Protocol
L'uso di topi per la ricerca era in conformità con le linee guida stabilite dal Comitato di benessere degli animali l'Università di Tokyo.
1.Preparazione di plasmidi DNA
- Generare plasmidi DNA per elettroporazione in vivo subcloning cDNA o la sequenza shRNA in un plasmide di espressione per cellule di mammifero 12. Utilizzare un citomegalovirus immediato primi enhancer e pollo β-actina promotore di fusione (CAG) promotore-driven plasmide 13 perché permette l'espressione forte e stabile. Per espressione shRNAs sotto il controllo di un promotore CAG, utilizzare un sistema a cassette shRNA mir30-based per la subcloning shRNA 14.
- Purificare il DNA plasmide con un kit di maxi-prep secondo le istruzioni del fabbricante, e risospendere il DNA con soluzione salina HEPES-buffered (140 mM NaCl, 0,75 mm Na 2 HPO 4, 25 mM HEPES, pH 7,40). Regolare la concentrazione del DNA per ≥4 mg / mL.
2. sterilizzazione degli strumenti chirurgici e Saline
- strumenti chirurgici autoclave e la soluzione di NaCl allo 0,9%.
3. Preparazione della micropipetta di vetro
- Tirare pipette di vetro con un estrattore pipetta. Tagliare la punta della pipetta ad un diametro di 30-50 micron. Utilizzare i seguenti parametri: Calore, 600; Velocity, 50; Ora, 75.
4. Chirurgia Animale, iniezione del DNA ed elettroporazione
Nota: Un overvista di questa fase è descritta in Figura 1. Sebbene la procedura di cuccioli di ratto sono descritti qui, il metodo è applicabile anche ad animali più maturi utilizzando la stessa procedura.
- Anestetizzare ratto con isoflurano nella casella di induzione finché l'animale diventa immobile regolando il flusso di ossigeno al 0,4 L / min e la concentrazione isoflurano al 4% (vol / vol). Eseguire punta pizzicare per confermare il corretto anestesia.
- Mettere il topo sul caldo caldo sotto un microscopio binoculare, e mantenere l'anestesia con la somministrazione continua isoflurano attraverso la maschera. Regolare il flusso di ossigeno al 0,2 L / min e la concentrazione isoflurano al 2% (vol / vol). Utilizzare collirio per prevenire la secchezza degli occhi se gli occhi dell'animale sono aperte.
- Fissare le gambe con nastro chirurgico.
- Pulire la pelle sulla coscia posteriore con iodopovidone, e fare un'incisione con un bisturi.
Nota: Rasatura aree chirurgiche se le aree chirurgiche sono coperte con haria. - Esporre il nervo sciatico, creando un varco tra le muscolo quadricipite femorale e del muscolo bicipite femorale con aghi da cucito.
- Bagnare il nervo con 0,9% soluzione di NaCl. Assorbire l'acqua in eccesso con carta privo di lanugine.
- Inserire la base di una micropipetta di vetro sulla tubazione flessibile, e riempire la quantità adeguata di soluzione di DNA (almeno un microlitro) nella micropipetta aspirando delicatamente.
- Sollevare il nervo scoperto tirando delicatamente la parte distale del nervo utilizzando un ago.
Nota: Non applicare tensione al nervo per minimizzare lo stress meccanico. - Inserire la micropipetta di vetro nel sito distale sul nervo, ed iniettare la soluzione di DNA dalla pressione applicando (cioè soffiando nell'estremità aperta del tubo flessibile). Iniettare soluzione di DNA fino a quando il nervo appare verde (massimo 1 ml). A causa frequente inserimento del micropipetta può danneggiare il nervo, non inserire la micropipetta più di due volte.
- Posizionare un tweEzer-tipo di platino elettrodo circa 1-2 mm di distanza dal nervo. Colmare il divario tra l'elettrodo e il nervo con 0,9% soluzione di NaCl.
Nota: Non tenere il nervo con l'elettrodo per evitare sollecitazioni meccaniche sul nervo. - Applicare impulsi elettrici al sito di iniezione utilizzando un elettroporatore con l'elettrodo. Dopo il primo set impulso, invertire l'elettrodo e applicare un altro set di impulso. Utilizzare i seguenti parametri: tensione, 50 V; durata dell'impulso, 5 msec; Intervallo di impulso, 100 msec; numero di impulsi, 4 volte.
- Pulire il sito di elettroporazione con il 0,9% soluzione di NaCl.
- Ripetere i passaggi 4,4-4,11 sul nervo sciatico controlaterale.
5. Post-elettroporazione
- Chiudere le incisioni con la colla cianoacrilato.
- Dopo l'essiccazione della colla, pulire la ferita con povidone-iodio.
- Rilasciare il cucciolo dalla maschera facciale. Riscaldare il cucciolo su un riscaldatore per almeno un'ora in modo da consentire di recuperare completamente dall'anestesia. Do non lasciare il cucciolo incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente.
- Dopo il recupero dall'anestesia, restituire il cucciolo di ratto madre. Non restituire il cucciolo fino alla completa guarigione.
