwann cell gene expression by electroporation in vivo. J Neurosci Methods. 176, 96-103 (2009).
- Ino, D., et al. Neuronal Regulation of Schwann Cell Mitochondrial Ca(2+) Signaling during Myelination. Cell Rep. 12, 1951-1959 (2015).
- Struhl, K. Chapter 3; Subcloning of DNA fragments. Curr Protoc Mol Biol. , Unit3 16 (2001).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Chang, K., Elledge, S. J., Hannon, G. J. Lessons from Nature: microRNA-based shRNA libraries. Nat Methods. 3, 707-714 (2006).
- Schlaepfer, W. W., Myers, F. K. Relationship of myelin internode elongation and growth in the rat sural nerve. J Comp Neurol. 147, 255-266 (1973).
- Webster, H. D. The geometry of peripheral myelin sheaths during their formation and growth in rat sciatic nerves. J Cell Biol. 48, 348-367 (1971).
- Weis, J., Fine, S. M., David, C., Savarirayan, S., Sanes, J. R. Integration site-dependent expression of a transgene reveals specialized features of cells associated with neuromuscular junctions. J Cell Biol. 113, 1385-1397 (1991).
- Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators. Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).
- Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50, 507-511 (2008).
- Taveggia, C., Feltri, M. L., Wrabetz, L. Signals to promote myelin formation and repair. Nat Rev Neurol. 6, 276-287 (2010).
- Saijilafu,, Hur, E. M., Zhou, F. Q. Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat Commun. 2, 543 (2011).
- Tanaka, Y., Hirokawa, N.