6. post-intervento chirurgico
- Casa i cuccioli di ratto in gabbia fino a condurre gli esperimenti 11 (si vedano gli esempi in figura 3). Somministrare carprofen (5 mg / kg, ip), un farmaco non steroideo anti-infiammatori, o buprenorfina (0,1 mg / kg, sc), un analgesico oppioide, se necessario.
Nota: se il cucciolo di ratto non cresce bene o infiammazione si osserva attorno al sito chirurgico, escludere l'animale dagli esperimenti.
Representative Results
Un esempio di un nervo sciatico transfettate con la proteina fluorescente rossa (RFP) esprimente il plasmide è mostrato in Figura 2A. Le cellule che mostrano la morfologia bipolare, una caratteristica della SCS, sono stati scarsamente trasfettate con RFP. No RFP fluorescenza è stato rilevato negli assoni. Noi di solito troviamo ~ 100 SC trasfettate in ogni nervo. Questa efficienza trasfezione sembra simile alla SC efficienza in vivo infezione utilizzando vettori lentivirali 4.
Esperimenti immunostaining hanno dimostrato che la maggior parte (~ 96%) cellule RFP-positive a P7 co-marcato per S100, un marcatore SC (Figura 2B) e 91% di cellule RFP-positive a P14 co-marcato per MBP, un marcatore myelinating SC (Figura 2C), suggerendo che il trasferimento genico mediante elettroporazione è altamente selettivo per mielinizzanti SC.
L'introduzione di geni multipli in SC
Nei roditori, mielinizzazione inizia intorno nascita, aumentando notevolmente durante le prime due settimane dopo la nascita, e quindi diminuisce gradualmente. Così, manipolando geneticamente SC durante queste finestre temporali di sviluppo, i meccanismi alla base di queste diverse fasi di mielinizzazione possono essere chiarite. vettori lentivirali sono un ottimo strumento per unnalyzing mielinizzazione, in particolare per quanto hanno tossicità minima, ma lentivirus di infettare solo neonatale nervi sciatico 5,6. In confronto, il trasferimento genico elettroporazione mediata funziona bene quando trasfezione viene condotta su P3 (figura 2E, in alto) o P14 (Figura 2E, bottom).
Le applicazioni del romanzo nel metodo di elettroporazione in vivo sono descritte qui. La figura 3A mostra le immagini microscopiche luce di GFP che esprimono SC mielinizzanti a vari stadi di sviluppo (P7, P14, P21 e P31). Con analisi al microscopio ottico, alterazioni dei parametri morfologici, come la lunghezza e il diametro, possono essere valutate. Si noti che questi parametri hanno valori simili rispetto al intatto ratto nervi periferici 15,16, il che suggerisce che i nervi elettroporate si sviluppano senza rilevanti conseguenze dannose. La figura 3B mostra un elettrone un'immagine microscopica della LacZ-espresssing mielinizzanti SC. In questo caso, LacZ è stato utilizzato come indicatore di espressione. β-galattosidasi colorazione utilizzando bluO-gal, un substrato di etanolo insolubile, consente l'analisi della struttura della mielina del SC trasfettate al microscopio elettronico 11,17. In questi esperimenti, il ruolo delle molecole di segnalazione può essere esaminato da tacere o aumentando la loro espressione, consentendo in tal modo l'analisi di perdita-di-funzione o il guadagno-di-funzione effetti. Oltre all'analisi di tessuto fissato, in vivo trasferimento genico elettroporazione mediata può essere applicato anche a vivere esperimenti di imaging. Ad esempio, la Figura 3C mostra una myelinating SC co-esprimono G-GECO1.1 18, un indicatore verde fluorescente citosolico Ca 2+, e R-GECO1mt 19, un indicatore rosso fluorescente mitocondriale Ca 2+. Esprimendo questi indicatori, abbiamo identificato un percorso di segnalazione che controlla citosoliche e mitocondriali Ca 2+ concentrazioni in mielinizzanti SC . Pertanto, il presente metodo può essere usato per studiare una varietà di meccanismi di segnalazione, in particolare quando le sonde fluorescenti geneticamente codificati sono disponibili per rilevare i segnali di interesse.
Figura 1:. Schematica della i n elettroporazione in vivo Metodo Innanzitutto, il nervo sciatico del ratto anestetizzato è esposto. In secondo luogo, il plasmide DNA viene iniettato nel nervo sciatico. In terzo luogo, gli impulsi elettrici vengono consegnati al sito di iniezione attraverso l'elettrodo a forma di pinza. Infine, la ferita viene chiusa con colla. Questa procedura può essere ripetuta sul nervo controlaterale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risultati Rappresentante sui nervi sciatico trasfettate (A) Una immagine rappresentativa di un nervo sciatico transfettate.. Il nervo è stato transfettate con plasmide RFP che esprimono al P3, e fissato a P7. (B) Una immagine rappresentativa di una cellula RFP-transfettate a P7 mostrando colocalizzazione con S100, un marker SC. (C) Una immagine rappresentativa di un nervo sciatico RFP-trasfettate a P14 che mostra colocalizzazione con MBP, un marker myelinating SC. (D) Una immagine rappresentativa di un nervo sciatico cotransfected con GFP e RFP plasmidi che esprimono. SC trasfettate espresso contemporaneamente GFP e RFP. (E) Un'immagine di mielinizzanti SC a P31 trasfettate al P3, quando inizia la mielinizzazione (in alto), e un'immagine della SCS mielinizzanti a P31 transfettate a P14, quando la maggior parte di grandi assoni diventano mielinato (in basso), suggerendo che trasfezione di SC mielinizzanti può essere raggiunto non solo nei nervi neonatale, ma anche nei nervi più maturi. Barre di scala = 200 micron (A); 50 micron (BE). Questa cifra è stata modificata dalla nostra precedente pubblicazione 11. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Applicazione di elettroporazione in vivo (A) L'analisi al microscopio luce dello sviluppo di mielinizzanti SC.. nervo sciatico sono stati elettroporate con plasmide GFP che esprimono al P3, e sono stati fissati a vari stadi di sviluppo (P7, P14, P21 e P31). Immagini rappresentative della SC GFP-positive sono mostrati sulla sinistra. La lunghezza media e diametro sono riassunti come media ± SEM (n = 30-47 da 3 nervi) sulla destra. La lunghezza e il diametro mielinizzanti SCs aumenta al procedere dello sviluppo. (B) Un elettrone immagine al microscopio di un nervo sciatico trasfettate con un plasmide codificante LacZ. A transfettate SC (asterisco bianco, sinistra) è stato finemente etichettato con precipitati del prodotto di reazione β-galattosidasi. (C) L'immagine di una SC cotransfected con G-GECO1.1, un indicatore verde fluorescente citosolico Ca 2+, e R-GECO1mt, un indicatore rosso fluorescente mitocondriale Ca 2+. Le regioni all'interno dei bianchi rettangoli tratteggiate sono mostrati ampliata nei pannelli a destra. Barre di scala = 50 micron (A e C); 1 micron (B). Questa cifra è stata modificata dalla nostra precedente pubblicazione 11. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 03 143 422 001 | Plasmid DNA purification kit |
| Fast Green CFC | WAKO | 069-00032 | Dye for DNA injection |
| GC 150T-10 | HARVARD APPARATUS | 30-0062 | Glass capillary |
| Suction tubing | Drummond | 05-2000-00 | Suction tubing for micro injection |
| MODEL P-97 | SUTTER INSTRUMENT CO. | Micropipette puller | |
| CUY21 Single Cell | BEX | Electroporator CUY21 Single Cell | Pulse generator |
| Electric warmer | KODEN | CAH-6A | Warmer during the surgery |
| Isofluolane | Mylan | 1119701G1076 | Anesthetic |
References
- Nave, K. A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 503-533 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9, 1956-1968 (2014).
- Cotter, L., et al. Dlg1-PTEN interaction regulates myelin thickness to prevent damaging peripheral nerve overmyelination. Science. 328, 1415-1418 (2010).
- Gonzalez, S., Fernando, R. N., Perrin-Tricaud, C., Tricaud, N. In vivo introduction of transgenes into mouse sciatic nerve cells in situ using viral vectors. Nat Protoc. 9, 1160-1169 (2014).
- Ozcelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30, 4120-4131 (2010).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Glatzel, M., et al. Adenoviral and adeno-associated viral transfer of genes to the peripheral nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 442-447 (2000).
- Homs, J., et al. Schwann cell targeting via intrasciatic injection of AAV8 as gene therapy strategy for peripheral nerve regeneration. Gene Ther. 18, 622-630 (2011).
- Aspalter, M., et al. Modification of Schwann cell gene expression by electroporation in vivo. J Neurosci Methods. 176, 96-103 (2009).
- Ino, D., et al. Neuronal Regulation of Schwann Cell Mitochondrial Ca(2+) Signaling during Myelination. Cell Rep. 12, 1951-1959 (2015).
- Struhl, K. Chapter 3; Subcloning of DNA fragments. Curr Protoc Mol Biol. , Unit3 16 (2001).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Chang, K., Elledge, S. J., Hannon, G. J. Lessons from Nature: microRNA-based shRNA libraries. Nat Methods. 3, 707-714 (2006).
- Schlaepfer, W. W., Myers, F. K. Relationship of myelin internode elongation and growth in the rat sural nerve. J Comp Neurol. 147, 255-266 (1973).
- Webster, H. D. The geometry of peripheral myelin sheaths during their formation and growth in rat sciatic nerves. J Cell Biol. 48, 348-367 (1971).
- Weis, J., Fine, S. M., David, C., Savarirayan, S., Sanes, J. R. Integration site-dependent expression of a transgene reveals specialized features of cells associated with neuromuscular junctions. J Cell Biol. 113, 1385-1397 (1991).
- Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators. Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).
- Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50, 507-511 (2008).
- Taveggia, C., Feltri, M. L., Wrabetz, L. Signals to promote myelin formation and repair. Nat Rev Neurol. 6, 276-287 (2010).
- Saijilafu,, Hur, E. M., Zhou, F. Q. Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat Commun. 2, 543 (2011).
- Tanaka, Y., Hirokawa, N.
